Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Bu nanotüp çekme metodolojisinin genel amacı, ilgilenilen spesifik proteinler ile oldukça kavisli zarlar arasındaki etkileşimleri kantitatif olarak incelemektir. Bu yöntem, endositoz ve hücre içi kaçakçılık gibi hücre zarlarının biyolojisindeki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, proteinlerin kavisli zarlara nasıl bağlandığını ve bunları karşılıklı olarak nasıl deforme ettiğini doğrudan ölçmemize izin verir.

Başlangıçta, bu yöntem lipit zarlarının temel mekanik özelliklerini ölçmek için kullanıldı. Son zamanlarda, protein zarı etkileşimlerindeki, özellikle protein şekillendiren zarlardaki önemli mekanizmaları aydınlatmak için uygulanmaktadır. Dev unilamellar vezikülleri doğrudan elektroformasyon odasının platin tellerinden toplayarak başlayın.

Deney odasını inşa etmek için, metalik bir taban üzerine bir milimetre aralıklarla iki dikdörtgen cam kapak kayışı yerleştirin ve uzun kenarlar boyunca bir cam mikropipet ucunun en azından odanın merkezine ulaşmasına izin verecek kadar büyük açıklıklar bırakın. Hem deney odasını hem de bir cam mikropipeti, kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde mililitre başına beş miligram yüksek saflıkta bir beta-kazein çözeltisi ile doldurun. Hazne pasifleştirilirken, objektifin üzerinde ortalanmış bir ışık mikroskobuna monte edin ve aspirasyon mikropipetinin ucunu, uç objektifin üzerine gelene kadar uzun kenar boyunca açıklıktan geçirin.

Su deposu seviyesini, aspirasyon basıncı sıfıra yakın olacak şekilde ayarlayın ve bir enjeksiyon mikropipetini uygun deneysel konsantrasyonda deneysel tampon içinde çözülmüş ilgili molekülle doldurun. Enjeksiyon mikropipetini bir mikromanipülatörün içine monte edin ve mikropipeti deney odasının diğer tarafından geçirin. İnkübasyonun sonunda, beta-kazein çözeltisini hazneden çıkarın ve hazneyi deneysel tampon ile birkaç kez durulayın.

Daha sonra, hazneye birkaç mikrolitre vezikül çözeltisi ekleyin, ardından birkaç mikrolitre streptavidin kaplı boncuk ekleyin, hacim başına negatif% 3 boncuk oranına veya daha azına 0.1 kez 10 ila 0.1 kez nihai konsantrasyona getirin. Veziküller ve boncuklar haznenin dibine yerleştikten sonra, deney tamponunun yaklaşık 15 dakika buharlaşmasına izin verin, bu noktada veziküller bir ışık mikroskobu altında gözle görülür şekilde dalgalanmalıdır. Veziküller uygun şekilde sarkık olduğunda, pipet içindeki zarların uzunlukları pipet yarıçapına eşit veya daha büyük olana kadar tek tek vezikülleri mikropipete aspire edin.

Uygun boyutta bir aspirasyon dili tanımlandığında, haznenin açık kenarlarını mineral yağ ile kapatın. Aspirasyon basıncının sıfır konumunu ayarlamak için, aspirasyon pipetinin ucunu bir boncuğun yanına yerleştirin ve su tankının yüksekliğini, boncuğun pipet tarafından emilmemesi veya üflenmemesi için ayarlayın. Suyun yüksekliğinin ayarlanması, mikropipet tarafından aspire edilen vezikülün zar gerilimini kontrol etmek için kritik öneme sahiptir.

Bir vezikül aspire edin ve mikropipeti kırmadan yukarı ve odak dışına taşıyın. Optik cımbız kullanarak, haznenin dibinden yaklaşık 20 mikrometre uzakta bir boncuk yakalayın. Vezikülü boncuktan uzağa ve optik tuzakla hizalayarak tekrar odağa getirin ve denge konumunu ölçmek için boncuğun hareketini bir ila iki dakika boyunca kaydedin.

Membran gerginliğini azaltmak için vezikülü kaybetmeden mikropipet içindeki basıncı mümkün olduğunca azaltın ve streptavidin-biotin bağlarını oluşturmak için vezikülü boncukla yaklaşık bir saniye dikkatlice temas ettirin. Ardından, bir piezo aktüatör kullanarak, bir nanotüp oluşturmak için vezikülü yavaşça geri çekin. Aspirasyon dilini yeniden oluşturmak için aspirasyon basıncını artırın ve tüpü aspirasyon pipetinin ekseni içinde hizalayın.

Tüpü ve vezikülü tamamen odak noktasına getirin ve boncuğun hareketini 30 hertz'lik bir çekim hızında ve su tankının sıfır konumuna göre yüksekliğini parlak alan mikroskobu altında birkaç dakika boyunca kaydedin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, boncuğun hareketini farklı aspirasyon basınçlarında ve membran gerilimlerinde tekrar kaydedin. İlgilenilen proteinleri veya molekülleri enjekte etmek için, optik tuzaktaki boncuğun bozulmamasına dikkat ederek enjeksiyon mikropipetini nanotüpün yanına getirin ve proteinleri bir ila iki paskal basınçla nazikçe enjekte edin.

Protein bağlanması dengelendikten sonra, çıplak zar için gösterildiği gibi, eklenen proteinlerin varlığında kademeli ölçümleri tekrarlayın. % 100 DOPC veziküllerinden çekilen nanotüpler üzerindeki kuvvet ve yarıçap ölçümleri bağımsızdır, çünkü kuvvet, optik tuzaktaki boncuğun yer değiştirmesinden ve floresan yoğunluğundan yarıçaptan ölçülür ve membran bükülme sertliğini hesaplamanın iki yolunu sağlar. BAR veya potasyum kanal proteinlerinin zar tüpleri üzerindeki alttaki veziküller üzerindeki nispi zenginleşmesi, proteinlerin kavisli zarlara bağlanma olasılığının daha yüksek olduğunu gösterir.

Gerçekten de, N-BAR proteini endofilin A2'nin zara bağlanması, tüp kuvvetini kademeli olarak sıfıra indirir ve bu da tüpü stabil tutan üç boyutlu bir iskele oluşumunu gösterir. Bu prosedürü takiben, örneğin membran tüpleri üzerindeki protein organizasyonunu tespit etmek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi veya protein hareketliliğini ölçmek için tek parçacık izleme gibi ek soruları yanıtlamak için diğer teknikler birleştirilebilir.