Name: Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Öğrenin, dev unilamellar veziküllerden çekilen membran nanotüpleri kullanarak kavisli membranlarla protein etkileşimlerini nicel olarak nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem endositoz ve hücre içi taşıma mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur ve Gil Toombes önemli katkılarından dolayı nanotüp yöntemi grupta kurmak için teşekkür ederiz. P.B. grup CNRS Konsorsiyumu CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) ve Paris Bilimler ait et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai EMBO uzun süreli arkadaş grubu (ALTF 1527-2014) ve Marie Curie eylemleri (H2020-MSCA-Eğer-2014, proje membran-ezrin-aktin) tarafından finanse edildi. M.S. Simons arkadaşlarının toplum Junior biri.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Tüpler GUVs çekme yöntemi yalnızca membran temel mekanik özelliği ölçmenin anlamına gelir değil ama protein ve membran arasında bağlantı ışık tutacak yardımcı olur gibi membran protein sistemi hakkında zengin bilgi verir eğriliği. Giriş bölümünde açıklandığı gibi alt mikron lipozomlar yüzey düzgünleştirilecek18,19 ' a hayvan zinciri ile proteinler kuluçka veya gözlemleyerek proteinler membran eğme, etkilerini ölçmek için başka teknikler var micropipette-Aspire GU...

Kaçakçılığı, endositoz, filopodia, enfeksiyon, vb, oluşumu gibi birçok hücresel süreçler hücre zarları1,2şeklinde dramatik bir değişim eşlik eder. Hücre içinde bir dizi proteinler membran için bağlama ve onların şekil değiştirerek bu işlemlerde katılmak. Özünde etki alanı3,4,5,6,7BAR kavisli bir özellik içeren depo gözü/Amphiphysin/Rvs (BAR) protein ailesi üyeleri en önemli örneklerdir. Tipik olarak, onlar BAR etki alanı yüzeye ve birçok durumda, aynı zamanda derin bilayer amfipatik sarmal ekleme kalarak tarafından membran ile etkileşim. Şekli, boyutu ve şarj amfipatik sarmal sayısı ile birlikte BAR etki alanının belirler: (1) membran eğriliği yönünü (Yani, invaginations ya da çıkıntılar neden) ve (2) membran büyüklüğü eğrilik5,8. Belirtmek gerekirse burada dışbükey tarafı eğri membran, Yani, çıkıntı etkileşen parçacık doğru ve negatif olarak aksi takdirde olumlu eğriliği tanımlanır. Ayrıca, membran üzerindeki etkileri fiziksel parametreleri bir dizi bağlıdır protein BAR nicel çalışmalar ortaya: yüzey proteinleri, membran gerginlik ve membran şekli (düz karşı borulu karşı küresel yoğunluğu şekil)7. Bu parametreler protein BAR bağlı olabilir: (1) hareket sensörleri membran kavisi, (2) membranlar viraj veya (3) neden membran scission7.
Bileşenleri membran hücre, endositoz gibi olayları niceliksel yönlerini eğitim yeniden şekillendirilmesi olarak yer sayısının çokluğu nedeniyle vivo içinde son derece zordur. Vitro sulandırma eğri membranlar hücrenin taklit eden en az bileşenlerinin nasıl membran eğri proteinlerin faaliyet mekanik bir anlayış kazanmak için sağlar. Bu makalede membran nanotüp vitro Embriyolardan, confocal mikroskobu ve optik cımbız kullanarak yeniden oluşturmak için bir iletişim kuralı. Yaklaşım, proteinler, lipidler veya küçük moleküller eğri membranlar ile etkileşimini nicel bir şekilde çalışmak için kullanılabilir. Lipid GUVs olan eğrilik etkileşen moleküllerin membran eğri boyuta göre önemsiz bir hücre membran modelleri olarak kullanılır. Onlar hangi veziküller lipid film nemlendirici ve GUVs bir alternatif akım (AC)10altında şişlik tarafından kurulan electroformation yöntemi9 kullanılarak hazırlanır. En yaygın yüzeyler üzerinde GUVs yetiştirilen indiyum kalay oksit (ITO) ile kaplı ya da yarı iletken tabaklara veya Platin (Pt-telleri)11teller. Bu yöntem tuzları arabellek12huzurunda GUVs yapımında alternatif daha iyi çalışması için gösterildiği gibi Bu eser, GUVs Pt-telleri üzerinde yetiştirilmektedir. Electroformation Protokolü burada onu çoğaltmak yeterince ayrıntılı bir biçimde anlatılan rağmen biz okuyucu içinde ayrıntı13,14' GUVs yapma ve diğer benzer yöntemleri tarif edilmiştir önceki makalelerine bakın. Bizim ellerde electroformation Pt-telleri üzerinde başarıyla GUVs sentetik yağlar karışımı veya doğal lipid ~ 100 mM NaCl içeren bir arabellek özler vermiştir. Ayrıca, büyüme sırasında proteinler GUVs içinde kapsüllemek mümkündü. Bir örnek electroformation odası şekil 1A' gösterilir; iki ~ 10 cm uzunluğunda Pt-tel her iki cam coverslips ile mühürlenmiş politetrafloroetilin (PTFE) yapılmış bir tutucu eklenen oluşur ~ 1-2 cm arayla (şekil 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel Kur. (A) Şef electroformation odası ile elektrik konektörleri Pt-telleri için bağlı. (B) sol: mikroskop gösterilen deneysel sistem objektif ve iki MİKROPİPETLER (sol ve sağ) yukarıda deneysel odası için micromanipulators bağlı ve tüp çekerek ve protein için deneysel odasına eklenmiş enjeksiyon. Sağ: deneysel odası yakından görmek aspirasyon ve eklenen enjeksiyon MİKROPİPETLER gösterilen amaç monte. (C) A tenkıye arka tarafında bir micropipette takılan ince bir dağıtıcı ile donatılmıştır. Alt micropipette özetleyen mavi noktalı çizgi ile micropipette içinde dağıtıcı yakın çekim görülmektedir. Bu sistem micropipette kazein cam yüzey passivate ve mineral gerektiğinde yağ ile doldurun yedeklenmeyeceğini doldurmak için kullanılır. (D) A sistem protein çözüm miktarlarda µL Aspire eskiden. İğne bir şırınga ve iğne micropipette bağlı boru bağlıdır. Micropipette ipucu dikkatle protein çözüm içine dalmış ve çok micropipette ipucu doldurmak için Aspire. Micropipette sonra geri mineral panel C. gösterilen sistem kullanarak yağ ile dolu <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
RADIUS 7 arasında değişen membran Nanotüpün nm için birkaç yüz nm, bir şef bir dış kuvvet tarafından çıkardı. Bu yöntem ilk hücre zarlarında ve veziküller, bükme sertlik15,16gibi elastik özelliklerini ölçmek için tasarlanmıştır. En son eserlerinde yöntemi proteinler çekti nanotüp7,17yakınındaki microinjecting tarafından proteinler arasındaki etkileşimin eğri membranlar ile çalışmaya uzatıldı. Diğer yöntemlerle proteinler membran eğri eğitimi için geliştirilmiştir. Bir yöntem, proteinler farklı ölçekli lipozomlar passivated yüzeye hayvan zinciri ile inkübe. Confocal mikroskobu protein bağlayıcı eğriliği kaynaklı sıralama18,19belirtebilirsiniz lipozom çapı bir fonksiyonu olarak ölçmek için kullanılır. Başka bir yöntem, protein kendiliğinden tübüllerin20,21ikna etmek için yeteneklerini ölçmek için bir mikro-Aspire Şef enjekte edilir. Bu protokol için açıklanan yöntemi nerede çoğu proteinler genellikle ön şekillendirilmesi membran nanotüpler kargo içeren membran invagination ile bağlanma karşılaşma membran eğri proteinler endositoz içinde yer alan eğitim için benzersiz olarak uygundur temel düz plazma zarı. Ayrıca, Bu yöntemde farklı olarak tahlil ile gergin küçük lipozomlar, membran nanotüp sürekli membran için bağlı; Bu nedenle, Şef, beklenen durum içinde vivoile mekanik denge bulunmaktadır. Bu nedenle, temel membran fizik uygular ve mekanik özellikleri bir bolluk bizim ölçümleri22,23,24algılayın.
Bu yöntem tam uygulanması için gerekli ekipman confocal mikroskop, optik cımbız ve su deposu (şekil 1B) bağlı bir veya iki MİKROPİPETLER içerir. Üçü bir araya getirerek, aynı anda ölçmek membran gerginlik, membran eğriliği, proteinlerin yüzey yoğunluğu ve kuvvet25tüp mümkündür. Micropipette aspirasyon esastır ve kolayca içine aspirasyon basınç26hidrostatik basınç kontrol eden bir su deposu için bağlı bir tutucu bir cam micropipette ekleyerek oluşturulur. Micropipette ve tutucu bir micromanipulator tarafından ve ideal olarak, bir yönde bir piezo-aktüatör hassas hareket için tarafından kontrol edilir. Nanotüpün çekeceğim, Şef microaspirated kısa bir süre uzakta Nanotüpün oluşturma sonra çekti bir mikron büyüklüğünde boncuk için sıkıştı. Bu uygulama, boncuk bir yayımlanmış protokolü27takip ederek inşa optik cımbız tarafından düzenlenmektedir. Bu doğru kuvvet ölçümleri rağmen pahasına optik cımbız ve çekme nanotüpler farklı şekillerde dağıtmak mümkündür. Bir optik tuzak kurmak çok zor olması veya kuvvet ölçümleri bir sadece proteinler tercih için eğri membranlar, kontrol istiyorsa gerekli değil, gibi bir tüp ikinci bir micropipette28ucunda Aspire bir boncuk kullanarak çekilebilir. Yerçekimi kuvveti29 kullanarak tüpler çekme veya30,31akışı mümkündür. Ayrıca, confocal mikroskobu da önemli değil; Ancak, bu yüzden proteinler yüzey yoğunluğunu ölçmek için tercih edilir. Ayrıca nanotüp RADIUS floresan yoğunluğu lipidler tüp, böylece bağımsız olarak membran kuvvet ve gerginlik üzerinden ölçüm sağlar. Bu miktarları arasındaki ilişkiyi proteinler membran yapıştırılır25varlığı nedeniyle köklü denklemleri sapma üzerinden Floresan Tüp RADIUS çıkarım özellikle önemlidir. Tüp eğriliği ölçmek mümkün olmayacak gibi önemlisi, bir optik tuzak ve confocal mikroskobu dağıtmak değil.
Bu protokol için açıklanan yöntemi eğrilik kaynaklı çeşitli periferik membran proteinlerinin nanotüpler, çoğunlukla bu BAR aile25,32,33,34 üzerinde sıralanması eğitim için kullanılan . Bu aynı zamanda KvAP üzerinde zenginleştirilmiş conically şekilli transmembran potasyum kanal proteinler35gibi BAR aynı şekilde nanotüpler kavisli gösterilmiştir. Proteinler GUVs içinde kapsüllemek için yöntemini optimize ederek, proteinler arasındaki etkileşimin negatif eğriliği ile son zamanlarda iyi36araştırmış. Ayrıca, bu yöntem protein iskele25,37 oluşumu aydınlatmak için ve her iki satır gerginlik38, protein dynamin39, veya BAR membran scission mekanizması çalışmaya kullanılmıştır proteinler40,41. Ek olarak proteinler, küçük moleküllerin veya iyonların eğriliği de tetikleyebilir. Bu yöntemi kullanarak, kalsiyum iyonları pozitif eğriliği tuzsuz koşulları42altında ikna etmek için gösterilmiştir. İlginçtir, aynı zamanda lipidler bir demixing noktası43,44olan sadece besteleri rağmen için sıralama, eğrilik geçirmek için gösterilmiştir. Toplum olarak, yöntem araştırmacılar nasıl ya integral membran bileşenler (örneğin, lipitler veya transmembran proteinler) soruşturma baktılar tarafından kullanılabilir veya periferik molekülleri bağlama (ya içinde veya dışında GUVs) ile etkileşim cylindrically eğri membranlar, mekanik ve nicel Puan bakış. Ayrıca22,23,45membran kendisi mekanik özelliklerini ölçme ilgilenenler için amaçlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfatidilkolin (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Şekil 3 için verilerde kullanılan örnek lipid</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[biyotinil(polietilenglikol)-2000] [DSPE-PEG (2000) -biotin]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>biyotinile lipid</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-seramid</td><td>Moleküler Problar (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>floresan lipid</td></tr><tr><td>BODIPY-FLC5-hekzadekanoil fosfatidilkolin (HPC *)</td> <td>Moleküler Problar (ThermoFisher)</td><td></td> <td>protein yoğunluğu kalibrasyonu için floresan lipid</td></tr><tr><td>yumurta L-&alfa;-fosfatidilkolin (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td> sığır sütünden tüp <td>yarıçapı sabiti</td></tr> <tr><td>ve beta;-kazein (% >99)</td> kalibre etmek için kullanılır <td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>mikropipeti pasifleştirmek için kullanılır ve deney odası</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D (+) glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>ozmometre</td><td>Kaybeden</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>Pt-telleri, 0,5 mm çap, %99,99 saf</td><td>Goodfellow ABD</td><td>PT005139</td><td>GUV elektroformasyon</td></tr><tr><td>fonksiyon üreteci</td><td></td><td>için kullanılır n/a</td><td>GUV elektroformasyon</td></tr><tr><td>macun dolgu macunu</td><td>Vitrex (CML Fransa'dan)</td> için akım oluşturmak için <td>kullanılırCRIT 140013</td><td>elektroformasyon odası</td></tr><tr><td>banyo sonikatörünü</td><td></td> kapatmak için kullanılır <td>n/a</td><td>elektroformasyon odasını temizlemek için kullanışlıdır, ancak çok önemli değildir</td></tr><tr><td>Nikon TE2000 ters mikroskop, eC1 konfokal sistem (Nikon), iki lazer çizgili (&lambda; = 488 nm ve 543 nm); 5 W iterbiyum fiber sürekli dalga lazer (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Almanya)</td><td></td><td></td><td>optik cımbız mikromanipülatörleri ile donatılmış bir konfokal mikroskopi sistemi örneği</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td></td>borosilikat kılcal damarlar (sırasıyla 0,78 mm ve 1 mm iç ve dış yarıçaplı)Harvard aparatı 30-0036 mikropipet çektirme Sutter Aleti P-2100 microforge Narishige <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>piezoelektrik aktüatör</td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>polistiren streptavidin kaplı boncuklar (çap 3.2 ve mikro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

membran nanotüpler dev unilamellar veziküller çekerek

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Hücre membran yeniden şekillendirilmesi endositoz, kaçakçılık, filopodia, vboluşumu gibi birçok hücresel olayların ayrılmaz bir parçasıdır. Birçok farklı protein hissediyorum veya membran eğriliği ikna yeteneği nedeniyle eğri membranlar ile ilişkilendirin. Genellikle, bu onları hücreye kantitatif çalışmaya çok karmaşık hale proteinler çok sayıda ayrışmasını gerektirir. Biz bir eğri membran vitro, yeniden oluşturmak için bir protokol endositik boyun gibi kavisli bir hücresel yapısı taklit tanımlamak. Bir dev unilamellar vezikül (Şef) olan iç basınç ve yüzey gerilimi micropipette aspirasyon ile kontrol edilir bir hücre zarı modeli olarak kullanılır. Optik cımbız kullanarak Şef bir nokta çekerek güç uygulayarak Nanotüpün düz bir membran bağlı yüksek kavisi oluşturur. Bu yöntem, lipid membranlar, sertlik bükme gibi temel mekanik özelliği ölçmenin geleneksel olarak kullanılmıştır. Son yıllarda, proteinler membran eğriliği ve onlar şekli ve membranları mekanik etkiler yolu ile nasıl etkileşim kurduğu eğitim için genişletilmiştir. Embriyolardan, mikroenjeksiyon, optik cımbız ve confocal mikroskobu birleştiren bir sistem aynı anda ölçüm membran eğriliği, membran gerginlik ve proteinler, yüzey yoğunluğu sağlar. Bu ölçümler protein-membran sisteminin birçok önemli mekanik ve morfolojik özelliklerini anlaşılmaktadır olabilir. Buna ek olarak, biz fizyolojik tuz konsantrasyonu ve proteinler membran üzerinden Floresans yoğunluklarda etiketli proteinler ve yağlar üzerinde yüzey yoğunluğu miktarının bir yöntem GUVs oluşturma iletişim kuralı düzenleyin.

Tüp çekme deneyi membran hakkında hayati mekanik bilgi verebilir. Proteinler veya Çift zar eğriliği, membran ile kuvvet ve tüp RADIUS ile membran gerginlik Canham Helfrich Hamilton uygulayarak ilgili diğer moleküller yokluğunda bir şef50,51 bir tüp denkleme çekti 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(Denklem 1)
<p class...

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Bu nanotüp çekme metodolojisinin genel amacı, ilgilenilen spesifik proteinler ile oldukça kavisli zarlar arasındaki etkileşimleri kantitatif olarak incelemektir. Bu yöntem, endositoz ve hücre içi kaçakçılık gibi hücre zarlarının biyolojisindeki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, proteinlerin kavisli zarlara nasıl bağlandığını ve bunları karşılıklı olarak nasıl deforme ettiğini doğrudan ölçmemize izin verir.Başlangıçta, bu yöntem lipit zarlarının temel mekanik özelliklerini ölçmek için kullanıldı. Son zamanlarda, protein zarı etkileşimlerindeki, özellikle protein şekillendiren zarlardaki önemli mekanizmaları aydınlatmak için uygulanmaktadır. Dev unilamellar vezikülleri doğrudan elektroformasyon odasının platin tellerinden toplayarak başlayın.Deney odasını inşa etmek için, metalik bir taban üzerine bir milimetre aralıklarla iki dikdörtgen cam kapak kayışı yerleştirin ve uzun kenarlar boyunca bir cam mikropipet ucunun en azından odanın merkezine ulaşmasına izin verecek kadar büyük açıklıklar bırakın. Hem deney odasını hem de bir cam mikropipeti, kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde mililitre başına beş miligram yüksek saflıkta bir beta-kazein çözeltisi ile doldurun. Hazne pasifleştirilirken, objektifin üzerinde ortalanmış bir ışık mikroskobuna monte edin ve aspirasyon mikropipetinin ucunu, uç objektifin üzerine gelene kadar uzun kenar boyunca açıklıktan geçirin.Su deposu seviyesini, aspirasyon basıncı sıfıra yakın olacak şekilde ayarlayın ve bir enjeksiyon mikropipetini uygun deneysel konsantrasyonda deneysel tampon içinde çözülmüş ilgili molekülle doldurun. Enjeksiyon mikropipetini bir mikromanipülatörün içine monte edin ve mikropipeti deney odasının diğer tarafından geçirin. İnkübasyonun sonunda, beta-kazein çözeltisini hazneden çıkarın ve hazneyi deneysel tampon ile birkaç kez durulayın.Daha sonra, hazneye birkaç mikrolitre vezikül çözeltisi ekleyin, ardından birkaç mikrolitre streptavidin kaplı boncuk ekleyin, hacim başına negatif% 3 boncuk oranına veya daha azına 0.1 kez 10 ila 0.1 kez nihai konsantrasyona getirin. Veziküller ve boncuklar haznenin dibine yerleştikten sonra, deney tamponunun yaklaşık 15 dakika buharlaşmasına izin verin, bu noktada veziküller bir ışık mikroskobu altında gözle görülür şekilde dalgalanmalıdır. Veziküller uygun şekilde sarkık olduğunda, pipet içindeki zarların uzunlukları pipet yarıçapına eşit veya daha büyük olana kadar tek tek vezikülleri mikropipete aspire edin.Uygun boyutta bir aspirasyon dili tanımlandığında, haznenin açık kenarlarını mineral yağ ile kapatın. Aspirasyon basıncının sıfır konumunu ayarlamak için, aspirasyon pipetinin ucunu bir boncuğun yanına yerleştirin ve su tankının yüksekliğini, boncuğun pipet tarafından emilmemesi veya üflenmemesi için ayarlayın. Suyun yüksekliğinin ayarlanması, mikropipet tarafından aspire edilen vezikülün zar gerilimini kontrol etmek için kritik öneme sahiptir.Bir vezikül aspire edin ve mikropipeti kırmadan yukarı ve odak dışına taşıyın. Optik cımbız kullanarak, haznenin dibinden yaklaşık 20 mikrometre uzakta bir boncuk yakalayın. Vezikülü boncuktan uzağa ve optik tuzakla hizalayarak tekrar odağa getirin ve denge konumunu ölçmek için boncuğun hareketini bir ila iki dakika boyunca kaydedin.Membran gerginliğini azaltmak için vezikülü kaybetmeden mikropipet içindeki basıncı mümkün olduğunca azaltın ve streptavidin-biotin bağlarını oluşturmak için vezikülü boncukla yaklaşık bir saniye dikkatlice temas ettirin. Ardından, bir piezo aktüatör kullanarak, bir nanotüp oluşturmak için vezikülü yavaşça geri çekin. Aspirasyon dilini yeniden oluşturmak için aspirasyon basıncını artırın ve tüpü aspirasyon pipetinin ekseni içinde hizalayın.Tüpü ve vezikülü tamamen odak noktasına getirin ve boncuğun hareketini 30 hertz'lik bir çekim hızında ve su tankının sıfır konumuna göre yüksekliğini parlak alan mikroskobu altında birkaç dakika boyunca kaydedin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, boncuğun hareketini farklı aspirasyon basınçlarında ve membran gerilimlerinde tekrar kaydedin. İlgilenilen proteinleri veya molekülleri enjekte etmek için, optik tuzaktaki boncuğun bozulmamasına dikkat ederek enjeksiyon mikropipetini nanotüpün yanına getirin ve proteinleri bir ila iki paskal basınçla nazikçe enjekte edin.Protein bağlanması dengelendikten sonra, çıplak zar için gösterildiği gibi, eklenen proteinlerin varlığında kademeli ölçümleri tekrarlayın. % 100 DOPC veziküllerinden çekilen nanotüpler üzerindeki kuvvet ve yarıçap ölçümleri bağımsızdır, çünkü kuvvet, optik tuzaktaki boncuğun yer değiştirmesinden ve floresan yoğunluğundan yarıçaptan ölçülür ve membran bükülme sertliğini hesaplamanın iki yolunu sağlar. BAR veya potasyum kanal proteinlerinin zar tüpleri üzerindeki alttaki veziküller üzerindeki nispi zenginleşmesi, proteinlerin kavisli zarlara bağlanma olasılığının daha yüksek olduğunu gösterir.Gerçekten de, N-BAR proteini endofilin A2'nin zara bağlanması, tüp kuvvetini kademeli olarak sıfıra indirir ve bu da tüpü stabil tutan üç boyutlu bir iskele oluşumunu gösterir. Bu prosedürü takiben, örneğin membran tüpleri üzerindeki protein organizasyonunu tespit etmek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi veya protein hareketliliğini ölçmek için tek parçacık izleme gibi ek soruları yanıtlamak için diğer teknikler birleştirilebilir.

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Ayrılmış faz dev unilamellar veziküller (GUVs) üzerinde deneyler sık fizyolojik çözüm koşulları ihmal. Bu çalışma yüksek tuzluluk arabellek etkisi ücret uygulamasının GUVs trans-membran çözüm asimetri ve sıcaklık sıvı-sıvı faz ayrılmaya bir fonksiyonu olarak çalışmaya yaklaşımlar sunar.

Şarj edilmiş veziküller Floresans mikroskobu ile izlenen simetrik ve asimetrik çözüm koşullarda davranışını faz

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Bu yeni başlayanlar kılavuzu, damlacık transfer yöntemi yoluyla Dev Tek Katmanlı Veziküllerin (GUV'ler) hazırlanması için genel bir protokol sunar, kritik adımları tartışır ve sentetik biyoloji ve mikrorobotik dahil olmak üzere farklı uygulamalar için gerekli olası ayarlamalara yardımcı olacak bilgiler sağlar.

Dev tek katmanlı vezikülleri güvenilir bir şekilde hazırlamak için damlacık transfer yöntemini kullanma

Öğrenin, dev unilamellar veziküllerden çekilen membran nanotüpleri kullanarak kavisli membranlarla protein etkileşimlerini nicel olarak nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem endositoz ve hücre içi taşıma mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Daha fazla video keşfet