Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Bu deneyin genel amacı, konfokal mikroskopi kullanarak sağlam pankreas adacıklarındaki insülin granül ekzositozunu gerçek zamanlı olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, diyabet alanındaki temel sorulara yanıt verecektir. Örneğin, insülin ekzositozunu ne düzenler?

Granül füzyonu, bir beta hücresinin yaşamındaki en önemli tek olay olduğundan bu durum kritik bir öneme sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam adacıklar kullanabilmemiz ve hücrelerdeki füzyon olaylarını kendi doğal ortamları içindeyken görebilmemizdir. Laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Madina Mahkmutova, tekniği uygulamalı olarak gösterecektir.

Başlangıçta, pankreatik adacıklar ulaştığında, bunları 50 mililitrelik falcon tüplerine aktarın ve adacık süspansiyonunu dakikada 1.000 devirde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Adacıklar tüpün dibinde toplanacaktır; adacıkları iki mililitre CMRL kültür ortamı ile 35 milimetrelik doku kültürü işlemi görmemiş petri kaplarına aktarın ve viral enfeksiyondan önce 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 24 saat boyunca inkübe edin. İzolasyonun ardından, yaklaşık fare pankreatik adacık eşdeğerlerini iki mililitre CMRL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 35 milimetrelik doku kültürü işlemi görmemiş petri kaplarına aktarın.

Viral enfeksiyondan önce dokuyu 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat inkübe edin. Viral enfeksiyonu gerçekleştirmek için, 2 mL CMRL kültür ortamı içerisinde insan veya fare adacıkları bulunan her bir 35 mm petri kabına 5 ila 10 µL stok virüs ekleyin. Adacıkları 24 saat kültürledikten sonra, ortamı aspire edin ve yerine virüs içermeyen 2 mL CMRL kültür ortamı ekleyin.

Adacıkları, besiyerini her üç günde bir yenileyerek dört ila altı gün boyunca kültüre edin. Burada listelenen reaktifleri birleştirerek hücre dışı çözeltiyi hazırlayın ve ardından tamponu filtre sterilizasyonundan geçirin. 50 milliliters hücre dışı çözeltiye 75 microliters iki molar glikoz stoğu ekleyerek, nihai glikoz konsantrasyonu üç millimolar olan bazal glikoz besiyeri hazırlayın.

Ardından, 16 millimolar nihai glukoz konsantrasyonunda hiperglisemik ortam hazırlamak için, 50 milliliters extracellular solution içerisine 400 microliters iki molar glukoz stok çözeltisi ekleyin. Ek stimülasyon maddelerini ve üç millimolar glukoz içeren extracellular solution'ı seyreltin. Deneye başlamadan önce, lamelleri 30 microliters bir milligram per milliliter poly-d-lysine çözeltisi ile ön işlemden geçirin ve bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, lamelleri suyla iyice durulayın. Deneyden en az bir saat önce, bir grup adacığı 3 mM glukoz içeren hücre dışı çözelti bulunan 35 mm'lik bir petri kabına aktarın. Kalan adacıkları 37 °C ve %5 CO2'de tutun.

Deneye başlamadan 30 dakika önce, sızdırmazlığı sağlamak için silikon gres kullanarak lamelini görüntüleme odasına takın. Ardından görüntüleme odasını görüntüleme platformuna sabitleyin. Sonrasında, bir pipet yardımıyla 20 ila 30 adacığı lamelin poly-d-lysine ile işlem görmüş alanına aktarın ve adacıkların yüzeye tutunması için 20 dakika bekleyin.

Bu adım deneyin başarısı için kritiktir; yaklaşık 20 ila 30 adacığı 10 µL'den daha az tampon çözelti içinde toplayıp 20 dakika bekliyoruz. Adacıkların hasar görmesini önlemek için lamelin tamamen kurumasının engellenmesi önemlidir. Adacıklar lamele tutunurken, perfüzyon sistemini su kullanarak iyice durulayıp hazırlayın.

Ardından, bu tabloya göre her bir çözeltiyi farklı bir kanala ekleyin. Her kanalı ayrı ayrı açıp çözeltinin birkaç dakika akmasını sağlayarak sistemdeki tüm hava kabarcıklarını giderin. Akışın tutarlı olduğundan ve borularda sızıntı bulunmadığından emin olun.

Ardından, tekil hat içi çözelti ısıtıcısını perfüzyon çıkış tüpüne bağlayın ve dışarı akan tamponun sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın. Sonra, vakum pompasını hazırlayın. Hortumları bağlayın, pompayı çalıştırın ve sıvının aspire edildiğinden emin olun.

Adacıkların bulunduğu görüntüleme platformunu mikroskop tablasına yerleştirin ve perfüzyon sistemine ile vakum pompasına bağlayın. Ardından, görüntüleme haznesini 3 mM glukoz içeren hücre dışı solüsyon ile nazikçe doldurun. Konfokal görüntüleme yapmak için, adacıkları düşük büyütmede mikroskop alanında bulun.

Adacıklar odaklandıktan sonra, daha yüksek büyütmeli objektiflere geçin. Görüntüleme yazılımını açın ve yerleşik tarama modunu etkinleştirin. xyzt görüntülemeyi seçin; ardından görüntüleme ayarlarını yapılandırmak için argon lazerini açıp %30'a ayarlayın ve ardından pHluorin uyarımı için lazer gücünü yaklaşık %50'ye ayarlayarak 488 nanometre lazer hattını seçin.

EGFP emisyon spektrumunu kılavuz olarak kullanarak 505 ile 555 nanometre arasında emisyon toplayın. Çözünürlük olarak 512 x 512 piksel seçin. Live butonuna basarak görüntülemeyi başlatın ve kazanç (gain) seviyelerini ayarlayın.

İletin üst kısmına odaklanıp "begin" seçeneğini belirleyerek ve ardından odaklanılabilen son düzleme geçip "n" seçeneğini belirleyerek z yığınının başlangıç ve bitiş noktalarını ayarlayın. Z yığını boyutu olarak 5 µm seçin. Her bir z yığınının elde edilmesi için zaman aralığını 1,5 ila 2 saniye civarına ayarlayın ve sürekli görüntüleme için "acquire until stopped" seçeneğini belirleyin.

Ardından, görüntülemeyi başlatmak için başlat düğmesine basın. Granül ekzositozunu indüklemek için uygulanacak stimülasyon protokolleri için metin protokolüne başvurun. Dahili tarayıcı kullanılarak, adacığın konfokal görüntüleri iki saniyeden kısa sürede zaman ayarlı (timelapse) kayıtlar olarak elde edilir.

Ek olarak, bu teknik, membran potansiyeli veya sitozolik serbest kalsiyum boyaları gibi fonksiyonel görüntüleme boyalarıyla birleştirilebilir. NP Y-pHluorin'in insülin granül dinamiklerini izlemek için gerçekten uygun bir araç olup olmadığını belirlemek amacıyla, enfekte adacıklar NP Y-pHluorin için GFP'ye karşı ve adacık hormonları olan insülin, somatostatin veya glukagona karşı antikorlarla immünoboyandı. NP Y-pHluorin eksprese eden hücrelerin çoğu, aynı zamanda insülin de eksprese ettikleri için beta hücreleriydi.

Yalnızca birkaç glukagon pozitif alfa hücresi veya somatostatin pozitif delta hücresi GFP ile işaretlenmiştir. Önemli bir nokta olarak, enfekte hücrelerde NP Y füzyonu insülin ile aynı konumda yer almıştır. Bu şekil, pHluorin'in etkili bir pH sensörü olduğunu göstermektedir.

Hücre içi pH'ın 50 millimolar amonyum klorür ile artırılması, hücre içi floresansta %500'ün üzerinde bir artışla sonuçlanmıştır. Granülün plazma membranı ile füzyonu ve füzyon porunun açılmasıyla granül içindeki pH arttıkça, NPY-pHluorin içeren granüller, potasyum klorür ile membran depolarizasyonu gibi insülin eksositozunu stimüle eden koşullar altında görünür hale gelir. NPY-pHluorin enfekte adacıkların konfokal timelapse görüntülemesi kullanılarak, sağlam adacıklar içindeki beta hücrelerdeki tekil sekresyon olayları görselleştirilebilir.

Bunlar, potasyum klorür ile doğrudan membran depolarizasyonuna veya diğer çeşitli fizyolojik uyarılara yanıt olarak meydana gelir. Bazal hücre dışı glikoz konsantrasyonunda, çok az sekresyonel aktivite gözlemlenir. Ancak, yüksek glikozla stimülasyona yanıt olarak granüllerin plazma membranı ile füzyonu tetiklenir.

Bu prosedürü takiben, granül füzyonunun hücrenin neden belirli bölgelerinde meydana geldiği gibi ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, insan adacıklarındaki beta hücresi popülasyonlarında insülin granül salınımının zamansal paternini araştırmak için kullanılmıştır.