Name: Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, fare ve insan pankreas adacıklarında pHluorin ile insülin granül ekzositozunu gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, diyabet araştırmalarında insülin salınımının düzenlenmesini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Marcia Boulina yardım için çekirdek özelliği mikroskoplar sayesinde görüntüleme DRI dan teşekkür ederiz. Bu eser NIH hibe 1K01DK111757-01 tarafından (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 ve R56 DK084321 (AC) destek verdi.

University of Miami hayvan Etik Komitesi tüm deneylerin onayladı.
 1. viral enfeksiyon, bozulmamış izole insan veya fare pankreas adacıkları <ol><li>adacık kültür: adacık kültür ortamı hazırlamak: Connaught tıbbi araştırma laboratuvarları (CMRL) 1066, % 10 (v/v) FBS ve 2 mM L-glutamin.
	<ol><li>İnsan pankreas adacıkları entegre adacık dağıtım programından (NIDDK, NIH) elde edilir. Elimize adacıkları transfer (~ 500 adacık eşdeğerleri) için 35-mm sigara doku kültürü Petri yemekler ile 2 mL CMRL kültür medya 37 ° c, % %5/95 CO 2 /O 2 24 saat önce viral enfeksiyon için tedavi.</li>
		<li>Fare pankreas adacıkları daha önce kurulan protokolleri 16 aşağıdaki ayrılmış olabilir. Yalıtım, kültür ~ 200 adacık eşdeğerleri olarak 35-mm sigara doku kültürü Petri yemekler ile 2 mL CMRL kültür medya 37 ° c, % %5/95 CO 2 /O 2 24 saat önce viral enfeksiyon için tedavi. 
		Not: transgenik fareler adacıkları üzerinde ifade GFP veya YFP muhabirlerle NPY-pHluorin floresan çakışma önlemek için kullanmaktan kaçının.</li>
	</ol></li> <li>Virüs hazırlık Not: NPY-pHluorin fusion pcDNA3 vektör 10 kopyalanmış ve adenoviral üretimi için adenoviral bir vektör içine subcloned [adenovirus serotip 5 (DE1/E3)] rekombinant adenovirus tarafından üretim şirketi. Virüs bölünmemeli ve-80 ° C'de saklı Viral stok titreleri 10 şirketi tarafından sağlanan 12-10 13 viral parçacıkların (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
	<ol><li>In vitro adacık enfeksiyon, kullanın 10 6 PFU/mL, kaynaklanan enfeksiyon (MOI) yaklaşık bir çeşitlilik içinde yaklaşık 2 (bkz: tartışma Ayrıntılar için) için</li></ol></li>
	<li>Pankreas adacıkları viral enfeksiyon 
	Dikkat: Seviye 2 (BSL2) yordamlar ve sertifika adenovirüse bakın ile çalışma gerektirir. Kurumsal Biyogüvenlik memur rehberlik ve eğitim BSL2 prosedürler ile kontrol edin.
	<ol><li>İnsan/fare adacıkları yukarıda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>2 ml (%10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile) CMRL kültür ortamının insan/fare adacıkları içeren her 35-mm Petri kabına için 5-10 µL hisse senedi şunun ekleyin. 
		Not: şirket veri sayfası tarafından sağlanan viral titresi göre kullanılan virüs seviyesini ayarlamak.</li>
		<li>Kültür adacıkları, virüs içeren medya 37 °C/5% CO 2 24 h için</li>
		<li>24 saat sonra virüs içeren medya Aspire edin ve 2 mL CMRL kültür medya (%10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile) yerine.</li>
		<li>Medya 3 günde yerine 37 °C/5% CO 2, 4-6 gün için adacıkları kültür.</li>
		<li>Sonra 4 - kültür, 6 gün civarında adacık hücreleri bulaşması için % 30'u bekliyoruz. Adacıkları-ebilmek o zaman var olmak kullanılmış canlı görüntüleme deneyler için.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal görüntüleme, enfekte adacıkları Not: Malzemeler tablo confocal görüntüleme için gerekli ekipman ve malzemeler için başvurmak.
<ol><li>Reaktif hazırlık ve deneysel kurulum <ol><li>hazırlamak ekstraselüler çözüm: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, % 0,1 BSA, eklemek filtre pH 7.4, steril. 
		Not: Bu tampon normal glikoz hazırlanır ve 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanabilir. Glikoz istenen son toplama ulaşmak için deneme günü eklenir.
		<ol><li>Hazırla Bazal glikoz (3 mM) orta: hücre dışı çözüm için 50 mL 2 M glikoz stokunun 75 µL ekleyin.</li>
			<li>Hyperglycemic (16 mM) orta: hücre dışı çözüm için 50 mL 2 M glikoz stokunun 400 µL ekleyin</li></ol>
		</li> <li>Herhangi bir ek uyarıcı (örneğin, KCl veya adenozin trifosfat (ATP)) 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözümde sulandırmak.</li>
		<li>Bir deney başlamadan önce Poli-D-lizin çözüm (1 mg/mL) 30 µL için 1 h için coverslip ekleyip iyice H 2 ile O. durulama Poli-D-lisin ile coverslips pretreat 
		Not: Poli-lizin kaplı coverslips 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
		<li>En az 1 saat önce 1 mL pipet kullanarak deney, adacıkları ile 3 mM glikoz hücre dışı solüsyon içeren 35-mm Petri kabına aktarın. Adacıkları 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de devam. 
		Not: gerekirse, bu adımda plazma zarı etiketli. Plazma zarı etiketlemek için 2 µM di-8-ANEPP boya ile 3 mM glikoz hücre dışı çözüm ekleyin. 37 °C/5% CO 2 1 h için boya çözümde adacıkları kuluçkaya. Plazma zarı boya 488 heyecanlı nm ve 620 nm.</li>
		bir deney başlamadan önce <li>min vakum silikon gres ile sızdırmazlık tarafından coverslip görüntüleme odasına iliştirin. Görüntüleme platformu görüntüleme odasına düzeltmek. Bir pipet kullanarak adacıkları uygun 20 dakika süreyle yüzeye coverslip ve poli-D-lizin-tedavi alan üzerinde 20-30 adacıklar yer 
		Not: Kurumasını adacık zarar görmemesi için coverslip izin önemlidir.</li>
		Adacıkları coverslip için uygun iken <li>iyice su ile durulama tarafından perfüzyon sistemi hazırlamak. Her çözüm için başka bir kanal eklemek: 3 mM glikoz (Kanal 1), 16 mM glikoz (2 kanal), 100 µM 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ve 10 µM forskolin (Kanal 3), 25 mM KCl 3 mM glikoz (Kanal 4), 3 mM glikoz (10 µM ATP ile 16 mM glukoz Kanal 5). Tüm kabarcıklar her kanalı ayrı ayrı açarak ve çözüm akışı için bir kaç dakika izin sistemden kaldırmak ve akışını tutarlı (0.5 mL/dak) ve tüp değil sızdırıyor emin olun.</li>
		<li>Tek satır içi çözüm ısıtıcı perfüzyon çıkış tüp bağlamak ve 37 outflowing arabellek sıcaklığını ayarlamak ° C.</li>
		<li>Emme pompası hazırlayın. Tüm kabarcıklar sistemden kaldırmak ve akışını tutarlı ve tüp değil sızdırıyor emin olun.</li>
		Coverslip yüzeye adacıkları uygun bir kez <li>yavaşça görüntüleme odasını 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm ile doldurun. Coverslip yüzey uzak adacıkları yıkama kaçının.</li>
		<li>Görüntüleme platformu mikroskop Sahne Alanı'na adacıkları ile yere takıp perfüzyon sistemi ve emme pompası bağlayın.</li>
		<li>Dönüş akışını ve sürekli adacıkları ile 3 G ekstraselüler eriyik sıvı. Sistem confocal görüntüleme için hazırdır.</li>
	</ol></li> <li>Confocal görüntüleme <ol><li>alt büyütme ile mikroskop alanındaki adacıkları bulun. Sonra adacıkları üzerinde duruldu, daha yüksek büyütme hedefleri için geçiş (örneğin, 63 X su daldırma amaç (63 X / 0.9 NA)).</li>
		<li>Yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak edinme açın ve rezonans tarayıcı kipi etkin kılın.</li>
		<li>XYZT görüntüleme modu seçin ve aşağıdaki gibi satın alma ayarlarını yapılandırın: <ol><li>çevirmek Argon lazer ve 488 nm lazer çizgi ve lazer güç pHluorin uyarma için % 50'ye ayarlayın.</li>
			<li>Toplamak emisyon, 505-555 nm.</li>
			<li>, 512 x 512 piksel çözünürlüğü seçin. Basın &#34; Live &#34; görüntüleme başlatın ve (tipik kazanç ise yaklaşık 600 V) kazanç düzeylerini ayarlamak için düğmesini.</li>
			<li>Ayarla BEGIN ve end z yığının: odak üstünde adacık ve seçin &#34; başlangıç &#34; ve son odaklı olabilir ve Seç uçak gitme &#34; son &#34;. 5 mikron z-adım boyutunu kullanın. Yazılım otomatik olarak confocal uçak sayısını hesaplar.</li>
			<li>Her z-yığın 1.5-2 s yakın edinimi için zaman aralığı ayarlarken ve seçeneği &#34; durdurulana kadar elde &#34; için sürekli düşsel.</li>
			<li>Basın &#34; başlangıç &#34; ini düğmetialize.</li>
		</ol></li> <li>Granül ekzositozu adacıkları ile istenen uyaranlara Ventriküler tarafından ikna etmek için çeşitli stimülasyon iletişim kurallarını kullanır. Stimulasyon protokolleri istenen bilimsel amaç (aşağıya bakın) uyacak şekilde özelleştirilebilir.</li>
	</ol></li> <li>Stimulasyon protokolleri Not: adacık arka plan etkinliği en az 2 dakika sürekli perfüzyon 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm ile kaydederek her stimülasyon Protokolü başlatın. Bir uyarıcı ile istenen süre için sıvı. Uyarıcılar sırasını, stimülasyon süresi yanı sıra kayıtları süresi istenen bilimsel amaçlar uyacak şekilde özelleştirilebilir. Yeni bir stimülasyon başlamadan önce 3 mM glikoz içeren hücre dışı çözüm adacıkları iyice yıkayın emin olun. Aşağıda yöntemi yetenekleri göstermek için kullanılan örnek stimulasyon protokolleri bulabilirsiniz.
	<ol><li>Teşvik pHluorin pH duyarlılık ve viral enfeksiyon verimliliği ( şekil 3) pozitif kontrol olarak amonyum klorür (NH 4 Cl) ile: 3 mM glikoz (2 dk) &#8594; 50 mM NH 4 Cl (2 dk) 3 mM glikoz &#8594; 3 mM glikoz (2 dk) Not: ın NH 4 Cl çözüm, eski yerine koymak NaCl ekimolar bazda.</li>
		<li>Stimulate insülin granül ekzositozu glikoz konsantrasyonu ( şekil 5 ve şekil 6) artırarak: 3 mM glikoz (2 dk) &#8594; 16 mM glikoz (15-30 dakika) &#8594; 3 mM glikoz (2 dk 
		Not: etkinlik birkaç patlamaları görmek için en az 15 dakika süreyle 16 G Çözümle sürekli adacıkları sıvı 
		Not: salgı yanıt-e doğru 17 tutarlılığını artırmak için kullanıcıları kampı yükselterek ajanlar (100 µM IBMX ve 10 µM forskolin) 16 G ve 3 G çözüm ekleyebilirsiniz. Bu granül sekresyonunu zamansal şekillerinin değiştirmez. Ayrıntılar 15 ve tartışma için bkz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li>
<li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell+identity%2C+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li>
<li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li>
<li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li>
<li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li>
<li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+%28pHluorin%29+and+confocal+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li>
<li>Whim, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cells+synthesize+neuropeptide+Y+and+can+rapidly+release+peptide+co-transmitters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters.</a> PLoS One. 6 (4), e19478(2011).</li>
<li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+%26%2334%3Bkiss-and-run%26%2334%3B+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).</li>
<li>Zhu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+I+and+IX+function+redundantly+in+controlling+fusion+pore+of+large+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+fusion+pore+opening+and+the+amount+of+hormone+released+are+regulated+by+myosin+II+during+kiss-and-run+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis.</a> Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).</li>
<li>Felmy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cargo+release+from+dense+core+granules+by+size+and+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network.</a> Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Gandasi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+Red+Fluorescence+Proteins+as+Markers+for+Secretory+Granule+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis.</a> PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).</li>
<li>Almaca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+coordination+of+insulin+granule+exocytosis+in+intact+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets.</a> Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> J Vis Exp. (99), e52632(2015).</li>
<li>Hanna, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kiss-and-run+exocytosis+and+fusion+pores+of+secretory+vesicles+in+human+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transfection+of+isolated+pancreatic+islets%3A+a+study+of+programmed+cell+death+%28apoptosis%29+and+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function.</a> J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).</li>
<li>Michael, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cargo+proteins+in+pancreatic+beta-cells%3A+design+determines+secretion+kinetics+at+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis.</a> Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).</li>
<li>Serre-Beinier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx36+makes+channels+coupling+human+pancreatic+beta-cells%2C+and+correlates+with+insulin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression.</a> Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).</li>
<li>Rutter, G. A., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+connectivity+in+pancreatic+islets%3A+a+type+2+diabetes+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?</a> Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).</li>
<li>Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHuji%2C+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+for+imaging+of+exo-+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.</a> J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu el yazması tarafından confocal mikroskobu sağlam pankreas adacıkları içinde beta hücrelerindeki insülin granülleri ekzositozu görselleştirmek için kullanılabilir bir teknik anlatılmaktadır. Bu NPY-pHluorin adenovirus klonlanmış floresan muhabir olarak yüksek transfection verimliliği sağlamak için kullanılır.
Yöntem bizim ellerimizde yüksek verimli olmasına rağmen öncelikle iki parametre bağlı bazı değişiklikler gerektirebilir: 1) adacık hazırlık ve viral stok 2) titresi enfeksiyon koşulları...

İnsülin pankreas adacık beta hücreleri tarafından üretilen ve glukoz metabolizma1anahtar bir düzenleyicisidir. Ölüm ya da beta hücre fonksiyon bozukluğu glikoz homeostazı rahatsız ediyor ve diyabet2' ye götürür. İnsülin bir Ca2 +içinde yayımlanan çekirdek yoğun granüller içinde paketlenmiştir-bağımlı bir şekilde3. İnsülin granül ekzositozu nasıl düzenlenir elucidating tam olarak ne insülin salgılanması belirler ve diyabet tedavisi için yeni tedavi hedefleri tanımlaması için yeni yollar açar anlamak önemlidir.
İnsülin ekzositozu kapsamlı floresan molekülleri ile birlikte membran kapasitans ölçümleri ve mikroskobik yaklaşımlar gibi Elektrofizyolojik yaklaşımları kullanarak çalışılmıştır. Membran kapasitans ölçümleri iyi temporal çözünürlüğe sahip ve tek hücre kayıtları sağlar. Ancak, kapasite değişimler hücrenin net yüzey değişikliği yansıtmak ve bireysel füzyon olayları yakalamak veya insülin granül füzyon diğer sigara insülin salgı veziküller3ayırt. İki fotonlu veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, floresan problar ve vezikül kargo proteinler, birlikte gibi mikroskobik yaklaşımlar ek ayrıntı sağlar. Bu teknikler tek exocytotic olayları ve ayrıca öncesi ve sonrası exocytotic aşamaları yakalamak ve nüfus hücreleri3exocytotic desen eğitimi için kullanılabilir.
Floresan gazetecilere üç tür olabilir: 1) hücre dışı, 2) sitoplazmik veya 3) veziküler. 1) hücre dışı gazetecilere ekstraselüler ortamın4ten kutup tarayıcıları (örneğin, dextrans, sulforhodamine B (SRB), lucifer sarı, pyranine) vardır. Polar verici kullanımı bir nüfus hücre füzyon gözenek incelenmesi için izin verir ve kan damarları gibi çeşitli hücreler arası yapıları yakalar. Ancak, vezikül kargo davranış bildirmez. 2) sitoplazmik gazetecilere floresan problar sitoplazma yüz ve rıhtım ve ekzositozu dahil membran ilişkili proteinler için birleştiğinde vardır. Örnekler nörotransmitter sürüm5çalışmak için nörolojik başarıyla kullanılan çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı faktör ek protein reseptörü (tuzak) aile üyeleri. Bu proteinler birden çok bağlayıcı ortak ve insülin-granül değildir belirli. 3) veziküler gazetecilere floresan problar kargo özel vezikül davranış soruşturma için izin veziküler kargo proteinlere erimiş vardır. İnsülin-granül özel kargo proteinler insülin, c-peptid, adacık amiloid polipeptid ve NPY diğerleri arasında içerir6,7. NPY sadece insülin granülleri içeren mevcuttur ve insülin ile ortak yapım o bir floresan muhabir8için mükemmel bir partner yayımlanır.
Füzyon NPY için farklı floresan proteinlerin daha önce ekzositozu nöroendokrin hücrelerinde, belirli synaptotagmin izoformlarının9,10 şartı gibi çeşitli yönlerini incelemek için istihdam edilmiştir ve nasıl zaman-yayın tabii aktin sitoiskeleti üzerindeki ve myosin II11,12bağlıdır. Bu çalışmada, floresan olmayan değiştirilmiş bir GFP olan flüoresan muhabir pHluorin seçtik yoğun çekirdek içinde asidik pH granül ama olur maruz nötr ekstrasellüler pH13üzerine parlak floresan. Olgun insülin granülleri bir asidik pH 5.5 aşağıda var. Bir kez plazma zarı ve açar ile granül sigortalar, taşıdığı 7.4,7,14muhabir olarak pH duyarlı proteinler pHluorin kullanımına izin nötr ekstrasellüler pH için yararlanılır.
PHluorin pH hassas doğası ve insülin granülleri NPY seçici ifade içinde görüş-in NPY-pHluorin füzyon yapı insülin granül ekzositozu çeşitli özelliklerini incelemek için kullanılabilir. Füzyon yapı viral teslim yüksek transfection verimlilik sağlar ve birincil beta hücreleri veya hücre hatları yanı sıra izole adacıkları üzerinde çalışır. Bu yöntem, bir kılavuz olarak ekzositozu hücreye herhangi bir diğer NPY içeren veziküller ile çalışmak için de kullanılabilir. Ayrıca ekzositozu üzerinde belirli koşullar (nakavtlar, overexpression, vb) etkilerini incelemek için herhangi bir transgenik fare modeli ile birleştirilebilir. Bu teknik daha önce insülin granül sekresyonunu beta hücre popülasyonlarının insan adacıkları15içinde kayma ve temporal desenlerini tanımlamak için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Dik lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td>TCS-SP5</td><td>, görüntü elde etme yazılımı olan LAS AF'yi içerir</td></tr><tr><td>Görüntüleme odası</td><td>Warner cihazları</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme odası platformu</td><td>Warner aletleri</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cam lameller</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>Vakum silikon gres</td><td>Sigma</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı perfüzyon sistemi</td><td>Warner instruments</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>Tek hat içi çözelti ısıtıcısı</td><td>Warner instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Aspirasyon pompası</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri kabı, doku kültürü işlem görmemiş</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL Orta, glutamin içermez</td><td>ThermoFisher</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS, ısıyla inaktive edilmiş</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2 </alt>çözelti</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 </alt>çözelti</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Vakum filtresi</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-izobütil-1-metilksantin (IBMX)</td> <td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal peptit y-phluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

İnsülin salgılanması glikoz homeostazı normal şartlarda fizyolojik de olduğu gibi hastalığı merkezi bir rol oynar. İnsülin granül ekzositozu Elektrofizyoloji veya floresan gazetecilere ifade için birleştiğinde mikroskobu kullanın eğitim için geçerli yaklaşımlar. Ancak bu tekniklerin çoğu klonal hücre hatları için optimize edilmiş veya pankreas adacıkları dissociating gerektirir. Buna ek olarak, burada sunulan yöntemi insülin granül ekzositozu sağlam pankreas adacıkları içinde gerçek zamanlı görselleştirme olanak sağlar. Bu protokol için ilk viral enfeksiyon peptit Y (NPY) birleştiğinde bir pH duyarlı yeşil flüoresan protein (GFP), pHluorin, kodlar adenovirus ile izole pankreas adacıkları tarif. İkinci olarak, confocal adacıkları beş gün sonra viral enfeksiyon ve insülin granül sekresyonunu izlemek nasıl görüntüleme açıklar. Kısaca, virüslü adacıkları bir coverslip bir görüntüleme odası üzerinde yerleştirilir ve bir dik lazer tarama confocal mikroskop altında sürekli olarak çeşitli uyaranlara içeren hücre dışı çözüm ile periosteum süre görüntüsü. Confocal görüntüleri adacık 50 µm kapsayan bir hızlı rezonans tarayıcı kullanarak hızlandırılmış kayıtları elde edilir. İnsülin granülleri plazma zarı ile füzyon zaman içinde izlenebilir. Bu yordamı Ayrıca tek bir deneyde bir pil uyaranların test etmek için izin verir, fare ve insan adacıkları ile uyumludur ve fonksiyonel görüntüleme (örneğin, membran potansiyeli veya sitozolik kalsiyum boyalar) için çeşitli boyalari ile kombine edilebilir.

Tüm iş akışı tekniği Resim 1' de gösterilen. Kısaca, fare veya insan adacıkları olabilir NPY-pHluorin kodlama adenovirus ile enfekte ve yansıma, kültür, confocal mikroskop altında birkaç gün sonra. Granül sigorta plazma zarı ve açık olarak, floresan bir artış görülmektedir ve sayısal (şekil 1). NPY-pHluorin gerçekten de insülin granül dynamics izlemek için uygun bir araç olup olmadığını belirlemek için virüslü adacıkları GFP ve f...

Biz pHluorin, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein kullanarak bozulmamış adacıkları insülin ekzositozu görselleştirme için bir iletişim kuralı tanımlamak. İzole adacıkları adenovirus pHluorin vezikül kargo peptit Y birleştiğinde kodlama ile bulaşmış. Bu confocal mikroskobu tarafından insülin granül füzyon olayları algılama için sağlar.

Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Bu deneyin genel amacı, konfokal mikroskopi kullanarak sağlam pankreas adacıklarındaki insülin granül ekzositozunu gerçek zamanlı olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, diyabet alanındaki temel sorulara yanıt verecektir. Örneğin, insülin ekzositozunu ne düzenler?Granül füzyonu, bir beta hücresinin yaşamındaki en önemli tek olay olduğundan bu durum kritik bir öneme sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam adacıklar kullanabilmemiz ve hücrelerdeki füzyon olaylarını kendi doğal ortamları içindeyken görebilmemizdir. Laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Madina Mahkmutova, tekniği uygulamalı olarak gösterecektir.Başlangıçta, pankreatik adacıklar ulaştığında, bunları 50 mililitrelik falcon tüplerine aktarın ve adacık süspansiyonunu dakikada 1.000 devirde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Adacıklar tüpün dibinde toplanacaktır; adacıkları iki mililitre CMRL kültür ortamı ile 35 milimetrelik doku kültürü işlemi görmemiş petri kaplarına aktarın ve viral enfeksiyondan önce 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 24 saat boyunca inkübe edin. İzolasyonun ardından, yaklaşık fare pankreatik adacık eşdeğerlerini iki mililitre CMRL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 35 milimetrelik doku kültürü işle

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, pankreas adacık hücrelerinin küçük alt popülasyonlarındaki sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri incelemek için adacık hücrelerinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesi tekniği açıklanmaktadır. Minör hücre alt popülasyonları, belirli bir adacık hücresi popülasyonunda sitozolik kalsiyumda değişikliklere neden olan adrenalin ve ghrelin gibi işaretleyici bileşiklere fonksiyonel tepkiler kullanılarak tanımlanabilir. Bu, kan şekeri ile adacık salgısı çıktısı arasındaki...

Pankreas Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiklerini Görüntüleme: Pankreas Adacığındaki Sitozolik Kalsiyum Konsantrasyonundaki Gerçek Zamanlı Değişiklikleri İncelemek İçin Bir Teknik

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Gözlem gerçek zamanlı yeşil Floresans Protein (GFP), glukoz taşıyıcı 4 (GLUT4) protein insülin stimülasyon ve biyolojik rolü CCR5 insülin-GLUT4 karakterizasyonu üzerine kaçakçılığı öğesini için bu iletişim kuralı bir teknik anlatılmaktadır yolu Deconvolution mikroskobu ile işaret.

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Burada, yöntemleri temizleyerek bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı üç boyutlu (3D) kullanarak görüntü insan pankreas bölümlerine pasif mevcut. Bu el yazması insan adacıkları innerve otonomik ve duyusal sinir ağları temel unsurları belirlemek için boyama birden çok ayirt tarafından takip pasif optik takas için bu yordamları gösterir.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.

Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi

Bu protokol, yakın fizyolojik koşullar altında hücre fonksiyonunu incelemek için ölen organ bağışçılarından insan pankreas dilimlerinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu yenilikçi yaklaşım, normal ve yapısal olarak hasar görmüş adacıkların araştırılmasını ve endokrin ve ekzokrin kompartmanlar arasındaki karmaşık etkileşimi sağlar.

Endokrin ve Ekzokrin Pankreas Fizyolojisini İncelemek için İnsan Pankreas Dokusu Dilimlerinin Oluşturulması

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

Öğrenin, fare ve insan pankreas adacıklarında pHluorin ile insülin granül ekzositozunu gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, diyabet araştırmalarında insülin salınımının düzenlenmesini anlamaya yardımcı olur.

Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik (Video) | JoVE Journal

Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Daha fazla video keşfet