Vitro Sıçanlarda kolon Afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri karakterizasyonu

Bu protokolün genel amacı, kolorektumun duyusal sinirlerinin in vitro elektrofizyolojik kayıtları için metodolojiyi göstermektir. Bu yöntem, dış periferik efferens duyarlılığının doğru hiperaljeziye katkısı gibi in vitro kalem alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, karotis ayrımının in vivo, hayvanlarda veya hastalarda yapılmasına benzer şekilde kolorektumun ayrımına izin vermesidir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü ganglionların yerini belirlemek ve sinirleri incelemek nispeten zordur. Bu işleme başlamak için, bir neşter kullanarak karın duvarında orta hat insizyonu yaparak derin anestezi uygulanmış bir sıçanın karın boşluğunu ortaya çıkarın. Daha sonra, kolorectum'u ortaya çıkarmak için mezenter ve diğer dokuları bir kenara çekin.

Ardından, hayvanı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Dikkatli bir diseksiyon ile sol pelvik ganglionu bulun ve pelvik sinirleri ve ona katılan lomber splanknik sinirleri tanımlayın. Daha sonra, bu sinirleri pelvik gangliondan birkaç milimetre uzakta kesin.

Pelvik ganglionun bulunması ve sinirlerin diseksiyonu bu prosedürün en kritik ve zor adımıdır. Ardından, rektumu ortaya çıkarmak için simfiz kemiğini kesin. Kolorektumun üzerindeki dokuları çıkarın ve pelvik ganglionu sağlam bırakmaya dikkat edin.

Sıçanı aşırı dozda pentobarbital intravenöz enjeksiyonu ile kurban ettikten sonra, kolonu pelvik ganglionun yaklaşık üç santimetre yukarısından geçirin ve kolorektumu forseps kullanarak hayvandan çıkarın. Daha sonra, kolorekumu önceden soğutulmuş Krebs çözeltisi ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Kolonu nazikçe yıkayarak dışkıyı çıkarın.

Daha sonra, pelvik gangliondan ödün vermeden kalan idrar kesesini ve diğer dokuları dikkatlice çıkarın. Bu prosedürde, kolonu bir kayıt odasına yerleştirin ve dokuyu sürekli olarak karbojene Krebs solüsyonu ile doldurun. Daha sonra, kolorektumu hem oral hem de anal uçlarda kanüle edin, daha sonra kolonun intraluminal infüzyonunu oral ila anal yönde salin ile başlatın, bundan sonra, diseksiyon mikroskobu altında ana pelvik gangliyonu bulun ve ganglionu ortaya çıkarmak için böcek pimleri kullanın.

Dikkatli bir diseksiyonla, gangliondan çıkan ve kolona doğru uzanan ince bir sinir dalı bulun, ardından gangliona yakın siniri kesin. Bir sonraki adımdan önce, ısıtma banyosunu açın ve Krebs çözeltisini 34 santigrat derecede tutun. Şimdi, diseksiyon mikroskobu altında önceden çekilmiş bir cam pipeti inceleyin.

Elektrodun ucunu, kaydedilecek sinirin çapı ile uyumlu büyüklükte olacak şekilde bir pens ile kırın. Bunu takiben, ucu daha hafif bir parlamaya yakın yerleştirerek eğim verin. Bu metodolojide yeni olan, elektrotun ucunu sinirin boyutuyla uyumlu bir şekilde eğimlendirmeyi de zor bulabilir.

Ardından, eğimli elektrodu elektrot tutucusuna yerleştirin, ardından elektroda negatif veya pozitif basınç uygulamak için tutucunun yan portuna 10 mililitrelik bir şırınga bağlayın. Bundan sonra, tutucuyu biyo amplifikatörün baş aşamasına bağlayın ve kafa aşamasını bir manipülatöre monte edin. Bunu takiben, elektrodu doku banyosuna taşıyın ve tutucunun gümüş teline temas edene kadar hafifçe emme uygulayarak elektrodu Krebs solüsyonu ile doldurun.

Daha sonra, elektrot ucunu sinirin kesilen ucuna yakın bir yere yerleştirin ve siniri elektrotun içine emmek için negatif basınç uygulayın. Daha sonra, daha fazla negatif basınç uygulayın, böylece sinirin yaklaşık bir milimetresi elektrot içine çekilir ve sıkı bir sızdırmazlık oluşturur. Şimdi, biyo amplifikatörü açın ve filtreyi 300 ila üç bin hertz'e ayarlayın.

Osiloskop üzerindeki sinyali izleyin ve sinir sinyalini ve intraluminal basınç sinyalini spike veri işleme yazılımına kaydedin. Ardından, sürekli olarak intraluminal olarak infüze ederken çıkış kanülü üzerindeki üç musluğu kapatarak kolonun ramp distansiyonunu uygulayın. İntraluminal basıncı 60 milimetre cıvaya ulaşana kadar izleyin, ardından boşaltma kanülündeki üç musluğu açın.

Bu işlemi on beş dakikalık düzenli aralıklarla tekrarlayın ve afferent sinirlerin kimyasal duyarlılığını test etmek için ilaçları ekstra veya intralüminal olarak uygulayın. İşte ex vivo tüp kolorektum hazırlığı için deneysel düzeneğin şematik gösterimi, bir sinir distalinden pelvik gangliona temsili bir kayıt ile. Normal sıçanlardan elde edilen preparatlarda, kolonik afferent sinirler tipik olarak düşük bir düzenli spontan aktivite seviyesine sahiptir.

Kolonun rampa distansiyonu, ateşleme hızında kademeli bir artışa neden olur. Her sinirin mekanosensoriyel özelliği, intraluminal basınç afferent sinir yanıt eğrisinin çizilmesiyle temsil edilir. Alternatif olarak, pelvik gangliona proksimaldeki pelvik sinirlerin bir dalından kayıt yapılabilir.

Proksimal pelvik sinirlerin mekanosensoriyel aktivitesinin profili genellikle pelvik ganglionun distalindeki sinirde görülene benzer. Çok birimli kayıttan aksiyon potansiyellerinin dalga biçimlerinin temel bileşen analizi, tek birim aktivitesini ayırt etmek için yapılabilir. İşte iki ayrı pelvik afferenin üst üste binen dalga formları.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, majör pelvik gangliyonların ve diğer sinirlerin anatomisini iyi anlamalı ve sinirleri incelemek ve afferent aktiviteyi kaydetmek için gangliyonları bulabilmelisiniz. Bu protokolün bir avantajı, pelvik ve splanknik afferent sinirlerin elektrofizyolojik özelliklerinin ve farmakolojik profillerinin karşılaştırılmasına izin verebilmesidir.