Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

Bu prosedürün genel amacı, basit, hızlı ve ekonomik bir yöntem kullanarak in vivo benzeri astrosit monokültürleri üretmektir. Bu yöntem, astrositin fiziksel salınımının veya alımının ekonomisi gibi astroglibiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ortaya çıkan hücrelerin morfoloji, mRNA ve protein ekspresyonu ve hücreler arası kalsiyum dalgalanmaları ile in vivo astrositlere çok benzemesidir.

Bu işleme başlamak için, diseksiyon ortamı ile doldurulmuş iki adet 10 cm'lik petri kabını laminer akışlı bir diseksiyon başlığına buz üzerine yerleştirerek diseksiyon alanını hazırlayın. İzole edilecek her beyin bölgesi için, 14 mL diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Ardından, diseksiyon aletlerine %70 etanol püskürtün ve bunları başlıktaki diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin.

Embriyonik doku ile çalışılıyorsa, önce embriyoları rahimden çıkarın ve embriyonik keseleri açın. Hemen kafaları makasla kesin. Tüm kafalar kesildiğinde, bunları önceden soğutulmuş diseksiyon ortamına aktarın.

Kafalar ortama batırıldıktan sonra, cildi ve kafatasını forseps ile açın ve beyinciği sıkıştırın. Sonra beynin geri kalanını dikkatlice yukarı kaldırın ve kafatasından çıkarın. Bundan sonra, korteksi alttaki orta beyin yapısından ayırın.

Forsepsleri hemisferler arasındaki uzunlamasına çatlağın içine yerleştirin ve her bir hemisferi serbest bırakmak için bir hemisferin korteks ve orta beyin yapıları arasında hareket ettirin. Daha sonra, her yarım küreden tüm meninksleri çıkarın ve hipokampusları ayırın. Hipokampal astrositler gerekliyse, her hipokampusu buz üzerinde 14 mL diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın.

Bundan sonra, astrositler üretmek için kullanılacak herhangi bir kortikal dokuyu bir mililitre küpten daha büyük olmayan parçalar halinde kesin. Daha sonra tüm kortikal doku parçalarını buz üzerinde diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 15 mL'lik ayrı bir tüpte toplayın. Tüm doku parçaları toplandıktan sonra, tüpün dibine çökmelerini bekleyin.

Ardından mümkün olduğunca fazla ortamı aspire edin. Bunu takiben, 2-3 mL% 0.05 tripsen EDTA ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derece su banyosunda yirmi dakika inkübe edin. Daha sonra, tripsen EDTA'yı dikkatlice aspire edin ve doku parçalarını tüpün dibinde minimum miktarda sıvı içinde bırakın.

Daha sonra, kalan tripsen EDTA'yı yıkamak için 5 mL önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ekleyin ve doku parçalarının karıştırılmasını sağlamak için üst tüpün yan tarafına pipetleyin. Daha sonra diseksiyon ortamını aspire edin ve doku parçalarını mümkün olduğunca az sıvı içinde bırakın. Bu yıkama adımını önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ile iki kez tekrarlayın.

Son yıkama adımından sonra, 1 mL oda sıcaklığında D-Mem Plus ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu ezin. Astrositler pH'a karşı oldukça hassastır, bu nedenle çözeltinin pH'ını değiştirebileceğinden kabarcık üretmekten kaçınmak önemlidir. Ardından, 50 mL'lik bir tüpün ağzına 100 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve filtreyi önceden soğutulmuş D-Mem Plus ile 4,5 mL ile önceden ıslatın.

Ayrışmış doku süspansiyonunun 1 mL'sini hücre süzgecine pipetleyin ve hücreleri yıkamak için 4,5 mL daha önceden soğutulmuş D-Mem Plus ekleyin. Diseksiyondan sonraki in vitro yedinci günde, D-Mem Plus'taki hücreli 10 cm'lik tabakları inkübatördeki bir çalkalayıcıya yerleştirin ve bulaşıkları 6 saat boyunca 110 RPM'de çalkalayın. Altı saatlik çalkalamanın bitiminden 20 ila 30 dakika önce, su banyosunda 1 XPBS, D-Mem Plus, NB + H ve% 0.25 EDTA'yı 37 dereceye kadar ısıtın.

6 saat çalkaladıktan sonra, kültür kaplarını çalkalayıcıdan çıkarın ve ortamı hemen tabak başına 10 mL önceden ısıtılmış 1 XPBS ile değiştirin. Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve tabak başına 3 mL önceden ısıtılmış tripsen EDTA ekleyin. Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede dört dakika inkübe edin.

Western Blot veya RNA dizilimi için numune hazırlıyorsanız, Tripsen EDTA eklemeyin. Bunun yerine, PBS'yi 12 mL önceden ısıtılmış NB + H ile değiştirin, ardından kültürler inkübatöre geri yerleştirilebilir. Ardından, her tabakta 3 mL tripsen EDTA'ya 5 mL önceden ısıtılmış D-Mem Plus ekleyin.

Hücreleri tabaktan pipetleyin ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Bundan sonra, hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 20 santigrat derecede 3220 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve hücre damağını 1 mL önceden ısıtılmış NB + H içinde yeniden süspanse edin.

Bu görüntüler, G-kampına transdüksiyonlu ausam astrositlerinin, ince süreçler de dahil olmak üzere astrosit ağları boyunca spontan kalsiyum iyonu olayları sergilediğini göstermektedir. Burada, bir kalsiyum iyon dalgası, açık rengin yüksek kalsiyum iyonu konsantrasyonlarına sahip alanları ve siyah alanların ekstra hücresel bölgeleri temsil ettiği farklı zaman noktalarının görüntülerinde soldan sağa birkaç astrositten geçer. Bu grafikte, bir kalsiyum iyonu sinyal dalgasının birkaç astrosite nasıl yayıldığını gösteren, G-camp floresan yoğunluk izleri olarak gösterilen renk kodlu bölgelerde zaman içinde kalsiyum iyonu konsantrasyonu değişir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat on beş dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, astrosit zarlarında hangi olayların meydana geldiği gibi ek soruları yanıtlamak için transfeksiyon veya viral transdüksiyon deneyleri ile birlikte yaşam hücresi görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo benzeri astrosit motor kültürlerini basit, hızlı ve ekonomik bir şekilde nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.