Name: Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Öğrenin, AWESAM protokolünü kullanarak fare astrositlerini hızlı ve ekonomik bir şekilde izole edip kültürlemeyi. Bu yöntem, in vivo benzeri kalsiyum sinyalleşmesi ve gen ekspresyonu profilleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Avrupa Araştırma Konseyi (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 ve SFB889) fon kabul.

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri Alman hayvan refahı için kurallar uyarınca gerçekleştirilmiştir.
Not: Zaman çizelgesi ve protokol ana adımları şekil 1' de gösterilmiştir.
1. hazırlıkları
<ol><li>
Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
	<ol>
<li>DMEM + poligonal MD astrocytes kültür için hazırlamak: % 10 FCS, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile DMEM.</li>
		<li>NB + H Yildiz Seklinde astrocytes kültür için hazırlamak: 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 ek, 1 x glutamin takviyesi, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile neurobasal orta. Not: HBEGF daha yüksek konsantrasyonlarda Aliquots hazırlanan ve gerektiğinde Orta olarak eklenecek-20 ° C'de depolanan.</li>
		<li>Diseksiyon orta (10 mM HBSS HEPES) hazırlayın.</li>
		<li>Aliquots 6-7 ml % 0.05 tripsin-EDTA ve 6-7 mL % 0.25 tripsin-EDTA 15 mL tüpler hazır olun. Bunlar-20 ° C'de depolanan ve bir 37 ° C su Banyosunda çözdürülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İletişim kuralı, başlamadan önce gün 10 cm doku kültürü tedavi bulaşıkta %0,04 polyethylenimine (PEI) her 5 mL kat.</li>
	<li>Ertesi gün, PEI kaldırmak ve iki kez deiyonize, distile su ile bulaşık. DMEM + 12 mL her plakasına ekleyin ve hücreleri kaplama daha önce 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka için en az 30 dk önceden equilibrate.</li>
	<li>Diseksiyon alan hazırlamak: bir laminar akış diseksiyon başlık, yer iki 10 cm Petri yemekler diseksiyon orta buz dolu. Her beyin alanını için izole (örneğin, korteks, Hipokampus), 15-tüp 14 mL diseksiyon orta ile dolu hazırlamak ve buz üzerinde tutun. Diseksiyon araçları (iyi makas, Dumont #3 ve #5 forseps) % 70 etanol ve yere karar diseksiyon mikroskop kapüşonlu ile sprey.</li>
</ol>2. fare veya fare beyin diseksiyon
Not: Her iki fareler ve sıçanlar-ebilmek var olmak kullanılmış. P8-da var olmak kullanılmış daha yaşlı hayvanlar (biz P12 kadar test), ama meninkslerde kaldırma giderek daha zor olacak. Beyin hücreleri büyük hayvanlardan karmaşık işlemler ve doku ayrılma, artan hücre ölümüne giden sırasında kırılabilir bağlantıları kurdu beri Ayrıca, hücre verim ve sağlık, azalacak. Kortikal hazırlıkları burada açıklanan, ancak diğer beyin bölgeleri de kullanılabilir.
<ol><li>% 0.05 tripsin-EDTA bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin.</li>
	<li>Hayvanlar (gebe rats E19 pups veya P0-P8 hayvanlar için) yavaş yavaş CO2 konsantrasyonu yükselterek ötenazi ve beyin yalıtır. Aşağıdaki adımları steril tekniği gerektirir.</li>
	<li>
Eğer embriyonik dokuyla çalışma, önce embriyoların rahim kaldırın ve embriyonik keseleri açın sonra hemen kafalarını makasla kesme. Tüm başkanları kesilir, onları önceden soğutulmuş diseksiyon orta aktarın.
	<ol>
<li>Bir kez belgili tanımlık mezartaşı ortamda batık, forseps ve beyincik kapalı çimdik cilt ve kafatası (her ikisi de çok genç hayvanlarda yumuşak) açın. Dikkatle kolu yukarı ve dışarı kafatası beyin geri kalanı. Not: 2-4 E19 embriyo kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eski veya yeni doğan yavruları için kafalarını makasla kesmek ve hemen cilt kafasının arkasından düz bir çizgi burnun ucu için kesim tarafından beyin yalıtır. Kafatasının sol ve sağ, sonra kafatası kemik Asansör bir kenara ve dikkatle kesilmiş deri çek. Beyincik kesme ve yukarı ve dışarı kafatası beyin diğer kol. Not: 2-3 P0-P8 pups kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.</li>
	<li>Korteks temel orta yapısından ayrı. Forseps hemisferlerin arasında boyuna çatlak içinde yer sonra hareket forseps bir Yarımküre (boyuna çatlak dikey) korteks ve orta yapıları arasında her hemisphere ücretsiz çimdik için.</li>
	<li>Forseps kullanarak her hemisphere (ve onun Hipokampus) tüm meninkslerde çıkarın, sonra hippocampi ayrı. Hipokampal astrocytes gerekiyorsa, her Hipokampus 14 mL diseksiyon orta buz dolu bir 15 mL tüp içine taşıyın.</li>
	<li>Özel bölgeler gerekli (örneğin, frontal korteks) daha fazla alanlarda her hemisphere'nın korteks kaldırın. 1 mm3daha büyük parçalara astrocytes oluşturmak için kullanılacak kortikal herhangi bir doku kes. Diseksiyon orta buz dolu ayrı bir 15 mL tüp kortikal doku tüm parçaları toplamak.</li>
</ol>3. doku sindirim ve ayrılma
<ol><li>Bir kez tüm doku parçaları toplanır, tüp altına yerleşmek bekleyip sonra mümkün olduğu kadar orta Aspire edin.</li>
	<li>2-3 mL % 0.05 tripsin-EDTA serolojik pipet kullanarak ekleyin ve 20 dakika 37 ° C su banyosu tüplerde kuluçkaya. Not: tüm tripsin-EDTA hızla doku parçaları karıştırın ve tekrar yerleşmek için izin vermek için pipet üzerinden yayın.</li>
	<li>Dikkatle tripsin-EDTA, tüpün dibinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak doku parçalar halinde bırakarak Aspire edin.</li>
	<li>Kalan tripsin EDTA yıkamak için önceden soğutulmuş diseksiyon orta 5 mL ekleyin. Üst kısmındaki doku parçaları karıştırma ulaşmak için tüp tarafına pipet.</li>
	<li>Diseksiyon orta Aspire edin ve doku parçalar halinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak bırakın. Önceden soğutulmuş diseksiyon orta iki kez daha fazla ile bu çamaşır tekrarlayın.</li>
	<li>Son yıkama adımdan sonra istimal DMEM + (oda sıcaklığına kadar ısındı) 1.000 µL pipet ucu ve triturate pipetting tarafından doku ve kabarcıklar tanıtımı olmadan aşağı 1 mL ekleyin. Not: bu-ebilmek değişmek belgili tanımlık eriyik, hangi astrocytes oldukça duyarlı olan pH gibi bu kabarcıklar, üreten önlemek önemlidir.</li>
	<li>50 mL tüp açılış 100 µm hücre süzgeç koyun ve önceden soğutulmuş DMEM + 4.5 mL filtresiyle önceden ıslak.</li>
	<li>Disosiye doku süspansiyon hücre süzgeç üzerine 1 mL pipette ve başka bir 4.5 mL ekleyin önceden soğutmalı hücreleri hücre süzgeç aracılığıyla yıkamak için + DMEM.</li>
</ol>4. hücre kaplama Passaging tarafından Astrocyte zenginleştirme için
<ol><li>Örneğin, hücreleri hücre süspansiyon 10 µL trypan mavi ile 10 µL sulandrarak ve karışımı bir hemasitometre üzerine pipetting saymak.</li>
	<li>12 mL DMEM + 10 cm çanak başına 500.000 hücrelerde plaka. Not: DMEM + astrositik büyüme için yararlıdır nöronlar veya microglia için daha çok. Sallayarak sırasında cam coverslips kuyu içinde hareket eden fiziksel güçleri çok bu 10 cm yemekleri (coverslips) olmadan oyunculuk daha güçlü. Hücreleri 24-şey Tabaklarda sarsıldı, onlar sağlıksız hale veya ölmek. Sadece plaka astrocytes sallayarak sonra 24-şey plakaları.</li>
	<li>Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 ' de yedi gün boyunca tutun.</li>
	<li>Gün 6, adım 5'te açıklandığı gibi kültür PEI kaplı plakalar gün sallayarak ve hücreleri, passaging önce hazırlayın.</li>
</ol>5. passaging hücreleri
<ol><li>
Bir gün önce passaging, hücre kültürü plakaları %0,04 PEI ile kat.
	<ol>
<li>İmmunocytochemistry, viral iletim veya plazmid transfection (her bir steril 12 mm veya 25 mm cam coverslip, sırasıyla içeren) 24-şey veya 6-şey tabak kullanın.</li>
		<li>Cam coverslips % 70 etanol en az 1 h için kuluçka tarafından sterilize etmek, sonra üç kere coverslips wells yerleştirmeden önce deiyonize, distile suda yıkayın.</li>
		<li>En az 70 µL %0,04 PEI başına 24-şey tabak 12 mm coverslip ve 600 µL %0,04 PEI 25 mm coverslip 6-şey tabak içinde başına ekleyin.</li>
		<li>Western blot ya da RNA-Seq analiz için zaten sonra diseksiyon hücreleri içeren 10 cm yemekleri kullanmaya devam edebilirsiniz. Yemekleri sadece sarsılmış gerekir, sonra hücreleri 1 x PBS ile yıkanmış ve NB + H ile tedavi (yeni yemekleri aktarmak).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün vitro (DIV) 7 sonra diseksiyon, 10 cm yemekleri hücreleri ile DMEM + bir laboratuvar shaker kuluçka üzerine yerleştirin ve yemekleri 6 h için 110 rpm'de sallamak.</li>
	<li>PEI deiyonize, distile su ile kaplı coverslips üzerinden kapalı iki kez yıkayın. NB + H orta plakaları (24-şey plakaları için ve iyi 6-şey plakaları için başına 2 mL başına 500 µL) ekleyin. Plakayı kuluçka 37 ° C ve 10 cm yemekleri titriyor iken % 5 CO2 veya en az 30 dk önceden equilibrate.</li>
	<li>20-30 dk 6 h sallayarak sona ermeden önceden 1 x PBS, DMEM +, NB + H ve % 0.25 tripsin-EDTA 37 ° c su banyosunda ısıtın.</li>
	<li>6 h sallayarak, kültür yemekleri shaker almak ve (içeren nöronlar sarsılmış kapalı, oligodendrocytes ve microglia) orta ile 10 mL yerini alması sonra çanak başına 1 x PBS önceden ısıttı. Not: Hemen yeniden bağlama astrositik olmayan hücreleri önlemek için ayrılmış hücreleri içeren eski orta Aspire edin önemlidir.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 3 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çanak başına ekleyin. Her yemeğin 4 dk. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka için kuluçkaya. Not: Western blot veya RNA-Seq için numune hazırlama, tripsin-EDTA ekleyerek değil. Bunun yerine, eski yerine koymak PBS 12 mL ile NB + H, sonra da kuluçka makinesine kültürler yerleştirilebilir önceden ısındı.</li>
	<li>5 Önceden ısıtılmış DMEM + 3 mL tripsin-EDTA her için çanak, hücreleri 5 mL serolojik pipet kullanarak çanak dışına pipette ve hücre süspansiyon 50 mL tüp içinde toplamak mL ekleyin. Not: Pipet çanak - altından doğrudan kat yemeğin hücreleri ayırmak gibi daha net hale gelmelidir. Serum tripsin inaktive gibi sadece serum içeren orta (yerine DMEM +), kullanın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 3,220 x g 4 dk 20 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve resuspend hücre Pelet 1 ml NB + H önceden ısıttı.</li>
</ol>6. hücre kaplama son Astrocyte kültürler için
<ol><li>Hücreleri saymak.</li>
	<li>6-iyi tabak (ortamda 2 mL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 20.000 hücre veya 24-şey tabak (ortamda 500 µL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 5000 hücre plaka.</li>
	<li>Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 de daha ileri tedavi veya analiz kadar tutun.</li>
	<li>Yarım orta haftada bir değişimi. Not: Düşük besin ortamlarda Proliferasyona astrocytes durmak ama her ne kadar (deneyim, yok microglia AWESAM kültürde ortaya çıktı) kalan herhangi bir microglia çoğalırlar. Yarım orta bir kez bir hafta herhangi bir potansiyel olarak kalan microglia8zenginleştirme engeller ve monocultures en az üç hafta boyunca sağlıklı kalmak alışverişi.</li>
</ol>

<ol><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2%2B+signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26(2007).</li>
<li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li>
<li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li>
<li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes%3A+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protokol içinde dört adım kritik: 1) konsantrasyonu küçük artışlar olgunlaşmamış kültürler için örneğin, neden olabilir beri tam 5 ng/ml, HBEGF konsantrasyon hazırlanıyor 10 ng/mL HBEGF astrocytes4; de-ayırt 2) doku veya pH değiştirebilir ve astrocyte sağlık engel hücreleri içeren çözümler kaçınmak kabarcıkları; 3) en uygun pH ve sıcaklık sağlıklı astrocytes büyüyen için elde etmek için ortam sıcaklığına önceden; 4) (hiçbir microglia bulundu, ancak AWESAM kültürlerde defa) sadece yarısı o...

Astrocytes trofik desteği, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite ve hücreler arası iletişim - tüm bunların etrafında ince astrositik süreçleri Merkezi mekanizmalar aracılığıyla beyin fonksiyonlarını etkiler. Burada açıklanan AWESAM Protokolü nöronlar ve yararlı örneğin, birçok protein ve hatta Ca2 + sinyal ifadesi farklı beyin hücre boyunca örtüşme olan diğer glia müdahale olmadan bu süreçlerin çalışma sağlar türleri. Ayrıca, bu yöntem daha önce kullanılan tekniklerin sınırlamalar üstesinden gelir. Özellikle, vivo içindebizim iletişim kuralı sağlar-Morfoloji (Yildiz Seklinde astrocytes ince süreçleri ile) ve bir hızlı, kolay, gen ekspresyonu ve ucuz şekilde gibi.
Doğrudan hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve birçok diğer düzenleyici işlemler çevre tarafından etkilenmiştir. Bir kültür tabak içinde bu faktörler tarafından çevreleyen hücreleri, aynı zamanda hangi hücreleri yetiştirilmektedir orta serbest ifade eder. Astrocytes, HBEGF bir Yildiz Seklinde Morfoloji1 ikna etmek için daha önce bildirildi ancak aynı zamanda astrocytes2de-ayırt etmek için bulunamadı. Ancak, düşük konsantrasyonlarda HBEGF, daha sonra daha fazla vivo içindeoluşturmak için kullanılmıştır-RNA sıralama iki farklı protokol3,4ile tanımlandığı gibi hangi tarihlerde astrocytes. Ayrıca, bağımsız olarak protokolü4orta bileşimi ile astrocyte Morfoloji değiştirir: Neurobasal orta HBEGF bir düşük konsantrasyon ile diğer Orta besteleri (örneğin, süre Yildiz Seklinde astrocytes yetiştirmek için en uygun Serum DMEM içeren) poligonal hücrelerde (hatta astrocytes taze immunopanning tarafından izole) üretmek.
AWESAM Protokolü dezavantajları astrocyte monocultures4büyüyen için önceki teknikleri üstesinden gelir. Astrocyte monocultures büyüyen için önceki teknikleri var aşağıdaki dezavantajları: Yildiz Seklinde astrocytes vivo içinde (MD yöntemi)5/; alışılmadık poligonal Morfoloji uzunluk ve maliyet (astrocytes İndüklenmiş pluripotent kök hücreler alır üzerinden üç ay hazırlık ve pahalı büyüme faktörleri de dahil olmak üzere birçok reaktifler gerektirir) Protokolü'nün6; malzeme (immunopanning yöntemi)3düşük miktarda; ve astrocytes de-farklılaşma ve gereksinimi 3D matris (Puschmann ve ark.) 1 , 2. buna ek olarak, AWESAM Protokolü sağlar: vivo-tarihlerde Morfoloji (ince süreçleri ile Yildiz Seklinde astrocytes); hızlı, kolay ve ucuz yöntemi; malzeme büyük miktarlarda; ve en vivo içinde-gen ekspresyonu immunopanned ve MD astrocytes ile karşılaştırıldığında hangi tarihlerde. Ayrıca, Ca2 + sinyal ve vezikül ince işlemler ve olaylar membran yakın geri dönüşüm çalışması için 2D kültür sağlar (örneğin, TIRF mikroskobu 3D kültürlerde mümkün değildir).
MD yöntemi yayımı 19805poligonal astrocyte monocultures teknik bir basit ve hızlı sunan, beri yaygın olarak kullanılmış. Kısacası, MD yöntemi (FCS) fetal buzağı Serumda büyüyen karışık beyin hücreleri üzerine kuruludur-DMEM, içeren takip (olarak diğer tüm beyin hücresi türleri çanak ayırmak) için astrocytes zenginleştirmek ve daha fazla kültür aynı ortamda basamaklarının sallayarak. FCS ile desteklenmiş DMEM farklı kanser hücre satırlarına tüm bunların MD astrocytes kültür tarafından sergilenen poligonal Morfoloji paylaşmak, fibroblastlar ve adiposit arasında değişen birçok hücre tipleri için kullanılır. Kadar erken 2000'lerde7, küçük düşünce olmuştu astrocytes için uygun bir ortama verilen, özellikle onların tipik Yildiz Seklinde Morfoloji lehine içinde vivobuldu. 2011 yılında yayınlanan bir protokol ulaşmak böyle Yildiz Seklinde Morfoloji: immunopanning yöntemi olarak adlandırılan, serum-Alerjik orta astrocytes3kültür için en iyi duruma getirilmiş kullanır. Bu yöntemi kullanarak, taze izole beyin hücreleri bir dizi hücre türüne özgü hücre yüzey proteinleri astrocytes için zenginleştirmek için hedef antikorlar ile kaplı yemekleri sunulur. Daha fazla vivo içinderağmen-immunopanned astrocytes morfoloji ve ifade profil gibi vitro çalışmalar çoğunluğu hala MD astrocyte yönteme güvenmek. İmmunopanning yöntemi daha karmaşık ve zaman alıcı adımlar kültür ilk gününde kapsar MD yöntemi basit ve hızlı, iken (uzun enzim sindirim süre gibi çözümleri farklı yoğunluk, immunopanning kendisi, dikkatli katmanlama ve çeşitli aralıklarla adımlar - kaplama tüm önce). Ancak, daha özel orta kullanarak, AWESAM yöntemi her iki hızını MD yöntemi ve in vivosunar-tarihlerde immunopanning Protokolü morfolojisi.
Genel olarak, AWESAM Protokolü daha fazla vivo içindeçalışmak için yararlıdır-tarihlerde astrocytes 2D monocultures neurons ve diğer glia (immunostainings, immunoblots ve RNA sıralama tarafından daha önce karakterize4 ) olarak izole içinde. Bu ince astrositik işlemler çalışma için izin verir ve spontan Ca2 + sinyal ve olaylar (tarafından TIRF mikroskobu görüntüsüörneğin,) membran yakın görüntülenmesi için büyük erişilebilirlik sağlar.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>37 &ampm'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>%0.25 tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>37 & Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X stok</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X stok</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 stok; penisilin: 5000 U/ml; streptomisin: 5000 ve mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>L-glutamin</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td> HBSS Gibco 14170112 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &mu; m naylon hücre süzgeci</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i hücre kültürü inkübatörü</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar çalkalayıcı</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&nbsp;</td><td>Hücre kültürü inkübatörünün içinde kullanın</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz awesam iletişim kuralını kullanarak fare astrocytes

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

AWESAM (bir low- easy stellate birstrocyte malınan mal) protokolü üzerine kuruludur vivo içindebüyük miktarlarda üretmek için hızlı, basit ve ucuz bir yol-fare ve sıçan astrocyte monocultures hangi tarihlerde : Beyin hücreleri farklı beyin bölgelerden izole olabilir ve hücre kültürü bir hafta sonra astrositik olmayan hücreleri bir shaker kuluçka 6 h için Tarih kültür yemekleri yerleştirerek sarsılmış. Kalan astrocytes sonra yeni kalıplara (NB + H olarak adlandırılan) bir astrocyte özgü orta ile pasajlı. NB + H heparin bağlama EGF benzeri büyüme faktörü (HBEGF), serum orta yerine kullanılan düşük konsantrasyonlarda içerir. NB + H içinde büyüyen sonra AWESAM astrocytes Yildiz Seklinde bir morfoloji ve özellik iyi işlemler var. Dahası, bu astrocytes daha fazla vivo içindevar-tarihlerde gen ekspresyonu daha önceden yayınlanmış yöntemlerle üretilen astrocytes. CA2 + görüntüleme, vezikül dinamikleri ve diğer olaylar membran yakın böylece iyi astrositik süreçleri vitroiçinde canlı hücre confocal veya TIRF mikroskobu kullanarak örneğin, okudu olabilir. Özellikle, AWESAM astrocytes da astrocytes içinde vivoiçin benzer sinyal spontan Ca2 + sergi.

Nöronlar ile birlikte kültürlü ve NB + ortamda yetiştirilen astrocytes 2 hafta sonra kültür (Şekil 2) Yildiz Seklinde görünür. NB + orta ek olarak, ortak kültür astrocytes de büyük olasılıkla onların hayatta kalma ve Morfoloji katkıda bilinmeyen nöron kaynaklı faktörler maruz kalır. Buna ek olarak, MD astrocytes DMEM + (diğer hücre tipleri geçiş önce kapalı sallayarak sonra) monocultures yetiştirilen 2 hafta sonra poligonal görünür. AWESAM astrocytes sallayar...

Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Bu prosedürün genel amacı, basit, hızlı ve ekonomik bir yöntem kullanarak in vivo benzeri astrosit monokültürleri üretmektir. Bu yöntem, astrositlerin fiziksel salınımı veya alımının ekonomisi gibi astroglibiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, elde edilen hücrelerin morfoloji, mRNA ve protein ekspresyonu ile hücreler arası kalsiyum dalgalanmaları açısından in vivo astrositlere yakından benzemesidir.Bu prosedüre başlamak için, diseksiyon ortamı ile doldurulmuş iki adet 10 cm'lik petri kabını buz üzerinde, laminer akışlı bir diseksiyon kabinine yerleştirerek diseksiyon alanını hazırlayın. İzole edilecek her bir beyin bölgesi için 14 mL diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Ardından, diseksiyon aletlerini %70 ethanol ile püskürtün ve kabin içindeki diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin.Embriyonik doku ile çalışılıyorsa, önce embriyolar uterusun içinden çıkarılır ve embriyonik keseler açılır. Hemen ardından, başlar makasla kesilerek ayrılır. Tüm başlar kesildiğinde, önceden soğutulmuş diseksiyon ortamına aktarılır.Başlar medyumun içine daldırıldıktan sonra, pens yardımıyla deri ve kafatasını açın ve serebellumu kopararak çıkarın. Ardından, beynin geri kalan kısmını dikkatlice kanırtarak kafatasından dışarı çıkarın. Bundan sonra, korteksi alttaki orta beyin yapısından ayırın.Penseti hemisferler arasındaki longitudinal fissüre yerleştirin ve her bir hemisferi serbest bırakmak için penseti bir hemisferin korteksi ile orta beyin yapıları arasına doğru hareket ettirin. Ardından, her iki hemisferden tüm meningesleri temizleyin ve hippokampusları ayırın. Hippokampal astrositlere ihtiyaç duyuluyorsa, her bir hippokampusu buz üzerinde 14 mL diseksiyon medyumu ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın.Bundan sonra, astrosit üretmek için kullanılacak kortikal dokuyu bir kübik mililitreden büyük olmayacak parçalara ayırın. Ardından, tüm kortikal doku parçalarını buz üzerinde diseksiyon medyumu ile doldurulmuş ayrı bir 15 mL tüpte toplayın. Tüm doku parçaları toplandıktan sonra, tüpün dibine çökmelerini bekleyin.Ardından, mümkün olduğunca fazla besiyerini aspire edin. Bunu takiben, 2-3 mL %0,05 tripsen EDTA ekleyin ve örnekleri 37 °C'lik su banyosunda yirmi dakika inkübe edin. Sonrasında, tripsen EDTA'yı dikkatlice aspire ederek tüpün dibinde doku parçalarını minimum miktarda sıvı içinde bırakın.Ardından, kalan tripsen EDTA'yı yıkamak için 5 mL önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ekleyin ve doku parçalarının karışmasını sağlamak için üst tüpün kenarına pipetleyin. Sonra, diseksiyon ortamını aspire edin ve doku parçalarını mümkün olduğunca az sıvı içinde bırakın. Bu yıkama adımını önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ile iki kez tekrarlayın.Son yıkama adımından sonra, 1 mL oda sıcaklığında D-Mem Plus ekleyin ve hava kabarcığı oluşturmadan pipetleme yaparak dokuyu tritüre edin. Astrositler pH'a karşı oldukça hassastır, bu nedenle çözeltinin pH'ını değiştirebileceği için kabarcık oluşumundan kaçınmak önemlidir. Ardından, 50 mL'lik bir tüpün ağzına 100 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve filtreyi 4,5 mL ön soğutulmuş D-Mem Plus ile önceden ıslatın.Hücre süzgeci üzerine 1 mL ayrıştırılmış doku süspansiyonu pipetleyin ve hücreleri süzmek için üzerine 4,5 mL önceden soğutulmuş D-Mem Plus ekleyin. Diseksiyondan sonraki yedinci in vitro günde, içinde D-Mem Plus bulunan hücreli 10 cm'lik kapları inkübatördeki bir çalkalayıcıya yerleştirin ve kapları 6 saat boyunca 110 RPM hızında çalkalayın. Altı saatlik çalkalama süresinin bitiminden 20 ila 30 dakika önce; 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H ve %0,25 tripsen EDTA'yı su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.6 saatlik çalkalamanın ardından, kültür kaplarını çalkalayıcıdan çıkarın ve ortamı derhal kap başına 10 mL önceden ısıtılmış 1 XPBS ile değiştirin. Ardından, PBS'yi uzaklaştırın ve kap başına 3 mL önceden ısıtılmış tripsin EDTA ekleyin. Daha sonra örnekleri 37 °C'de dört dakika boyunca inkübe edin.Western Blot veya RNA sekanslama için örnek hazırlıyorsanız, Tripsen EDTA eklemeyin. Bunun yerine, PBS'yi 12 mL önceden ısıtılmış NB+H ile değiştirin; ardından kültürler tekrar inkübatöre yerleştirilebilir. Sonrasında, her bir kaba 3 mL tripsen EDTA'ya 5 mL önceden ısıtılmış D-Mem Plus ekleyin.Hücreleri kap aktan pipetle çekin ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Ardından, hücre süspansiyonunu 20 °C'de 4 dakika boyunca 3220 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve hücre pelletini 1 mL önceden ısıtılmış NB+H içerisinde yeniden süspande edin.Bu görüntüler, G-camp transdüksiyonu uygulanmış ausam astrositlerin, ince uzantılar da dahil olmak üzere astrosit ağları genelinde spontan kalsiyum iyonu olayları sergilediğini göstermektedir. Burada, farklı zaman noktalarına ait görüntülerde, bir kalsiyum iyonu dalgasının soldan sağa doğru birkaç astrosit boyunca ilerlediği görülmektedir; açık renkli bölgeler yüksek kalsiyum iyonu konsantrasyonlarını, siyah alanlar ise hücre dışı bölgeleri temsil etmektedir. Bu grafikte, renk kodlu bölgelerdeki kalsiyum iyonu konsantrasyonu değişimleri, G-camp floresan yoğunluk izleri şeklinde zamanla gösterilerek, bir kalsiyum iyonu sinyal dalgasının birkaç astrosit boyunca nasıl yayıldığı örneklendirilmektedir.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir saat on beş dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, astrosit membranlarında hangi olayların meydana geldiği gibi ek soruları yanıtlamak için transfeksiyon veya viral transduksiyon deneyleri ile kombine edilmiş canlı hücre görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo benzeri astrosit motor kültürlerinin basit, hızlı ve ekonomik bir şekilde nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

culturing-vivo-like-murine-astrocytes-using-fast-simple-inexpensive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, sıçan korteksinden birincil astrositleri kültürlemek için bir tekniği göstermektedir. Korteks, homojen bir glial hücre süspansiyonu elde etmek için mekanik olarak ayrışır, bu daha sonra astrositlerin seçici proliferasyonunu teşvik etmek için polipeptit kaplı plakalar üzerine kaplanır. Daha sonra, astrositler enzimatik olarak plakalardan ayrılır ve saf astrositlerin kültürüne izin vererek taze ortama aktarılır.

Bir Sıçan Yavrusu Beyninden Birincil Astrosit Kültürü Oluşturma

Video, murin astrositlerini diğer beyin hücrelerinden izole etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Kültürleme sırasında, astrosite özgü ortam kullanarak ve astrositik olmayan hücrelerin yapışmasını inhibe ederek, yöntem astrositleri seçici olarak kültüre eder. Bu kültürlenmiş astrositler, ince süreçlerle yıldız morfolojisi sergiler.

Murin astrositlerini izole etmek ve kültürlemek için basit bir teknik

Bu video, faktörleri nöronlara dönüştüren astrositlerin doğrudan yeniden programlanmasını göstermektedir. Transformasyon faktörleri, astrositten nörona dönüşümü kolaylaştıran bir dizi moleküler olayı tetikler. Süreç, bir nöronal farklılaşma ortamı yoluyla spesifik ajanlar ve takviyeler sağlanarak daha da desteklenir.

Fare Astrositlerinin Nöronlara Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Burada, hSOD1G93A sıçan modelinde amiyotrofik lateral sklerozun patofizyolojisi üzerine araştırmalar için hücre içi Ca2+'nın hızlandırılmış video görüntülemesi için sıçan kortekslerinden glial hücrelerin, astrositlerin ve mikrogliaların primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağına dair bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Öğrenin, AWESAM protokolünü kullanarak fare astrositlerini hızlı ve ekonomik bir şekilde izole edip kültürlemeyi. Bu yöntem, in vivo benzeri kalsiyum sinyalleşmesi ve gen ekspresyonu profilleri sunar.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

Daha fazla video keşfet