Name: Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Keşfedin, insan hücrelerinde retinoblastoma proteininin SUMOilasyonunu endojen ve ekzojen koşullarda nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, hücre süreçlerini düzenleyen protein modifikasyonlarını incelemek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada bilim ve teknoloji Komisyonu Shanghai (Grant No. 14411961800) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (Grant No. 81300805) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. algılama, endojen Rb SUMOylation erken G1 faz <ol><li>hücre kültür ve hücre döngüsü eşitleme.
	<ol><li>Büyüme orta Dulbecco içeren hücrelerde korumak HEK293 &#39; s % 1 kalem-Strep ve % 10 fetal sığır serum (FBS) 37 ° C ve % 5 CO 2 bir kuluçka adlı ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).</li>
		<li>HEK293 hücreleri G0 aşamasında eşitleyin.
		<ol><li>Sayısı 15 cm hemasitometre ve tohum ~1.5 x 10 7 hücreleri kullanarak HEK293 hücreleri ile tedavi öncesi 24 h için 25 ml büyüme orta çanağı. Orta ve yıkama % 70 - % 80, aspiratı izdiham ulaştıktan sonra hücreleri iki kez 5 mL ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) prewarmed.</li>
			<li>Ekle 25 mL % 1'i içeren DMEM penisilin-streptomisin ve 72 h. yıkamak için hücreleri 3 mL buz gibi PBS kullanarak plaka dışına 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Hücreleri yeni bir 5 mL tüp içine transfer.</li>
			<li>Akış Sitometresi (Adım 1.2) tarafından hücre döngüsü analizi için hücreleri küçük bir bölümünü konu; 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de Santrifüjü tarafından kalan çoğunluk hücre toplama ve sonra onları analiz kadar bir ultra-düşük sıcaklık dondurucuda saklayın Rb SUMOylation,.</li>
		</ol></li> <li>G1-faz elde etmek için hücreleri G0 eşitleme işleminin sonunda DMEM kaldırın ve geri taze büyüme orta, böylece HEK293 hücreleri hücre döngüsü yeniden girmek izin ekleyin. Daha sonra farklı G1 aşamaları, hücreleri toplamak (erken G1: 30 dk; G1: 2 h) analizi ve daha fazla SUMO hücre döngüsü için tahlil.</li>
		<li>HEK293 hücre çift-timidin blok yöntemini kullanarak S aşamasında eşitleyin.
		<ol><li>Bir confluency % 50 ve yıkama hücrelere büyümek HEK293 hücre prewarmed PBS ile. Daha sonra büyüme orta ile 2.5 mM timidin 18 h (ilk blok) için takıma ekleyin.</li>
			<li>Timidin içeren orta kaldırın ve sonra hücreleri iki kez prewarmed PBS ile yıkayın. Taze büyüme orta hücreleri serbest bırakmak 14 h için eklemek.</li>
			<li>Bir pipet ile orta atmak ve hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce büyüme orta 2.5 mM timidin için başka bir 18 h (ikinci blok) ile takıma ekleyin.</li>
		</ol></li> <li>G2/M için senkronizasyon, plaka ~1.5 × 10 7 HEK293 hücreleri ile 25 mL büyüme orta 24 h için 15 cm çanak için. 400 ng/mL nihai bir konsantrasyon elde edilir kadar nocodazole Orta olarak ekleyin. Son olarak, hücre döngüsü ve Rb SUMOylation analizini gerçekleştirmeden önce 16 h için hücreleri kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Hücre döngüsü analizi Akış Sitometresi ile.
	<ol><li>Eşitlenmiş HEK293 PBS içinde yeniden askıya alma ve buz gibi % 70 etanol için 2 h 4'te kullanarak hücre süspansiyon düzeltin Bu hücre kümeleme en aza indirmek için hücre süspansiyon dropwise son bir konsantrasyon elde etmek için buz gibi % 100 etanol ekleyin unutmayın ° C. Yavaşça vortexing ise % 70 etanol.</li>
		<li>Hücreleri, 500 x g, 5 min için santrifüj kapasitesi sonra dikkatle süpernatant atmak ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı yineleyin.</li>
		<li>Ekle 500 µL PBS içeren 50 µg/mL nükleik asit propidium iyodür, %0,1 Triton X-100 ve 1 µg/mL RNase A hücrelere leke ve iyice karıştırın. 15 dk 37 için hücreleri kuluçkaya ° C.</li>
		<li>4 ° C'de örnekleri analiz kadar Akış Sitometresi tarafından depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation endojen Rb protein.
	<ol><li>Hazırla HEK293 hücre lysates.
		<ol><li>Lyse yavaşça onları buz gibi radyo-immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabellek (Tablo 1) 1 ml taze içeren yeniden askıya eşitlenmiş HEK293 hücreleri 20 mM N-Ethylmaleimide, olabilir bir isopeptidase inhibitörü eklendi SUMO proteaz engellemek ve SUMO conjugates stabilize.</li>
			<li>Daha fazla buz Dounce Homojenizasyon, sonication veya sadece 10 kat 2 mL şırınga üzerinde bağlı 21 G iğne üzerinden geçerek hücrelerdeyse lunaparkçı. Sonra buz 5 dakika süreyle hücrelerdeyse kuluçkaya 
			Not: Rb protein ve diğer arasında kovalent olmayan etkileşim türetilir belirsiz SUMO sinyal ortadan kaldırmak gibi RIPA arabellekte Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Rb-SUMO, daha sonra belirlenmesi için çok önemlidir Non-Rb türler-SUMO.</li>
		</ol></li> <li>Hücre lysates 18.000 x g 30 dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için. 
		Not: Protokol burada duraklatılmış. Proteinler-80 ° C'de en az 6 ay süreyle saklanabilir.</li>
		<li>Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yukarıda açıklanan süpernatant küçük bir bölümünü kurtarmak-e doğru yeni tüp ve-80 mağazasında ° C.</li>
		<li>Yukarıdaki supernatants için 1 µg G non-spesifik fare immünglobulin (IgG) aynı tür ve izotip monoklonal Rb antikor ve 20 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. O zaman, nazik rotasyon ile 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 3000 x g 3 dk de örnekleri 4'te ° C. dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve yeni 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için aktarabilirsiniz. Her örnekleri, 5 µL Rb birincil antikor ve 40 µL % 50 protein A/G-sepharose Bulamaç ekleyin. Sonra bir gecede nazik rotasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından toplamak ve dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın. Boncuk kaybını önlemek için dikkat edin, boncuk kuru Aspire değil.</li>
		<li>Boncuk dört kez RIPA arabelleği 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de onlara 4 ° C'de 15 dakika süreyle toplamak döndürme tarafından düşük hızlı Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından boncuk mix ve supernatants atın.</li>
		<li>Supernatants son yıkama servisinden kaldırdıktan sonra Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) yükleme arabellek (Tablo 1) x 30 µL 1 boncuk yeniden askıya alma ve iyice karıştırın.
		10 dk santrifüj kapasitesi için örnekleri boncuk cips için 1 dakika için 12.000 x g de <ol><li>Incubate bir sıcakta 100 ° C'de tüpler engelleyin. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri için transfer.</li>
		</ol></li> <li>Analiz örnekleri tarafından % 4 - % 20 degrade SDS-sayfası jel ve Western blot veya bunları-20 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak.</li>
	</ol></li></ol> 2. 6XHis öğesini eksojen Rb SUMOylation insan hücrelerinde analizi <ol><li>hücre kültür ve transfection.
	<ol><li>Tohum ~ 6 × 10 6 HEK293 hücreleri 10 cm çanak ve % 75-%85 Konfluent hücreleri elde etmek için normal hücre kültür koşullarda büyüme ortamda 24 h için kuluçkaya. Transfection önce büyüme orta kaldırmak ve prewarmed düşük serum orta 6 mL ekleyin (Tablo malzemeleri görmek) ve bulaşık kuluçka makinesi geri yerleştirin.</li>
		<li>İçin Rb bünye SUMOylation tahlil, eklemek 6XHis öğesini Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT ve Ubc9-C93S Plazmidler her 15 µg içinde 500 µL düşük serum 1,5 mL mikro-santrifüj tüpler, ortamda anılan sıraya göre.
		SUMO-konjugasyon vahşi türü Rb ve onun SUMOylation-arızalı mutant analiz etmek, ya da 6XHis öğesini Rb-WT veya Rb-K720R plazmid GFP-SUMO1 birlikte 10 µg mix <ol><li>(10 µg) 500 µL serum ortamda 1,5 mL mikro-santrifüj azaltılmış 13 tüpler.</li>
		</ol></li> <li>Bu arada, ayrı bir tüp içinde 50 µL transfection reaktif mix (Tablo malzemeleri görmek) 500 µL serum orta azaltılmış ve 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>Tam olarak yukarıda açıklanan iki ayrı tüp birleştirmek ve 15 dk. Ekle transfection oda sıcaklığında reaktif/plazmid kompleksleri hücrelere kuluçkaya ve kültür 8 için devam 37 ° c de % 5 CO 2 s</li>
		<li>İle büyüme orta düşük serum orta yerine ve hücreler normal kültür koşullar için 48 saat altında transfection sonra kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Nikel 6XHis öğesini Rb protein benzeşme yıkmak.
	<ol><li>Transfected HEK293 hücreleri parçalayıcı ve toplam protein açıklanan bölüm 1.3.1 ayıklamak.</li>
		<li>Santrifüj hücre lysates 18.000 x g de 30 dk 4 ° C. dikkatle supernatants toplamak ve temiz tüpler transfer. 
		Not: Protein bu noktada-80, 6 aydan fazla donmuş olabilir ° C.</li>
		<li>Her örnek giriş denetimi daha sonra Western blot için hazırlamak için yeni tüp ve-80 mağazasında için yukarıda açıklanan supernatants küçük bir bölümünü kaydedin ° C.</li>
		<li>Yıkama 25 µL % 50 nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) özel boncuk RIPA arabelleği iki kez her örnek için bir 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü ile nikel. 4 3 dk 3000 x g de Santrifüjü tarafından boncuk toplamak ° C.</li>
		<li>Ekleyin 1 M imidazole 10 mM son bir konsantrasyon elde etmek için her örnek için. Sonra her örnek hazır Ni-NTA özel boncuk içeren tüp ekleyin.</li>
		<li>Boncuk ve nazik rotasyon ile 4 ° C'de 2 h için lysates kuluçkaya. Boncuk 3000 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve pipetting tarafından supernatants dikkatli bir şekilde çıkarın. Boncuk kayıplarını önlemek için boncuk kuru Aspire edin değil.</li>
		<li>Boncuk yıkama arabelleği 20 mM imidazole (Tablo 1) içeren 1 mL ile yıkayın. Her zaman, tüpler de rotasyon 15 dk. toplamak için 4 ° C'de tarafından boncuk iplik 4 ° C'de 3 dk 3000 x g de tarafından karıştırın ve supernatants atın.</li>
		<li>Son yıkama sonra elüsyon 30 µL arabellek içeren 250 mM imidazole (Tablo 1) her örnek için ekleyin ve karıştırarak hafifçe vur. O zaman, proteinler elute 4 ° c 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Her örnek 6 × SDS-sayfa yükleme arabellek (Tablo 1) ile karıştırın. Sonra bir ısı blok için 10 dk. içinde 100 ° C'de tüpler kuluçkaya</li>
		<li>Santrifüj 12.000 x g boncuk cips için 1 dakika için. Dikkatle supernatants boncuk bozmadan toplamak ve örnekleri 1,5 ml mikro-santrifüj tüpleri için transfer. Western blot tarafından analiz veya daha sonra kullanmak için-20 ° C'de depolanan örnekleri.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>immunoprecipitation yük veya % 4-20 degrade SDS-sayfa jelleri üzerine önceki adımlardan gelen elde edilen örnekler aşağı çekin. Elektroforez 120 V proteinler ayırmak 90 dk için kuralları.</li>
	<li>Transfer proteinler jel bir polivinilidin difluoride (PVDF) membran tarafından electroblotting vasıl 300 mA tank aktarım yöntemini kullanarak 4 ° C'de 90 dk için. Oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabellekte PVDF membran engellemek.</li>
	<li>Incubate membran ile birincil antikor antikor seyreltme arabelleği % 3 sığır serum albumin (BSA) (Tablo 1) içeren bir 4 ° C'de gecede Birincil antikorlar için bir çalışma konsantrasyonu olarak 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antikor) veya 1:2000 (anti-Rb ve anti-tübülin antikorları) veya 1:5,000 (anti-GFP ve anti-O'nun antikor) bir seyreltme kullanın.</li>
	<li>Yıkama membran 3 x 10 dk 1 x tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ile ara (TBST) tampon (Tablo 1) kullanarak her zaman için. Membran türler belirli Horseradish peroksidaz HRP Birleşik ikincil antikorlar seyreltilmiş 1:5,000 %5 yağsız süt (Tablo 1) içeren blok arabelleği ile kuluçkaya. Membran 3 yıkama x 10 dk 1 x TBST tampon kullanarak her zaman için.</li>
	<li>Membran çözüm çalışma gelişmiş Kemiluminesan ile (ECL) kuluçkaya. Plastik wrap ile membran kapak ve sinyal gücüne bağlı olarak X-ray film maruz kalmaktadır.</li>
</ol>

<ol><li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li>
<li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RB+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li>
<li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li>
<li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rb%2Fchromatin+connection+and+epigenetic+control%3A+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li>
<li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+pRb+pathway%3A+is+there+a+code+of+conduct%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li>
<li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li>
<li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+%28pRb%29+by+cyclin+D%3ACdk4%2F6+complexes+results+in+active+pRb%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li>
<li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+SUMO-2%2F3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li>
<li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li>
<li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+in+sumoylation%3A+a+decade+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li>
<li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation%3A+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li>
<li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+%28RB%29+and+Lamin+A%2FC+interaction+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li>
<li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+%28UFDS%29%3A+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li>
<li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt algılayabilir ve Rb endojen SUMOylation insan hücrelerinde çözümlemek için bir protokol açıklar. Bu yöntem özellikle küresel sinyal SUMO ile ilgili herhangi bir değişim olmadan endojen Rb protein üzerinde duruldu gibi Rb-SUMO değişiklik tamamen doğal fizyolojik koşullar altında soruşturma için önemli bir araçtır.
Bu amaca ulaşmak için unutmayın ki bu: 1) SUMO dört izoformlarının (SUMO1-4, her farklı genler tarafından kodlanmış) ubiquitination ile karşılaştırıldığında kapsar rağmen SUM...

Ökaryotik hücrelerde hücre döngüsü progresyon doğru kontrolü belirli olaylar gerçekleşecek bir sıralı şekilde1,2sağlar sıkı bir düzenleyici ağ temel alır. Retinoblastom (Rb) protein, ilk klonlanmış Tümör baskılayıcı1,3bu ağda önemli oyuncularından biri. Rb protein S faz geçiş ve tümör büyüme4,5G0/G1 için özellikle hücre döngüsü progresyon negatif bir regülatör olduğu düşünülmektedir. Ya doğrudan Rb işlev başarısız olur, çocuklarda en sık görülen göz içi malignite için Retinoblastom, ya da kanser5diğer birçok türde katkı sağlıyor. Ayrıca, Rb hücre farklılaşması, Kromatin remodeling ve mitokondri-aracılı apoptosis3,6,7de dahil olmak üzere birçok hücresel yollar ilgilenmektedir.
Translasyonel modifikasyonlar RB işlevi8,9yönetmelikte önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon böyle bir değişiklik olduğunu ve genellikle Rb inactivation için yol açar. Durgun G0 hücrelerde, Rb düşük fosforilasyon düzeyiyle etkindir. İlerleme G0/G1 evresi boyunca hücreleri Rb sırayla hiper-fosforile siklin bağımlı protein kinaz (CDKs) ve Rb devre dışı bırakın ve hücre döngüsü bastırmak yeteneğini ortadan siklinlere, siklin E/CDK2 ve siklin D/CDK4/6 gibi bir dizi olduğu gen ifadesi4,10ile ilgili. RB da küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO)11,12,13tarafından değiştirilmiş olabilir.
SUMO hedef proteinlerin çeşitli kovalent bağlı bir Ubikuitin benzeri proteindir. Hücre döngüsü Yönetmeliği de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçler için önemlidir, transkripsiyon, protein Hücrede yerleşimi ve bozulması, taşıma ve DNA tamir14,15,16, 17 , 18. SUMO konjugasyon yolu dimerik SUMO E1 aktive enzim SAE1/UBA2, tek E2 conjugating enzim Ubc9, birden çok E3 ligazlar ve SUMO özgü proteaz oluşur. Genel olarak, yeni doğmakta olan SUMO proteinler proteolytically olgun formu oluşturmak için işlenmesi gerekir. Olgun SUMO E1 heterodimerdir tarafından etkinleştirilir ve E2 enzim Ubc9 transfer. Son olarak, SUMO C-terminal glisin kovalent bir substrat hedef lizin Birleşik ve bu işlem genellikle E3 ligazlar tarafından yönetilir. SUMO protein değiştirilmiş substrat belirli proteaz tarafından kaldırılabilir. Bu kağıt yazarlar tarafından bir önceki çalışma Rb SUMOylation hiper-fosforilasyon için erken G1 faz, hücre döngüsü ilerleme13için gerekli olan bir işlem önde gelen CDK2, onun bağlama artırır saptandı. Biz de Rb SUMOylation bir azalma hücre çoğalması kaybolmasına neden olduğunu gösterdi. Ayrıca, son zamanlarda Rb SUMOylation Rb protein proteasomal işlemlerinden, böylece artan Rb protein hücreleri19düzeyini korur gösterilmiştir. Bu nedenle, SUMOylation çeşitli hücresel süreçler Rb işlevinde önemli bir rol oynar. İleri çalışmalar için işlev sonucu ve Rb SUMOylation, fizyolojik alaka Rb insan hücreleri veya hasta dokuların SUMO durumunu analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirmek için önemli.
SUMOylation tersine çevrilebilir, son derece dinamik bir süreçtir. Böylece, genellikle tamamen endojen koşullar altında SUMO modifiye proteinleri tespit etmek zordur. Bu kağıt endojen Rb SUMOylation tespit etmek için bir yöntem sunar. Ayrıca eksojen Rb SUMOylation vahşi tipi Rb ve SUMO-eksik mutasyon11algılamak gösterilmiştir. Özellikle, Jacobs ve ark. özellikle Ubc9 füzyon Yönetmen: SUMOylation (UFDS)20tarafından verilen bir substrat SUMO modifikasyonu artırmak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, bu iletişim kuralını zorla SUMOylation Rb ve fonksiyonel sonuçları analiz açıklar. Verilen bu SUMO yüzeylerde yüzlerce daha önce tarif var ve daha fazla sözde SUMO yüzeylerde birçok proteomik tabanlı deneyleri tespit edilmiştir, bu iletişim kuralı bu proteinler insan hücrelerinde SUMO modifikasyonu analiz etmek için uygulanır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>propidyum iyodür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 &nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Etilmaleimid</td><td>Sigma</td><td>E3876 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 İkamesi (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Fare İmmünoglobulin G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A / G-Sefaroz Boncuk</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofiktamin-2000 &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nikel Nitrilotriasetik Asit (Ni-NTA) Agaroz Boncukları</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>%4 - %20 Gradyan SDS-PAGE Jel</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Poliviniliden Diflorür (PVDF) Membran</td><td>Kırlangıç</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antikoru</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP antikoru</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu Peroksidaz (HRP) ikincil antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>gelişmiş kemilüminesans (ECL) Kiti</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo algılama ve rb protein sumoylation insan hücrelerinde analizi

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Translasyonel modifikasyonlar proteinlerin hücre içi sinyal iletimi uygun düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu değişiklikler arasında küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) hedef proteinlerin hücresel süreçler, gen transkripsiyon, DNA tamiri, protein gibi düzenlemek için çeşitli lizin artıkları kovalent bağlı olduğu bir Ubikuitin benzeri proteindir etkileşim ve bozulması, hücre altı taşıma ve sinyal iletimi. Protein SUMOylation tespit için en yaygın yaklaşım ifade ve bırakmak için basit ve uygun mekanik adresleme için bir vitro biyokimyasal reaksiyon bakteri, rekombinant tagged proteinlerin saflaştırılması dayanır sorular. Ancak, SUMOylation vivosürecinin karmaşıklığı nedeniyle, öyle algılamak ve protein SUMOylation hücrelerde endojen koşullar ne zaman altında özellikle çözümlemek için daha zor. Bu kağıt yazarlar tarafından yapılan bir çalışmada endojen Retinoblastom (Rb) protein, hücre döngüsü ilerleme olumsuz düzenlenmesi çok önemlidir bir Tümör baskılayıcı özellikle SUMOylated erken G1 aşamasında saptandı. Bu kağıt algılama ve Rb SUMOylation çözümleme insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı SUMO-değişiklik Rb, aynı zamanda birçok diğer SUMO hedefli protein, insan hücrelerinde phenotypical ve fonksiyonel incelenmesi için uygundur.

Hücre döngüsü ilerleme sırasında endojen Rb SUMOylation algılamak için bu çalışma ilk HEK293 hücreleri hücre döngüsü (G0, erken G1, G1, S ve G2/M) beş farklı aşamalarında bu kağıt Protokolü bölümünde açıklandığı gibi senkronize. Eşitleme kalitesini nükleik asit leke Akış Sitometresi Analizi (şekil 1) tarafından takip propidium iyodür kullanılarak doğrulandı. Daha sonra hücreleri toplanmış ve RIPA arabellek denaturing tarafından lysed. SUMO proteaz inhibitörü,...

Küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) aile proteinler hedef proteinlerin çeşitli hücresel süreçler düzenleyen lizin kalıntıları Birleşik. Bu kağıt Retinoblastom (Rb) protein SUMOylation insan hücrelerinde endojen ve eksojen koşullarda tespiti için bir protokolünü açıklar.

Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Bu deneyin genel amacı, insan hücrelerinde endojen ve ekzojen koşullar altında retinoblastoma proteinlerinin SUMOilasyonunu tespit etmektir. Küçük ubikuitin benzeri modifikatör veya SUMO ailesi proteinleri, çeşitli hücresel süreçleri düzenlemek için hedef proteinlerin lizin kalıntılarına konjuge edilir. Genellikle, in vivo SUMOilasyonun karmaşıklığı nedeniyle hücrelerde bir protein SUMOilasyonunu başlatmak daha zordur.Bu deney, hem endojen hem de eksojen Rb proteinlerinin SUMOilasyonunu tespit eder. Bu yöntem Rb proteinlerinin SUMOilasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, hücrelerdeki diğer birçok SUMO hedef proteininin tespiti için de uygundur. Başlamak için, yüzde bir penisilin streptomisin içeren 25 mililitre DMEM ekleyin ve HEK293 hücrelerini 37 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin.Üç mililitre buz gibi soğuk PBS kullanarak hücreleri plakadan yıkayarak uzaklaştırın. Ardından hücreleri yeni bir beş mililitrelik tüpe aktarın. G0 senkronizasyon sürecinin sonunda G1 evresindeki hücreleri elde etmek için DMEM'yi uzaklaştırın ve taze büyüme ortamı ekleyerek HEK293 hücrelerinin hücre döngüsüne yeniden girmesini sağlayın.Ardından, hücre döngüsü analizi ve ileri SUMO testi için hücreleri fa

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, sıralı bir enzim kaskad kullanılarak substrat proteinlerinin SUMOylasyonu için in vitro yöntemi göstermektedir. Ayrıca, proteinin SUMOylated durumu, elektroforez ve immünoblotlama tekniği kullanılarak tanımlanır.

SUMOylation Assay: İmmünoblotlama ile Substrat Proteinlerinin SUMOylation Durumunu Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.

Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

SUMO temel ve son derece uyumlu, küçük Ubiquitin-gibi değiştirici protein. Bu protokolde biz bir stres toleranslı rekombinant SUMO-bindirme proteini (kmUTAG) yerel, etiketlenmemiş SUMO konjugleri ve çeşitli hücre türlerinde lokalizasyonu görselleştirmek için kullanımını tarif ediyoruz.

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Burada, SUMO bağlayıcı varlıklar (SUBEs) kullanılarak hepatosellüler karsinomun fare modellerinden elde edilen insan hepatoma hücrelerinden ve karaciğer tümörlerinden elde edilen proteinleri hem insan hepatoma hücrelerinden hem de karaciğer tümörlerinden sumo bağlayıcı varlıklar (SUBEs) kullanarak zenginleştirmek, izole etmek, tanımlamak ve karakterize etmek için bir protokol sayılmaktadır.

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu protokoller, protein arginin metiltransfenaz (PRMT) ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzymatic aktivitesini değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi sağlar. Prmt aktivitesinin endojen ve eksojen biyobelirteçler kullanılarak değerlendirilmesi, metil-arginin tanıma antikorları ve inhibitör takım bileşikleri ile ilgili ayrıntılı yönergeler açıklanmıştır.

Hücrelerde Protein Arginin Metiltransfenaz 1-9 Aktivitesini Incelemek için Nicel Yöntemler

Keşfedin, insan hücrelerinde retinoblastoma proteininin SUMOilasyonunu endojen ve ekzojen koşullarda nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, hücre süreçlerini düzenleyen protein modifikasyonlarını incelemek için kullanılabilir.

Vivo Algılama ve Rb Protein SUMOylation insan hücrelerinde analizi

Daha fazla video keşfet