Name: C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Öğrenin, C. elegans bağırsağında polarize membran biyogenezini ve lumen morfogenezini tek hücre düzeyinde in vivo analiz etmek için antikor boyama, RNAi ve görüntüleme tekniklerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mario de teşekkür ediyoruz Bono (Moleküler Biyoloji laboratuarında, Cambridge, İngiltere), Kenneth J. Kemphues (Cornell Üniversitesi, Ithaca, ABD), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Fransa), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Fransa) ve suşları ve antikorlar için araştırma altyapı programları (P40 OD010440), NIH ofisi tarafından finanse CGC. Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir

<ol><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: building polarized tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/56101/the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen">The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+execution+of+the+epithelial+polarity+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization and execution of the epithelial polarity programme.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).</li>
<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+protein+sorting%2C+targeting+and+distribution+in+polarized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).</li>
<li>Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+core+mechanisms+to+generate+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity.</a> Nature. 422, 766-774 (2003).</li>
<li>Goldstein, B., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PAR+Proteins%3A+Fundamental+Players+in+Animal+Cell+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization.</a> Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+vesicular+trafficking+in+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of vesicular trafficking in epithelia.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).</li>
<li>Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).</li>
<li>Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+polarity+protein+network+in+Drosophila+epithelial+cells%3A+regulation+of+polarity%2C+junctions%2C+morphogenesis%2C+cell+growth%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).</li>
<li>Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+and+endocytosis%3A+reciprocal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity and endocytosis: reciprocal regulation.</a> Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+network+for+de+novo+generation+of+the+apical+surface+and+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen.</a> Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicobasal+domain+identities+of+expanding+tubular+membranes+depend+on+glycosphingolipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+and+AP-1+regulate+apical+polarity+and+lumen+formation+during+C.+elegans+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis.</a> Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).</li>
<li>Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+C.+elegans+Intestine+Involves+Axon+Guidance+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes.</a> PLoS Genet. 12 (4), e1005950(2016).</li>
<li>Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10588867">Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine.</a> Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/intestine/Intframeset.html">Alimentary system, intestine.</a> WormAtlas. , (2009).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+and+morphogenesis+of+single-cell+tubes+in+the+C.+elegans+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract.</a> Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).</li>
<li>Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Gut development in C. elegans.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2017).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intestine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).</li>
<li>Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22226520">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).</li>
<li>JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Putative+RNA-Directed+RNA+Polymerase+RRF-3+Makes+C.+elegans+Hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Netherlands, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F978-1-4020-6754-9_11479">Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy</a>. , Springer. Netherlands. (2008).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).</li>
<li>Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDC-25.2%2C+a+C.+elegans+ortholog+of+cdc25%2C+is+essential+for+the+progression+of+intestinal+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions.</a> Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).</li>
<li>Shi, A., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+recycling+endosomes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).</li>
<li>Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , 
 <a target="_blank" href="http://cbs.umn.edu/cgc/home">http://cbs.umn.edu/cgc/home</a> (2017).</li>
<li>Wormbase. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.wormbase.org/"> http://www.wormbase.org/</a> (2017).</li>
<li>McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2007).</li>
<li>Transgeneome website. , 
 <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017).</li>
<li>C. elegans expression pattern. , 
 <a target="_blank" href="http://gfpworm.org/">http://gfpworm.org/</a> (2017).</li>
<li>National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , 
 <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/</a> (2017).</li>
<li>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , 
 <a target="_blank" href="http://dshb.biology.uiowa.edu">http://dshb.biology.uiowa.edu</a> (2017).</li>
<li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu iletişim kuralı standart fonksiyon kaybı genetik/RNAi ve C. elegans bağırsak epitel görsel ve moleküler diseksiyon içinde vivo için bir model olarak yararlanmak için (etiketleme ve mikroskobik) yaklaşımlar Imaging birleştirmek açıklar polarize membran ve Lümen Biyogenez.
Etiketleme
Bu iletişim kuralı antikor boyama üzerinde duruluyor. Situ antikorlar tarafından etiketleme floresan füzyon (eşlik eden gazetede boşaltım ka...

Polarize membran etki alanları, oluşumu gibi hücresel ve hücre altı asimetriler nesil morfogenez ve hücre, doku ve organların1fonksiyonu için önemlidir. Hücre altı bileşenleri tahsisi yön değişiklikleri olan birden çok ardışık ve çakışık ekstraselüler ve hücre içi sinyalleri bağlıdır beri epiteli polarize membran Biyogenez üzerinde çalışmalar teknik bir sorun kalır zor çoğu modellerinde ayrı ve güçlü modeli sistemine bağlıdır. Tek katmanlı model burada - sunulan Caenorhabditis elegans bağırsak - zarif sadeliği bir doku olduğunu. Tek hücreli ile birlikte C. elegans boşaltım kanalı (bkz: kağıt polarize membran Biyogenez C. elegans boşaltım kanalı içinde eşlik)2, kimlik için birkaç benzersiz avantajlar sağlar ve molekülleri polarize membran dipnotlar için gerekli karakterizasyonu. Maya moleküler polarite ipuçları adama koruma yapmak bu basit omurgasız organ mükemmel bir"in vivo doku odası" hala çok şey insan sistemine doğrudan konu ile ilgili olan epitel polarite ilgili soruları için karmaşık görsel diseksiyon bu olayların tek izin düzeyi içinde vivohücre.
Birden çok korunmuş polarite İpuçları (1 extracelluar matris, (2) plazma zarı ve kavşak ve (3) hücre içi veziküler kaçakçılığı saptanan3, kendi entegrasyon süreci temel ilkeleri olmasına rağmen polarize epitelyal membran ve doku Biyogenez kötü anlaşılan4' tür. Klasik tek hücreli vivo içinde modelleri (e.g.S. cerevisiae ve C. elegans zigot), polarize hücre bölünmesi ve ön-arka polarite tanımlama vesile olmuştur ve kritik belirledik membran ilişkili polarite belirleyicileri (küçük GTPases/CDC-42, bölümleme arızalı PARs)5,6, ama onlar İpuçları (bud yara, sperm giriş) breaking eşsiz simetri bağlıdır ve kavşak güvenli eksikliği apicobasal membran etki alanları ve muhtemelen, makine sıralama karşılık gelen hücre içi apicobasal. Şu anki bilgilerimize polarize epiteli, kaçakçılığı organizasyonu hakkında ancak, öncelikle memeli 2D monocultures7, hangi membran konumlarını değiştirebilirsiniz fizyolojik ekstraselüler ve gelişimsel cues eksikliği dayanır etki alanları ve kaçakçılığı yörüngeleri yönleri (MDCK (Madin-Darby köpek böbrek) hücrelerde membran Polarite ters çevirmek için bir geçiş 2D 3D vitro kültür sistemleri tek başına yeterlidir)8. İn vivo gelişim çalışmaları epitel polarite omurgasız canlılar üzerinde başlangıçta düz epiteli, Drosophila melanogaster epidermis nerede kritik katkı tespit örneğin yapılmıştır birleşme dinamikleri polarize hücre göç ve hücre levha hareketi9için ve endositik için polarite bakım10ticareti. 3D vitro ve in vivo analizi Lümen morfogenez borulu epiteli MDCK hücreleri ve C. elegans bağırsak içinde anılan sıraya göre son zamanlarda hücre içi de için kaçakçılık zorunluluğu belirledik Novo (apikal) etki alanı ve Lümen Biyogenez ve11,12,13konumlandırma. Kalınlığı (düz karşı) borulu epitel hücreleri biridir bir avantaj hücre altı asimetriler 3D analizi için üstün bir görsel ayrım apikal lumenal membran, apico-lateral kavşaklar, yanal membran, izin verir bu yana ve Hücre içi organellerin pozisyonlar. Bu görsel avantajları, C. elegans model ekler vücut planı, sabit ve tanımlı hücre soy, analitik sadeliği içinde vivo ayarı, gelişimsel eksen, saydamlık (genetik) ve ek avantajlar aşağıda açıklanmıştır.
C. elegans kendisi olan şeffaflık ve basit mimarisi, aynı şekilde borulu iç organları doğrudan tüp ve Lümen morfogenez görsel analiz için erişilebilir duruma tübüler yapısının yuvarlak bir kurt var. Onun bağırsak (zaman zaman 21 ya da 22 hücreleri)14 yirmi hücreleri bir tek progenitör hücre (E) elde edilen ve bir çift katlı epitel tarafından bir enterkalasyon adım 9 INT yüzük bilateral simetrik bir tüp içine geliştirmek (dört hücreleri ilk halka; Şekil 1 şematik)14,15,16. Başlangıçta Nomarski optik nükleer kimlikleri17ile ve daha sonra Floresans mikroskobu etiketli membranlar yoluyla tarafından belirlenen bağırsak'ın soy ve doku analizi, onun morfogenez, kritik anlayışlar içinde sağlamıştır belirli hücre özerk ve hücre-sigara özerk gereksinimleri yönlü hücre bölünmeler ve hareketleri (örneğin, enterkalasyon, sağ-sol asimetriler, anterior ve posteiror tüp döndürme)14,18 . Erken endodermal hücre özellikleri ve bu klonal modeli organ gelişimi kontrol gen düzenleyici ağ de karakterize19,20vardır. Burada, ancak, polarize membran ve Lümen Biyogenez tek tübüler hücrelerde ve endomembranes, hücre iskeleti yapıları ve bu sürecine eşlik organellerin hücre içi asimetriler analizine odaklanmıştır. Analiz nerede tüm apikal membranlar (ultrastructural düzey microvilli tarafından ayırt edici) Lümen yüz ve tüm Bazal membran dış boru yüzey birbirlerine temas yanal membranlar ile yüz bu tüp sadeliği tarafından yönetilir, apikal membran kavşaklar tarafından ayrılmış (şekil 1 şematik; bkz: başvuruları (16,21) C. elegans-özel organizasyon sıkı ve adherens junction bileşenleri). Apikal membran Biyogenez böylece Lümen morfogenez ile çakışık olduğunu. Ayrıca, Yetişkin bağırsak hücreleri - en büyük bu küçük hayvan hücreleri (boşaltım hücrenin özel durumla) - boyutunu yaklaşık vivo içinde görsel izleme hücre altı öğe, örneğin izin bir memeli hücre boyutu genellikle vezikül yörüngeleri vitro kültür tabak içinde çalıştı.
Bu hücre ve hücre altı çözümleme amacıyla uygun etiketleme önemlidir. Bağırsak endo veya plazma zarı etki alanları, kavşaklar, hücre iskeletiyapıları, çekirdek ve hücre altı diğer organelleri belirli moleküler bileşenleri etiketleme tarafından görüntülenmiştir. Böyle birçok bileşenleri ile karakterize ve keşfedilmeyi devam (tablo 1 birkaç örnek verir ve kaynaklara anlamına gelir). Örneğin, çeşitli moleküller yolu ile plazma zarı için yazı-Golgi veziküller Golgi acil servise gelen bağırsak endomembrane sisteminin borulu ve/veya veziküler bölmeleri ayırt tanımlanan22olmuştur. Belirli proteinler (yanı sıra lipidler ve şeker) de doğrudan veya dolaylı olarak protein bağlayıcı üzerinden etiketli. Bu iletişim kuralı in situ antikor sabit örnekleri, iki standart etiketleme teknikten birini boyama üzerinde duruluyor (eşlik eden kağıt boşaltım kanalı tubulogenesis diğer tekniği2 - bir açıklaması için bkz: vivo etiketleme Floresan protein füzyon - bağırsak için doğrudan geçerli olduğu; Tablo 2 bağırsak için ifade gibi füzyon proteinlerin sürücü için kullanılan bağırsak özel Organizatör örnekleri sağlar). Çift - veya her iki yaklaşım, veya her iki artı ek kimyasal boyama, karışımı ile birden fazla etiketleme daha fazla derinlemesine görsel çözünürlüğünü ve co yerelleştirme kayma ve zamansal değişikliklerinin incelenmesi ve özel alımı sağlar molekülleri veya hücre altı bileşenlerinin (Şekil 2). Fiksasyon ve bu iletişim kuralı desteği korunması immunostaining işlemler sırasında etiketleme yeşil flüoresan protein (GFP) açıklanan yordamları boyama. Görüntüleme için anahtar noktaları algılama ve karakterizasyonu fenotipleri standart mikroskobik prosedürler (floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu) ile olan tubulogenesis ()şekil 3, 4açıklanan). Bunlar daha yüksek çözünürlük örnek superresolution mikroskobu ve transmisyon elektron (burada açıklanmayan) mikroskopi için yaklaşımlar görüntüleme için genişletilebilir.
Bu sistem bir anahtar gücü embriyogenez yetişkinlik aracılığıyla gelen farklı gelişim aşamalarında polarite tek tek hücreleri içinde çözümlenecek yeteneğidir. Örneğin, apikal membran etki alanı ve Lümen Biyogenez geliştirme tek hücre düzeyinde boyunca ERM-1, Ezrin-Radixin-Moesin aile23,24 son derece korunmuş membran-aktin bağlayıcı ile etiketleme yoluyla izlenebilir . Kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve göç (Lümen enterkalasyon sırasında etrafında apically hücreleri hareket)15ile ortaya çıktığında ERM-1 sırasında embriyonik tüp morfogenez, apikal membran dipnotlar (1) görüntüler; (2) hücre bölünmesi veya geçiş yokluğunda gelirleri geç embriyonik ve larva tüp uzantısı sırasında; ve (3) Yetişkin bağırsakta nerede polarize membran etki alanları (şekil 1) korunur. Genişleyen sonrası Mitotik larva epitel içinde de novo polarize membran Biyogenez böylece ayrılabilir çoğu in vivo ve in vitro epitel polarite modellerinde mümkün değildir, polarize doku morfogenez Bu tek hücreli çözünürlük (örneğin 3D MDCK kist modeli8) dahil. Diğer bileşenler için etiketleme ile bu ayarı (hücreleri daha yüksek bir sitoplazma/çekirdek oranı varsa özellikle L1 larva aşamasında) fırsat sağlar özgü bu hücre içi değişiklikleri ayırt etmek için polarize membran dipnotlar () örneğin kaçakçılığı yörüngeleri hale gelmesini) bu kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve geçiş için gerekli.
C. elegans genetik çok yönlülük iyi bilinen25ve biyolojik herhangi bir soru moleküler analiz için güçlü modeli sistem yapar. Morfogenez, üzerine bir çalışma, bir vahşi tipi yük, faiz (örneğin bir membran) yapısını floresan bir marker ile veya bir kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu mutant bir üründe ile ile nerede etiketli bir transgenik yük ile başlayabilirsiniz yapısı. Tipik bir ters genetik çalışma germline (örneğin tarafından hedeflenen silme), mutagenesis (genellikle nokta mutasyonlar sonucu kaybı, azaltılması ya da kazanç fonksiyonu ile üreten değiştiren bir mutant gen ilgi silinmesi oluşturabilir Gen) veya nerede onun transkript RNAi tarafından düşürülür. C. elegans26 besleme tarafından RNAi kolaylığı da ilgi genlerin daha büyük bir grup incelemek hedeflenen ekranlar için tasarım oldukça rahat. Bir genetik model organizma'nın tartışmasız en güçlü bir fenotip moleküler nedeni tarafsız bir soruşturma izni vivo içinde ileri ekranlar (örneğin mutagenesis, sistematik veya genom geniş RNAi ekranlar) yapmak için yeteneğidir faiz. Örneğin, tarafsız bir görsel C. elegans RNAi tubulogenesis ekran, apikal membranlar, ERM-1 olarak etiketlenmiş transgenik bir hayvanla ile başlayan bir ilgi çekici tersinir bağırsak polarite dönüşüm ve Ektopik Lümen fenotip, kullanılan keşfetti Burada bu tür analiz için bir örnek olarak. Bu ekran glycosphingolipids (GSLs; onların GLS biyosentetik enzimler ile tanımlanan zorunlu membran lipidler) tükenmesi ve vezikül kat clathrin ve onun AP-1 adaptör bileşenleri bu polarizasyona neden belirli moleküler kusurlar tespit dönüşüm fenotip, böylece bunlar molekülleri in vivo kaçakçılığı karakterize apikal membran polarite ve Lümen12,13konumlandırma için ipuçları. Ayrıca belirli genetik mutasyon/morfogenez fenotip ile Başlarken, bu tür ekranları (veya tek genetik/RNAi etkileşim deneyler) iki veya daha fazla faiz (bkz: kağıt üzerinde boşaltım eşlik eden genler arasındaki işlevsel etkileşimler inceleyebilirsiniz Canal böyle bir analiz örneği için)2. Bu iletişim kuralı hangi ek olarak doğrudan kimin fenotip ileri ekranları kaybolmasına neden gen tanımlama yeteneği onun morfogenez çözümlemesi için belirli avantajlar sağlayan RNAi odaklanır. Gen ürünü morfogenez kez yönetmenlik bir doz bağımlı biçimde çalışır beri RNAi fenotipleri bir spektrum oluşturmak için genellikle başarılı olur. Bilgilendirici işlevi, kısmi kaybı fenotipleri oluşturma yeteneği de önemli tubulogenesis genler çoğunluğu gerekli ve onların kayıpları kısırlık ve erken embriyonik ölümcül neden sorunu çözmek için yardımcı olur. Bu iletişim kuralı bu zorluk üstesinden gelmek için koşullu RNAi stratejileri içerir ve fenotipleri, mutagenesis tarafından üretilen bir allelic serisi gibi daha geniş bir spektrum nesil optimize etmek için yollar önerir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikor boyama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizin</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Süt tozu</td><td>Sigma</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Birincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27 (fare)</td><td></td><td></td><td>Konsantrasyon: 1:20 Kaynaklar: Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası.</td></tr><tr><td>MH33 (fare)</td><td></td><td></td><td>Konsantrasyon: 1:10 Kaynaklar: Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası.</td></tr><tr><td>anti-ICB4 (tavşan)</td><td></td><td></td><td>Konsantrasyon: 1:5 Kaynaklar: Mario de</em'den bir hediye> Bono (Tıbbi Araştırma Konseyi, İngiltere)</td></tr><tr><td>anti-PAR-3 (tavşan)</td><td></td><td></td><td>Konsantrasyon: 1:50 Kaynaklar: Kenneth J. Kemphues'ten (Cornell Üniversitesi) bir hediye</td></tr><tr><td><güçlü>İkincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568 (tavşan karşıtı)</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>Konsantrasyon: 1:200</td></tr><tr><td>Cy5 (anti-fare)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A10524</td><td>Konsantrasyon: 1:200</td></tr><tr><td>TRITC (tavşan önleyici)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>Konsantrasyon: 1:200</td></tr><tr><td>FITC (anti-fare)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>Konsantrasyon: 1:100</td></tr><tr><td>Etiketli kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>Konsantrasyon: 1:100 Kaynaklar: Moleküler Problar-T7471</td></tr><tr><td>Malzemeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Gres</td><td>Silikon Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lameller (22x22-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ilgili</güçlü></td><td></td><td></td><td>Standart C elegans kültür ve bakım prosedürleri için referans29 bakın.</td></tr><tr><td>LB Orta ve plakalar</td><td></td><td></td><td>protokoller için reference29 adresine bakın.</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Protokoller için orta</td><td></td><td></td><td>bkz. referans29.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM plakaları</td><td></td><td></td><td>reference29 protokoller için.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Akros Organikler</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4Sigma</td><td></td> <td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi plakaları</td><td></td><td></td><td>protokoller için reference30 referansına bakın.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Akros Organikler</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>ABD Biyolojik</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hipoklorit</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Bakteriler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bakteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bakteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genom çapında RNAi kitaplıkları Ahringer genom çapında RNAi besleme kitaplığı (ref 30,49,50)</td><td>Kaynak: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi besleme kitaplığı (ref51)</td><td>Kaynak BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme ile ilgili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon mikroskobu</td><td>Yüksek</td> güçlü stereo floresan eklentisi (Kramer Scientific), Q yakalama yazılımına sahip CCD kamera ve X-Cite floresan lamba (Fotonik Çözümler) ile donatılmış Nikon <td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon mikroskobuOlympus</td><td></td> <td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystem</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>ters çevrilmiş bir ECLIPSE Ti-E üzerine monte edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans bağırsak olarak bir model hücreler arası lumen morfogenez ve in vivo polarize membran biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev rnai kaybı çözümleme ve görüntüleme

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Çok hücreli tüpler, tüm iç organları, temel birimleri polarize epitelyal veya endotel hücrelerinin apikal membranlar ile her diğer ve/veya hücre dışı matriks irtibata Lümen ve demiri membranlar astar oluşur. Nasıl bu farklı membran asimetrisi kurulan ve organ morfogenez sırasında tutulan hala bir çözümlenmemiş hücre biyolojisi meselesi. Bu iletişim kuralı sırasında apikal membran ve Lümen Biyogenez vurgu ile tüp morfogenez polarize membran dipnotlar analiz için bir model olarak C. elegans bağırsak açıklar. C. elegans yirmi-hücre tek katmanlı bağırsak epitel bir tek hücre düzeyinde çözümleme izin basit bir bilateral simetrik tüp içine yerleştirilmiştir. Membran polarizasyon kullanılazlar polarize hücre bölünmesi ve geçiş sırasında erken embriyogenez ama polarize de novo hücreleri artık çoğalırlar ve hareket membran Biyogenez larva büyüme devam eder oluşur. İkinci ayarı bir aynı anda farklı bu polarize süreçleri, çoğu polarite modellerinde ayırt etmek zor aracılık hücre altı değişiklikleri ayırmak izin verir. Apikal-, demiri membran-, bileske-, hücre iskeleti- ve endomembrane bileşenleri etiketli ve geliştirme GFP füzyon proteinler tarafından izlenen veya in situ antikor boyama tarafından değerlendirildi. Organizmanın genetik çok yönlülüğü ile birlikte, C. elegans bağırsak böylece benzersiz vivo içinde modeli için görsel, gelişimsel ve polarize membran ve tüp Biyogenez moleküler genetik analizi sağlar. Belirli yöntemler (tüm standart) burada açıklanan nasıl yapılır: bağırsak hücre altı bileşenleri etiket antikor boyama tarafından; genler polarize membran dipnotlar içinde yer alan işlev kaybı çalışmalar genellikle temel tubulogenesis genler için adapte tarafından analiz; farklı gelişim dönemleri sırasında polarite kusurları değerlendirmek; epifluorescence, fark girişim kontrast (DIC) ve confocal mikroskobu fenotipleri yorumlamak; görsel kusurları ölçmek. Bu iletişim kuralı epitel polarite, membran dipnotlar, tüp ve Lümen morfogenez herhangi ilgili kez son derece korunmuş moleküllerin analiz etmek için adapte edilebilir.

Bu iletişim kuralı, tatlı analiz ve polarize membran Biyogenez ve Lümen morfogenez C. elegans bağırsakta tek hücre ve hücre altı düzeyde görselleştirmek açıklar. Yirmi-hücre tek katmanlı C. elegans bağırsak yönlendirilmiş hücre bölünmesi ve geçiş sırasında orta embriyo tarafından oluşturulur. Etki alanları kurulan haline bu zaman, polarize membran, yine de novo , polarize membran Biyogenez olgun içinde devam eder ancak epitel dört larva aşamaları boyunca yetişki...

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Standart yöntemlerin bu kombinasyonunun genel amacı, C.elegans bağırsağının, polarize membran biyogenezi ve lümen morfojenezinin tek hücre ve hücre altı düzeyde in vivo analizleri için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu yöntem, apikal ve bazolateral membran bölgelerinin ve diğer hücre altı asimetrilerin morfojenez sırasında ve sonrasında nasıl kurulduğu ve korunduğu gibi polarite ve biyogenez alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu model sistemin temel avantajı, sadece 20 hücreden oluşan bu şeffaf tek katmanın, tek hücre polarize membran ve lümen biyogenezini incelemek için in vivo doku odasında yaşayabilmesidir.Bu teknikler, diğer C. elegans morfogenez fenotiplerinin analizine genişletilebilir; burada odak noktası membran biyogenezi, özellikle de apikal membran ve lümen biyogenezinin analizidir. Prosedürler, membran domainlerini ve hücre altı bileşenlerini ayırt etmek ve bir C. elegans bağırsağındaki lümen morfogenez fenotiplerini tanımlamak için fikse edilmiş ve canlı hayvanlarda kullanılan geliştirilmiş görüntüleme tekniklerini içerir. Bağırsak tübülogenezi üzerine olan bu videoya, polarize membran biyogenezinin in vivo analizinin birbirini tamamlayan modeller olduğu ekskresyon kanalı tübülogenezi ile ilgili bir video eşlik etmektedir.Etiketlemeye gelince, canlı görüntüleme için floresan işaretli füzyon proteinlerine sahip transgenik hayvanların üretimi, boşaltım kanalı tübülogenezi analizine ilişkin beraberindeki videoda açıklanmıştır. Bu hayvanlar RNAi deneylerinde doğrudan kullanılabilir. Üçüncü nesil, tipik olarak bu prosedür kombinasyonundaki ilk adımdır.Bu video, hayvanların fikse edilmesi gereken alternatif etiketleme yöntemi olan antikor boyaması ile başlamaktadır. Farklı etiketleme prosedürleri, genellikle nihai görüntüleme analizi için kullanılan immünohistokimya ile birleştirilebilir. Bu protokol ayrıca, her iki etiketleme prosedürü için de yararlı olan bağırsak spesifik membran marker promotörleri ve diğer kaynaklara dair örnekler içermektedir.İmmünohistokimyanın gösterilmesinin ardından bu video, RNAi kullanarak polarite ve lümen morfogenezi fenotiplerini araştırmak için intestinal apikal membranı ERM-1 GFP ile işaretleyen transgenik bir suş kullanmaktadır. Öncelikle solucanları sabitlemek için bir lam hazırlayın. Bir lamın üzerine 30 µL poly-L-lysine pipetleyin ve ardından ikinci bir lamı diğerinin üzerine yerleştirip çözeltinin her ikisine de eşit şekilde yayılması için birlikte bırakın.Şimdi iki lamı birbirinden ayırın ve 30 dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Ardından, sıvı azotla doldurulmuş bir kaba düz metal bir blok yerleştirin. Plakaları M9 solüsyonu ile yıkayın ve solucanları içeren yaklaşık 10 microliter M9 transfer edin.Alternatif olarak solucanları seçin ve lamın üzerine M9 ekleyin. Solucanlar aktarıldıktan sonra, lamın bir kenarından taşacak şekilde üzerlerine dikkatlice çapraz bir kapatma camı bırakın. Ardından, herhangi bir yan hareket yapmadan kapatma camına nazikçe bastırın.Şimdi lamı derhal sıvı azot içindeki metal bloğa aktarın ve donmaya bırakın. Beş dakika sonra, dışarıda kalan kenarı kullanarak lam örtüsünü hızla yerinden çıkarın. Kütikülün düzgün şekilde çatlamasını sağlamak için bu işlemi süratle gerçekleştirin.Ardından lamı, -20 °C'deki metanol dolu cam bir Coplin kavanozuna daldırın. Beş dakika sonra lamı, aynı sıcaklıktaki aseton dolu cam bir Coplin kavanozuna aktarıp beş dakika daha bekletin. Lamlar doğrudan boyanabilir veya -20 °C'de saklanabilir.Lamı asetondan çıkarın ve oda sıcaklığında havada kurumaya bırakın. Ardından, lamın alt yüzeyine vazelinle oluşturulacak dairesel bir duvar için konumu işaretleyin ve vazelin duvarını oluşturun. Bu işlem sırasında vazelini silmeyin.Sırada, ıslak kağıt havlularla bir kap içerisinde nemli bir oda hazırlayın ve lamı içerideki bir rafın üzerine yerleştirin. Havlularla lam arasında veya yan yana duran lamlar arasında temas olmamalıdır. Şimdi, alanı kaplayacak kadar PBS'yi jöle halkasının içine pipetleyin.Pipet ucunu dairenin kenarına nazikçe yerleştirin ve sıvının solucanların üzerine düzgünce yayılmasını sağlayın. Ardından kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin. Beş dakika sonra, solucanların lamdan kayıp gitmemesine dikkat ederek lamı eğin ve PBS'yi yavaşça aspire edin.Ardından, jöle halkasını dikkatlice taze hazırlanmış bloklama çözeltisiyle doldurun ve lamı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika sonra, bloklama çözeltisini primer antikor içeren bloklama çözeltisiyle değiştirin.Ve lamı dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün primer antikoru uzaklaştırın ve bloklama solüsyonunu üç kez uygulayıp kaldırarak lamı yıkayın. Her bir bloklama uygulamasını 10 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, bloklama solüsyonunda seyrelteçlenmiş sekonder antikoru ekleyin ve lamı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra lamı iki kez bloklama solüsyonuyla ve ardından bir kez PBS ile yıkayın. Sonrasında, örneğin kurumasına izin vermeden mümkün olduğunca fazla PBS'yi uzaklaştırın ve örneğin etrafındaki jöleyi dikkatlice temizleyin.Numunenin üzerine bir damla bağlama medyumu uygulayın, ardından bir kapatma camı yerleştirin ve oje ile mühürleyin. Daha sonra lamları karanlıkta, dört derece Celsius'ta saklayın. RNAi kütüphanesi plağını eksi 80 derece Celsius'tan kuru buza aktarın.Sızdırmazlık bandını çıkarın. Ardından ilgili klonu seçici agara aktarın. Sonrasında klonu ekim yapın ve bakterileri gece boyunca büyütün.Kütüphane plağını -80 °C dondurucuya geri yerleştirmeden önce yeni sızdırmazlık bandı uygulayın. Ertesi gün, plaktaki kolonileri ampicillin içeren 1 mL'lik sıvı besiyeri alikotlarına inoküle edin. Ardından bunları 37 °C'de yaklaşık 14 saat boyunca çalkalayın.Ertesi gün, klon başına 200 µL'yi ayrı RNAi plaklarına ekin. Plakların kurumasına izin verin ve oda sıcaklığında gece boyu inkübasyon ile RNAi üretimini indükleyin. Bir gün sonra, hedef alınan spesifik gen ile etiketlenmiş her bir RNAi plağına beş adet L4 evresindeki solucanı aktarın.Ardından plakaları tipik olarak 20 °C'deki bir inkübatöre aktarın. İlk olarak, kontrol ve RNAi hayvanlarını düşük ve yüksek büyütmede parlak ışık altında inceleyin. Daha sonra, kontrol ve RNAi hayvanlarını uygun filtreler altında floresan ışıkla inceleyin.Fenotipleri arayarak, RNAi uygulanmış hayvanların bulunduğu plakayı sol üstten sağ alta kadar sistematik olarak tarayın. İlgilenilen hayvanları tespit edin. Seçilen RNAi fenotiplerini daha yakından incelemek için bağırsak bölgesine odaklanın ve tubulogenez ile lümen morfojenez fenotiplerini değerlendirmek için yakınlaştırmayı kullanın.Konfokal mikroskobu altında incelenecek solucanları öncelikle elle monte etmek ve immobilize etmek için bir lam üzerine vakum gresi veya vazelinle ince bir daire oluşturun. Gres tabakası ince olmalı ve 0.1 milimetreden daha kalın olmamalıdır. Ardından, dairenin ortasına yaklaşık 3.5 µL 10 mM sodyum azid ekleyin.Ardından, çözelti kurumadan önce bir diseksiyon mikroskobu altında ilgilenilen solucanları hızla çözeltiye alın. Daha sonra nazikçe bir lam pili yerleştirin ve hayvanları 30 dakika içinde görüntüleyin. Hafif bir basınç uygulayın ve solucanların çözelti içinde yüzmediğini mikroskop altında doğrulayın.Konfokal mikroskop altında solucanları düşük büyütmede bulun ve odakla. Ardından, bağırsağı görüntülemek ve görüntülerini almak için 60 veya 100X yağ daldırma objektif kullan. Sonrasında, ilgilenilen hücresel defekti gösteren alanları seçmek için hayvanı uygun kanalla floresan ışık altında incele.Fotobeyazlamayı önlemek için hızlı hareket edin. Ardından lazer taramaya geçin ve tarama sınırlarını dorsal ve ventral taraflara ayarlayarak görüntüyü bağırsakla sınırlandırın. Bir görüntü serisi yakalayın ve daha sonra görüntüleri tek bir projeksiyon görüntüsü halinde birleştirin.Bu protokol, apikal membran ve lümen morfojenezinin eş zamanlı gerçekleştiği gelişmekte olan C.elegans bağırsağında, polarize membran biyojenezinin moleküler olarak nasıl analiz edileceğini ve görsel olarak nasıl ayrıştırılacağını açıklamaktadır. Apikal ve bazolateral membran domainleri, membrana ilişkili bağlantılar ve intestinal lümen çözümlenebilir ve gelişim boyunca birbirleriyle olan ilişkileri incelenebilir. Bu hücre altı bileşenler, beraberindeki makalede açıklandığı üzere, çift veya üçlü etiketleme için floresan işaretli antikorlar veya floresan füzyon proteinleri ile işaretlenebilir.Kaba lümen defektleri, bir disseksiyon floresan mikroskobu kullanılarak hızlıca taranabilir GFP ile eşleşmiş apikal membran sitoskelet bağlayıcısı ERM-1, bir RNAi taraması için yararlı olan güçlü bir şekilde eksprese edilen bir marker'dır. Bu marker kullanıldığında, temelindeki gen defektleriyle birlikte bir dizi yeni bağırsak lümeni morfojenez ve polarite fenotipi ortaya çıkarılmıştır.Ardından, temel kusurları daha iyi anlamak için fenotipleri daha dikkatli incelemek amacıyla konfokal lazer tarama ile elde edilen yüksek büyütmeli görüntüler kullanıldı. Bazı fenotipler nicelleştirilebildi. Nicelleştirme, bu tür kusurları karşılaştırmak ve gelişim boyunca ilerleyişlerini takip etmek için kullanıldı.Bu videoyu izledikten sonra, immün boyama ile intestinal membran ve endo membran kompartmanlarının nasıl etiketleneceğini ve polarize membran ile lümen biyogenezinin fonksiyonel RNAi fenotiplerinin nasıl analiz edileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.

the-c-elegans-intestine-as-model-for-intercellular-lumen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Bu videoda, kütikülü bozarak C. elegans dokularını antikor boyaması için erişilebilir hale getirme yöntemi olan donarak kırma işlemi açıklanmaktadır.

Nematodların Donarak Parçalanması: İç Solucan Dokularını Boyama İçin Açığa Çıkarmak İçin Bir Yöntem

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Öğrenin, C. elegans bağırsağında polarize membran biyogenezini ve lumen morfogenezini tek hücre düzeyinde in vivo analiz etmek için antikor boyama, RNAi ve görüntüleme tekniklerini.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme (Video) | JoVE Journal

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Daha fazla video keşfet