C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bu standart yöntem kombinasyonunun genel amacı, C. elegans bağırsağının tek hücreli ve hücre altı düzeyde polarize membran biyogenezi ve lümen morfogenezinin in vivo analizi için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu yöntem, morfogenez sırasında ve sonrasında apikal ve bazolateral membran alanlarının ve diğer hücre altı asimetrilerin nasıl kurulduğu ve sürdürüldüğü gibi polarite ve biyogenez alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu model sistemin ana avantajı, sadece 20 hücreden oluşan bu şeffaf tek katmanın, tek hücreli polarize membranı ve lümen biyogenezini incelemek için in vivo doku odasında hayatta kalabilmesidir.

Teknikler, diğer C.Elegans morfogenez fenotiplerinin analizine genişletilebilir, burada odak noktası, membran biyogenezinin, özellikle apikal membran ve lümen biyogenezinin analizidir. Prosedürler, zar alanlarını ve hücre altı bileşenleri ayırt etmek ve bir C.elegans bağırsağındaki lümen morfogenez fenotiplerini tanımlamak için sabit ve canlı hayvanlarda rafine görüntüleme tekniklerini içerir. Bağırsak tübülogenezi ile ilgili bu videoya, polarize membran biyogenezinin in vivo analizinin yapıldığı boşaltım kanalı tubulogenezi karşılıklı bilgilendirici modeller hakkında bir video eşlik etmektedir.

Etiketleme ile ilgili olarak, canlı görüntüleme için floresan olarak işaretlenmiş füzyon proteinlerine sahip transgenik hayvanların üretimi, boşaltım kanalı tubulogenezinin analizine ilişkin ekteki videoda açıklanmaktadır. Bu tür hayvanlar doğrudan RNAi deneylerinde kullanılabilir. Üçüncü nesil, tipik olarak bu prosedür kombinasyonundaki ilk adımdır.

Bu video, hayvanların düzeltilmesi gereken alternatif etiketleme yöntemi antikor boyama ile başlar. Farklı etiketleme prosedürleri, tipik olarak son görüntüleme analizi için kullanılan immünohistokimya ile birleştirilebilir. Bu protokol ayrıca bağırsağa özgü membran belirteçleri, destekleyiciler ve her iki etiketleme prosedürü için yararlı olan diğer kaynakların örneklerine sahiptir.

İmmünohistokimyayı gösterdikten sonra, bu video, RNAi kullanarak polarite ve lümen morfogenezi fenotiplerini aramak için bağırsak apikal zarını ERM-1 GFP ile etiketleyen transgenik bir suş kullanır. İlk önce solucanları düzeltmek için bir slayt hazırlayın. Bir slayt üzerine 30 mikrolitre poli-L-lizin pipetleyin ve ardından diğerinin üzerine ikinci bir slayt yerleştirin ve çözeltiyi her ikisine de eşit şekilde yaymak için bunları birlikte bırakın.

Şimdi iki slaytı ayırın ve 30 dakika kurumaya bırakın. Ardından, sıvı nitrojenle dolu bir kabın içine düz bir metal blok yerleştirin. Plakaları M9 solüsyonu ile yıkayın ve solucanları içeren yaklaşık 10 mikrolitre M9 aktarın.

Alternatif olarak, solucanları toplayın ve slayta M9 ekleyin. Solucanlar aktarıldıktan sonra, üzerlerine çapraz yollardan bir kapak kayması, kapak kaymasının bir kenarından sarkacak şekilde nazikçe bırakın. Ardından herhangi bir yanal hareket yapmadan kapak kızağına hafifçe bastırın.

Şimdi slaytı hemen sıvı nitrojen içindeki metal bloğa aktarın ve donmasına izin verin. Beş dakika sonra, çıkıntılı kenarı kullanarak kapak sürgüsünü hafifçe vurun. Kütikülün uygun çatlağını elde etmek için bunu hızlı bir şekilde yapın.

Ardından, slaytı eksi 20 santigrat derecede metanol dolu bir cam Coplin kavanozuna daldırın. Beş dakika sonra, slaytı aynı sıcaklıkta beş dakika daha aseton dolgulu bir cam Coplin kavanozuna aktarın. Slaytlar doğrudan boyanabilir veya eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Slaytı asetondan çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Ardından, sürgünün alt tarafında dairesel bir vazelin duvarının konumunu işaretleyin, ardından jöle duvarını oluşturun. Bu işlem sırasında jöleyi ovalamayın.

Ardından, ıslak kağıt havlularla dolu bir çöp kutusunda ıslak bir oda hazırlayın ve slaytı içindeki bir rafa yerleştirin. Havlular ile kaydırak arasında veya bitişik kaydıraklar arasında temas olmamalıdır. Şimdi alanı kaplayacak kadar PBS'yi jöle çemberine pipetleyin.

Dairenin kenarına nazikçe bir pipet ucu yerleştirin ve sıvının solucanlar üzerinde düzgün bir şekilde dağılmasına izin verin. Ardından kapağı kapatın ve beş dakika bekleyin. Beş dakika sonra, slaytı eğin ve slayttan solucanları kaybetmemeye dikkat ederek PBS'yi yavaşça aspire edin.

Daha sonra, jöle çemberini dikkatlice taze hazırlanmış engelleme çözeltisi ile doldurun. Ve slaytın oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmesine izin verin. 15 dakika sonra, blokaj solüsyonunu birincil antikoru içeren blokaj solüsyonu ile değiştirin.

Ve slaydı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün primer antikoru çıkarın ve blokaj solüsyonunu üç kez uygulayarak ve çıkararak slaytı yıkayın. Her blok uygulamasının 10 dakika inkübe etmesine izin verin.

Daha sonra, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ikincil antikoru ekleyin ve slaytı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra slaytı iki kez bloke edici solüsyonla ve ardından bir kez PBS ile yıkayın. Ardından, numunenin kurumasına izin vermeden mümkün olduğunca PBS'yi çıkarın ve numunenin etrafındaki jöleyi dikkatlice çıkarın.

Numuneye bir damla montaj ortamı uygulayın, ardından bir kapak fişi ve bir oje contası uygulayın. Ardından slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. RNAi kütüphane plakasını eksi 80 santigrat dereceden kuru buza aktarın.

Sızdırmazlık bandını çıkarın. Ve ilgilenilen klonu seçici burgu üzerine aktarın. Sonra klonu çizin ve bakterileri gece boyunca büyütün.

Kütüphane plakasını eksi 80 santigrat derece dondurucuya geri koymadan önce yeni sızdırmazlık bandı uygulayın. Ertesi gün, kolonileri plakadan ampisilin içeren bir mililitre sıvı ortam alikotuna aşılayın. Daha sonra 37 santigrat derecede yaklaşık 14 saat çalkalayın.

Ertesi gün, klon başına 200 mikrolitreyi ayrı RNAi plakalarına tohumlayın. Plakaların kurumasını bekleyin ve oda sıcaklığında bir gece boyunca inkübasyon ile RNAi üretimini indükleyin. Bir gün sonra, hedeflenen spesifik gen ile etiketlenmiş her bir RNAi plakasına beş L4 aşama solucanı aktarın.

Daha sonra plakaları tipik olarak 20 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın. İlk olarak, düşük ve yüksek büyütmede parlak ışık altında RNAi hayvanlarına karşı kontrolü inceleyin. Daha sonra, uygun filtreler altında floresan ışığı altında RNAi hayvanlarına karşı kontrolü inceleyin.

Tüm plakanın sol üst kısmından sağ alt kısmına kadar RNAi hayvanları olan bir plakayı sistematik olarak tarayın ve fenotipleri arayın. İlgilendiğiniz hayvanları arayın. Seçilen RNAi fenotiplerinin daha yakından incelenmesi için bağırsağa odaklanın ve tubulogenez ve lümen morfogenezi fenotiplerini değerlendirmek için yakınlaştırmayı kullanın.

İlgilenilen solucanları konfokal mikroskopi altında incelemek için, önce bunları elle monte edin ve hareketsiz hale getirin, bir cam slayt üzerine ince bir vakumlu gres veya vazelin çemberi yapın. Yağ tabakası ince olmalı, 0,1 milimetreden daha kalın olmamalıdır. Daha sonra dairenin ortasına yaklaşık 3,5 mikrolitre 10 milimolar sodyum azid ekleyin.

Daha sonra, çözelti kurumadan önce bir diseksiyon mikroskobu altında çözeltiye ilgilenilen solucanları hızla toplayın. Ardından nazikçe bir kapak fişi uygulayın ve hayvanları 30 dakika içinde görüntüleyin. Hafif bir basınç kullanın ve mikroskop altında solucanların çözelti içinde yüzmediğini doğrulayın.

Konfokal mikroskop altında, solucanları düşük güç altında bulun ve odaklanın. Ardından, bağırsağı görüntülemek ve görüntülemek için 60 veya 100X yağa daldırma objektifi kullanın. Daha sonra, ilgilenilen hücresel kusuru gösteren alanları seçmek için hayvanı uygun kanalla floresan ışığı altında inceleyin.

Fotoğraf ağarmasını önlemek için hızlı hareket edin. Ardından lazer taramaya geçin ve sırt ve ventral tarafında tarama sınırlarını ayarlayarak görüntüyü bağırsakla sınırlayın. Bir görüntü serisi yakalayın ve daha sonra görüntüleri tek bir projeksiyon görüntüsünde birleştirin.

Bu protokol, apikal membran ve lümen morfogenezinin çakıştığı gelişmekte olan C.elegans bağırsağında polarize membran biyogenezinin moleküler olarak nasıl analiz edileceğini ve görsel olarak nasıl inceleneceğini açıklar. Apikal ve bazolateral membran alanları, membran ilişkili bağlantılar ve bağırsak lümeni çözülebilir ve bunların birbirleriyle olan ilişkileri gelişim boyunca incelenebilir. Bu alt hücresel bileşenler, ekteki makalede tarif edildiği gibi çift veya üçlü etiketleme için floresan etiketli antikorlar veya floresan füzyon proteinleri ile etiketlenebilir.

Brüt lümen kusurları, diseksiyon floresan mikroskobu kullanılarak hızlı bir şekilde taranabilir. GFP'ye bağlı apikal membran hücre iskeleti bağlayıcısı ERM-1, bir RNAi ekranı için yararlı olan, sağlam bir şekilde ifade edilen bir belirteçtir. Bu belirteç kullanılırken bir dizi yeni bağırsak lümen morfogenezi ve polarite fenotipi ile birlikte altta yatan gen kusurları ortaya çıkarıldı.

Daha sonra, altta yatan kusurları daha iyi anlamak için fenotipleri daha dikkatli bir şekilde incelemek için konfokal lazer taraması ile elde edilen daha yüksek büyütmeli görüntüler kullanıldı. Bazı fenotipler ölçülebilir. Bu tür kusurları karşılaştırmak ve geliştirme boyunca ilerlemelerini izlemek için niceleme kullanıldı.

Bu videoyu izledikten sonra, bağırsak zarı ve iç zar bölmelerinin immüno boyama ile nasıl etiketleneceğini ve polarize zar ve lümen biyogenezinin fonksiyon RNAi fenotiplerinin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.