Name: C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin C. elegans atık kanalında tek hücreli tübülogenez ve polarize membran biyogenezini in vivo analiz etmek için GFP füzyon etiketleme, RNAi tarama ve konfokal görüntüleme yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M. Buechner (University of Kansas, Kansas, ABD), K. Nehrke (Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi, Rochester, New York, ABD) ve Caenorhabditis genetik Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Office araştırma altyapı finanse teşekkür ediyoruz Programlar (P40 OD010440). Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir

<ol><li>Lubarsky, B., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+morphogenesis%3A+making+and+shaping+biological+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes.</a> Cell. 112 (1), (2003).</li>
<li>Sundaram, M. V., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+make+the+doughnuts%3A+Building+and+shaping+seamless+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes.</a> Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).</li>
<li>Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine+as+a+model+for+intercellular+lumen+morphogenesis+and+in+vivo+polarized+membrane+biogenesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Andrew, D. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+epithelial+tubes%3A+Insights+into+tube+formation%2C+elongation%2C+and+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation.</a> Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).</li>
<li>Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ultrastruct.+Res%22%5BJournal%5D)">Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system.</a> J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).</li>
<li>Sundaram, M. V., Buechner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Excretory+System%3A+A+Model+for+Tubulogenesis%2C+Cell+Fate+Specification%2C+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity.</a> Genetics. 203 (1), 35(2016).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretory+system%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Excretory system.</a> WormAtlas. , (2009).</li>
<li>Buechner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubes+and+the+single+C.+elegans+excretory+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubes and the single C. elegans excretory cell.</a> Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).</li>
<li>Khan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+lumen+extension+requires+ERM-1-dependent+apical+membrane+expansion+and+AQP-8-mediated+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux.</a> Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).</li>
<li>Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+unicellular+tube+extension+depending+on+the+lymphatic+vessel+determinant+Prox1+and+on+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation.</a> Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).</li>
<li>Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+canal+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+are+defective+in+the+apical+membrane+domain+of+the+renal+%28excretory%29+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell.</a> Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li>
<li>Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006
 <a target="_blank" href="http://www. wormbook.org ">http://www. wormbook.org </a> (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).</li>
<li>Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+set+of+lacZ+fusion+vectors+for+studying+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 93 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006
 <a target="_blank" href="http://www. wormbook.org">http://www. wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Hibbs, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHibbs%2C+AR+%22Confocal+Microscopy+for+Biologists%22">Confocal Microscopy for Biologists</a>. , Springer. US. (2004).</li>
<li>Bankhead, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBankhead%2C+P+%22Analyzing+fluorescence+microscopy+images+with+ImageJ%22">Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ</a>. , (2014).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+Targeting+and+the+CRISPR+Revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution.</a> Science. 344 (6185), 707-708 (2014).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
<li>Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+cloning+for+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gateway cloning for protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+fusion-based+approach+to+create+reporter+gene+constructs+for+expression+analysis+in+transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans.</a> Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).</li>
<li>Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CLIC-like+protein+required+for+intracellular+tube+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance.</a> Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).</li>
<li>Mattingly, B. C., Buechner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGD+homologue+EXC-5+regulates+apical+trafficking+in+C.+elegans+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules.</a> Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).</li>
<li>Shaye, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disease-associated+formin+INF2%2FEXC-6+organizes+lumen+and+cell+outgrowth+during+tubulogenesis+by+regulating+F-actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons.</a> Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).</li>
<li>Lant, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCM-3%2FSTRIPAK+promotes+seamless+tube+extension+through+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling.</a> Nat. Commun. 6 (6), 6449(2015).</li>
<li>Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-EM+localization+of+GFP-tagged+yolk+proteins+in+C.+elegans+using+microwave+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation.</a> J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).</li>
<li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Sherman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abts+and+sulp+families+of+anion+transporters+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).</li>
<li>Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , 
 <a target="_blank" href="http://cbs.umn.edu/cgc/home">http://cbs.umn.edu/cgc/home</a> (2017).</li>
<li>Wormbase. , 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org/">http://www.wormbase.org/</a> (2017).</li>
<li>Transgeneome website. , 
 <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017).</li>
<li>C. elegans expression pattern. , 
 <a target="_blank" href="http://gfpworm.org/">http://gfpworm.org/</a> (2017).</li>
<li>National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , 
 <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ ">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ </a> (2017).</li>
<li>Heppert, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+fluorescent+proteins+for+in+vivo+imaging+in+an+animal+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>GeneMANIA. , 
 <a target="_blank" href="http://genemania.org/ ">http://genemania.org/ </a> (2017).</li>
<li>AceView. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ </a> (2017).</li>
<li>iHOP. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / ">http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / </a> (2017).</li>
<li>Saccharomyces Genome Database. , 
 <a target="_blank" href="http://www.yeastgenome.org ">http://www.yeastgenome.org </a> (2017).</li>
<li>Flybase. , 
 <a target="_blank" href="http://www.flybase.org ">http://www.flybase.org </a> (2017).</li>
<li>Mouse Genome Database. , 
 <a target="_blank" href="http://www.informatics.jax.org">http://www.informatics.jax.org</a> (2017).</li>
<li>Human Genome Database. , 
 <a target="_blank" href="http://www.gdb.org ">http://www.gdb.org </a> (2017).</li>
<li>BLAST. , 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi </a> (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

C. elegans genetik çok yönlülük, şeffaflık, basit vücut planı ve sabit hücre soyu morfogenez analizi için mükemmel bir model olun. Bu iletişim kuralı standart genetik manipülasyon ve görüntüleme birleştirmek açıklar 2 mikron yararlanmak için çalışmalar ince polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez bir tek hücre tüp çalışmaya C. elegans boşaltım kanallar.
Etiketleme C. elegans boşaltım kanalları canlı analiz (burada açıklanan) izin floresan fü...

Tüm iç organları tüpler, taşıma ve gazlar, sıvılar ve besin alışverişini ve metabolik atık atılımı gibi birçok farklı fonksiyonları için çok önemli oluşur. Onların polarize karakterle ayrı apikal ve lumenal membran, bu belirli işlevler için uyarlanmış ve dipnotlar endo - ve plazma membran sistemlerinin hatalarını insan hastalık1,2sık bir nedenidir. Tüpler damarlara ve iç organlara çoğunluğu çok hücreli ve bir Lümen intercellularly oluşturur; Ancak, Lümen intracellularly oluşturan, tek hücreli tüpler, örneğin, insan kapiller yatak%230-50'si kadar temsil edebilir. Onların microdomains göre tüp'ın belirli işlevi (örneğin, boşaltım kanalı kanalcık Caenorhabditis bağırsak microvilli karşı farklı olabilir polarize membranları ile multi - tek hücreli tüpler kompozisyon, benzer olmakla birlikte elegans; bkz. kağıt üzerinde C. elegans bağırsak tubulogenesis eşlik eden)3. Polarize membran dipnotlar ve tubulogenesis ilkelerine metazoans arasında korunmuş ve benzer bir moleküler makineler onları1,2,4yönlendirir.
C. elegans boşaltım sistemi beş hücreleri oluşur: boşaltım hücre (EC), kanal hücre (DC), gözenek (PC) ve iki bezi hücreyi. Ablasyon EC, DC veya PC vücut boşluğu ve hayvanlar die erken bir larva sahne5sıvı birikimine neden olur. Bu üç tek hücreli tüpler intriguingly, onların Lümen üç farklı yöntemleri kullanarak oluşturmalısınız: hücre (EC) oymaya; Hücre kaydırma birleştiğinde autocellular junction oluşumu (PC); ve hücre kaydırma tarafından (DC); autofusion ile birleştiğinde Tüm filogenetik korunmuş6,7olan farklı mekanizmaları Lümen morfogenez. Posterior faringeal ampul yanal sol kısmında bulunan EC, iki yanal uzantıları dışarı hangi dört Kanallar anteriorly genişletmek için dışarı şube ve özafagusu (tarafında her iki sağ ve sol) solucan'ın burun ve kuyruk ucuna gönderir , sırasıyla (şekil 1)5,6,8. EC 2 x 1000 µm için yapım o büyük hücre içinde hayvan yaklaşık 1 µm kadar uzanır. Bir hücre altı düzeyde boşaltım kanalı bir Bazal membran doğru pseudocoelom yönettiği ve lumenal membran (endotube) tarafından tünel oluşturulmuş basit bir tüp var. Kanal lumenal membran kanal lumenal membran sadece hücreler arası kavşağında bağlanır; Kanallar aksi takdirde onların uzunlukları (şekil 1) junctionless. Boşaltım kanalı lumenal membran ve onun submembraneous sitoiskeleti apikal membran bileşimi ve submembraneous sitoiskeleti bağırsak gibi çok hücreli tüpler benzer moleküler onların kompozisyon tarafından tanımlanan apikal,, ve diğer (örneğin, düz) epiteli. Sitoplazmik organelleri, endomembranes kanal uzunluğu boyunca dağıtılır endosomal veziküler ve diğer (örneğin, Golgi) dahil olmak üzere. Ayrıca, birden çok canalicular veziküller - lumenal membran için bağlı ve/veya bağlı ya da izole - kanal sitoplazma7,8,9' dan,10 dişli . Bu dinamik plazma-membran/canalicular bağlantı daha fazla kanal'ın membran sistem genişletir ve her iki Lümen morfogenez ve ozmoregülasyon10için katkıda bulunur. Boşaltım kanalı böylece neredeyse tamamen endo - ve plazma membran, mükemmel bir model polarize membran dipnotlar çözümleme ve düzenleme, endo-plazma zarı arayüzü sağlayan oluşur. Apikal membran dramatik genişleme kanal morfogenez - bu tek hücreli sistemde Lümen uzantısıyla – çakışık sırasında da stabilize ve hücre içi lumenal membran Merkezi gerek tarafından kaynaklanan mimari sorunlarını analiz etmek için sağlar. . Bu iletişim kuralı kanal tüp ve Lümen'ın yapısal morfogenez ve bu işlemi için gereken hücre içi zar dinamiği analizi yerine AK 's konumda oluşturmak hücre hareketlerini doğrudan sinyalleri odaklanır boşaltım sistemi ve diğer hücresel öğelere (6' gözden), karmaşık bağlantıları oluşturun.
Bir daha fazla polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez analizi için C. elegans tek hücreli kanal sistemi ayırmak, gelişimsel zaman içinde farklı bileşenleri, membran üretimi için onun yetenek avantajdır ve kavşak. EC ventral kapanış saatinde tarihi ve ventro-yanal sırasında zaman yanal kanal uzantısı ve dallanma ortaya orta embriyo5,6,8sırasında yutak yerleşir. Bu geç embriyogenez, L1-larva sahne (şekil 1) devam ediyor bir işlem sırasında ön-arka kanal uzantısı tarafından takip ediyor. Yeni taranmış bir larva, arka kanal ucunu solucan yaklaşık yarısı ulaşır, kuyruk L1 aşamasının sonunda hangi süre sonra kanal tam genişletme ile birlikte solucan8uzatıyor. İlk larva aşamasında etkin kanal büyüme bu hayvanın büyüme böylece aşan bir hızda biter, ancak, daha fazla büyüme paralelinde bütün hayvan büyüme ek larva aşamaları (L2-4) sırasında oluşur. Bu ayar farklı adımları polarize de novo membran dipnotlar polarize hücre bölünmesi veya geçiş bağımsız analiz etmek için fırsat sağlar. Ayrıca, bu bu işlem ayrılması (hangi Lümen başlatma önce embriyo içinde meydana) kavşaklar derlemesinden izin verir; onların tam membran polarizasyon içinde hala bir açık soru polarite alanındaki gereksinimdir. Son olarak, benzersiz olarak apikal Bazal membran genişleme, eski boşaltım Kanallar10' önceki ikinci işlem üzerinden ayırır. C. elegans boşaltım kanalı modeli bu nedenle bu avantajları polarize membran Biyogenez analizi için bir dizi hisse ama çok hücreli bir ortamda (bkz: yürütür bağırsak modeli özellikle bilgilendirici bir tamamlayıcıdır eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis3).
Vahşi-türü kanallar bu küçük solucan ultrathin tübüllerin olmakla birlikte, onların Lümen VI olabilirNomarski optik bu şeffaf hayvan tarafından doğrudan sualized. Aslında, mutant Kistik kanal türleri Morfoloji düşük büyütme ileri genetik ekranlarda büyük etkisi genlerin tubulogenesis11' de yer alan tanımlamak için kullanılmıştır mikroskobu dissekan kullanarak etiketsiz hayvanlarda karakterize edilebilir. Geliştirilmiş görsel Kanallar morfolojisi ve onların polarize membranlar, hücre iskeleti bileşenleri, farklı hücre içi organellerin ve diğer hücre altı yapıları, bir ayrım olarak ancak, etiketleme gerektirir ve daha yüksek güç floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu. Etiketleme ve mikroskopi için zorluklar çok sayıda Kanallar fine yapısı pozlar rağmen belirli molekülleri her bölmesi için benzersiz üzerinden ayrılır membranlar ve hücre altı bileşenleri ve hayvanların güvenli bir şekilde mikroskopi için Eğer monte edilebilir (bkz: protokolü ve tartışma) eserler tanıtımı önlemek için bazı önlemler alındı. Etiketleme-ebilmek kılınmak sabit örnekler immünhistokimya veya transgenik solucanlar floresan füzyon protein kendi kontrolü altında ifade oluşturarak veya boşaltım kanalı özel Organizatör vivo içinde görüntüleme için. Bu iletişim kuralı ikinci etiketleme tekniği açıklar (eşlik eden kağıt3boyama antikor için bağırsak tubulogenesis bakınız).
Vivo kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu çalışmalar tek hücre analiz görüntüleme vivo içinde birleştirmek için yetenek düzey geliştirme yapar C. elegans boşaltım kanalı için moleküler özellikle güçlü bir model ve tek hücreli tubulogenesis hücresel analizi. İleriye veya geriye doğru genetik ekranlar gerçekleştirilen kanal morfogenez fenotipleri (örneğin, kistleri) tanımlamak için bir vahşi-türü veya etiketli transgenik hayvan ile başlayan ve onların temel gen kusurları. Alternatif olarak, bu tür ekranları mutant fenotip (örneğin, Kistik bir kanal) başlatmak ve bastırıcılarının veya bu fenotip arttırıcılar işlevsel olarak etkileşim genleri mutasyona uğramış fenotip neden gen ile tanımlamak için tanımlar. Mutant fenotip neden olan genetik bozukluk bir kaybı (örneğin, gen silme üzerinden ) ya da bir kazanç neden olabilir (örneğin, üzerinden aktive bir mutasyon ya da aşırı Gen kopya getirilmesi yolu ile) incelenen işlev. İleriye doğru mutagenesis ya da sistematik RNAi ekranlar önyargılarını gen işlevi olmadan ve genler faiz işlevinde yer tarafsız tanımlanmasına izin. Böyle ilgi herhangi bir gen veya gen (örneğin, hedeflenen ekranlar) herhangi bir grup da hızla probed genom çapında RNAi kitaplıkları besleme durumu göz önüne alındığında, hemen hemen her gen kolayca C. elegans, RNAi tarafından nakavt bir ters genetik yaklaşım kendi etki için. Yaklaşımlar olası birleşimini göstermek için biz burada bir hedeflenen RNAi etkileşimi ekran, bir işlev kazanç Kistik boşaltım kanalı mutant ile başlayan tarif sitoplazmik kanal yeşil flüoresan protein (GFP) ile Etiketlenmiş. Mutant fenotip erm-1, son derece korunmuş C. elegans overexpression tarafından oluşturulan ortholog membran-aktin bağlayıcı ailesinin Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), lumen morfogenez ve membran karıştığı birçok tür12kuruluşta. C. elegans ERM-1 boşaltım kanalı ve bağırsak, gibi iç organların lumenal membranlar yerelleştirir ve her iki13Lümen oluşumu için gereklidir. ERM-1 overexpression fazla aktin ve akı Lümen artan ve kısa bir Kistik kanal ve bükük lumenal membran kalınlaşmış aktin astar boya9ile üreten kanal lumenal zar, veziküller acemi. Protokol transgenik suşları ile boşaltım kanalı ifade oluşturmak füzyon protein (veya diğer proteinler); etiketli açıklar nasıl bir kanal fenotip değiştiriciler tanımlamak için böyle suşları ile başlayan hedeflenen RNAi ekranlar gerçekleştirmek için; ve görsel olarak bilgilendirici tubulogenesis fenotipleri ölçmek için basit yollar dahil olmak üzere Floresans diseksiyon ve confocal mikroskobu tarafından bu tür ekranları sonuçlarını analiz etme. Etiketleme teknikleri ve öldürücü tubulogenesis genler için ayarlanmış RNAi ayrıntılarını alternatif bağırsak tubulogenesis3eşlik eden kağıda bulunabilir. Tüm yöntemleri çeşitli kombinasyonlarda kanal tubulogenesis diğer sorulara incelenmesi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Klonlama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pPD95.75</td><td>Addgene</td><td>Cat. 37464</td><td></td></tr><tr><td>PCR Kiti</td><td>Qiagen</td><td>Cat. 27106</td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>Kedisi. Hayır. E2611L</td><td></td></tr><tr><td>DNA işaretleyici</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. Hayır. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz DNA sınıfı</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td>. Hayır. BP164-100</td><td></td></tr><tr><td>Yetkili hücreler</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. Hayır. C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td>. Hayır. BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Kedi</td><td>. Hayır. ED-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td>. Hayır. A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td>. Hayır. BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Ekipmanlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PCR makinesi ve nbsp;</td><td>MJ Araştırma</td><td>Kedisi. Hayır. PTG-200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>kedi. No. 5415C</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Hassas Bilimsel&nbsp;</td><td>kedi. Hayır. 666A3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jel koşu aleti</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. 09-528-165</td><td></td></tr><tr><td>Jel çalışan güç kaynağı</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. 45-000-465</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Görüntüleyici&nbsp; Jel Doc XR Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>Kedi. No. 1708195EDU</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spektrofotometre</td><td>Termo Bilimsel</td><td>Kat. Hayır. ND1000</td><td></td></tr><tr><td>C elegans ilgili1</td><td></td><td></td><td>1bkz. referans<>sup19 standart C. elegans kültürü ve bakım prosedürleri için.</td></tr><tr><td>LB Orta ve plakalar2</td><td></td><td></td><td>2protokoller için reference19 bakın.</td></tr><tr><td>Tripton&nbsp;</td><td>Acros Organik</td><td>Kat. hayır. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Cat</td><td>. hayır. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin Sigma</td><td></td><td>Cat. no. A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. hayır. BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Orta2</td><td></td><td></td><td>2protokoller için reference19 adresine bakın.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Kat</td><td>. no. S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Cat</td><td>. no. M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM plakaları 2</td><td></td><td></td><td>2protokoller için reference19 adresine bakın.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Kat</td><td>. hayır. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Tripton&nbsp;</td><td>Acros Organics Cat</td><td>. no. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. P0662</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>RNAi plakaları3</td>sup<<td></td><td></td><td>sup>3protokoller için reference21 adresine bakın.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Kat</td><td>. hayır. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Tripton&nbsp;</td><td>Acros Organics Cat</td><td>. no. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Kat. no. P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>ABD Biyolojik</td><td>Kedisi. hayır. I8500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Fisher Bilimsel Kedisi</td><td>. hayır. BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bilimsel Kat</td><td>. hayır. SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hipoklorit</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. hayır. 50371500</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Bakteriler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bakteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bakteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Genom çapında RNAi kütüphaneleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ahringer genom çapında RNAi besleme kütüphanesi (ref21,58,59)</td><td>Kaynak: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi besleme kütüphanesi (ref60)</td><td>Kaynak: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>MP Biomedicals,LLG</td><td>Cat. no. 193917</td><td></td></tr><tr><td> Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Vakumlu Gres Silikon</td><td>Beckman Cat</td><td>. no. 335148</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel Cat</td><td>. no. 4448</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü plakası, 6 kuyu&nbsp;</td><td>Corning A.Ş.</td><td>Kat. no. 08-772-33</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ-U diseksiyon mikroskobu (Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX12 diseksiyon mikroskobu (Olympus), yüksek güçlü stereo floresan eki (Kramer Scientific), Q yakalama yazılımına sahip CCD kamera ve X-Cite floresan lamba (Fotonik Çözümler).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SL Lazer taramalı konfokal mikroskop (Leica Microsystem)</td>ECLIPSE Ti-E ters çevrilmiş mikroskop (Nikon) <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>üzerine monte edilmiş C2 lazer taramalı konfokal</td></tr></tbody></table>

c. elegans excretory kanal hücre içi lumen morfogenez ve in vivo polarize membran biyogenez tek bir hücrede için bir model olarak: etiketleme gfp-füzyon, rnai etkileşimi ekran ve görüntüleme

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Dört C. elegans boşaltım Kanallar kurmak ve Lümen bir membran ve submembraneous ile stabilize etmek hemen hemen eşit kadar genişletilmiş hücre içi endotubes ile tek bir hücreden hayvan uzunluğu ile genişletilmiş dar tüpler vardır sitoiskeleti apikal karakter. Boşaltım hücre uzunluğu yaklaşık 2.000 kez bu model de novo polarize membran dipnotlar, hücre içi Lümen morfogenez vivo içinde değerlendirilmesi için benzersiz yaparak bu kanalları oluşturmak için genişler ve tek hücreli tubulogenesis. Burada sunulan iletişim kuralı standart etiketleme, kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu genetik ya da RNA müdahale (RNAi) birleştirmek gösterilmiştir-ve görsel olarak incelemek ve işlevsel olarak bu işlemlerin moleküler düzeyde çözümlemek için bu modeli kullanmak için mikroskobik yaklaşımlar. Etiketleme bir yaklaşım örneği protokol Transjenik hayvanlar ile floresan füzyon protein üretimi canlı tubulogenesis çözümlenmesi için özetliyor. Genetik bir yaklaşım örneği, bu işlev kazanç Kistik kanal fenotip değiştirmek için tasarlanmış bir görsel RNAi tabanlı etkileşim ekran kilit noktaları vurgular. Belirli yöntemleri açıklanan nasıl yapılır: etiket ve floresan proteinler; ifade ederek Kanallar görselleştirmek hedeflenen RNAi kütüphane oluşturmak ve kanal morfogenez moleküler analiz için eleme RNAi strateji; Kanal fenotipleri değişiklikler görsel olarak değerlendirmek; Onları Floresans mikroskobu dissekan tarafından Puan edinildi; hücre altı kanal bileşenleri daha yüksek çözünürlükte confocal mikroskobu tarafından karakterize; ve görsel parametrelerini ölçmek. Belirlenmesi ve genler hücre içi Lümen filogenetik korunmuş süreçlerinde yer alan ve tek hücreli karakterize C. elegans boşaltım kanalı yararlanarak ilgilenen araştırmacı için yararlı bir yaklaşımdır morfogenez tüp.

Bu iletişim kuralı, görsel ve tatlı tek hücreli tubulogenesis ve tek bir hücrede hücre içi Lümen morfogenez çözümlemek için C. elegans boşaltım Kanallar kullanmayı açıklamaktadır. Onların uzantısı sırasında orta embriyogenez zaman yetişkinlik, dört boşaltım Kanallar onların demiri ve apikal/lumenal membranlar için benzersiz bir model sağlar onların canalicular ve endosomal endomembrane sistemi ile birlikte genişlemeye devam de novo vivo içinde analizini membran ...

C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Bu standart prosedür kombinasyonunun genel amacı, C.elegans boşaltım kanalının tek hücreli tüp, hücre içi lümen ve de novo polarize membran biyogenezinin in vivo analizi için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu yöntem, genişletilmiş bir hücre içi lümenin nasıl oluştuğu veya apikal bir membranı genişletmek için hangi moleküllerin gerekli olduğu gibi, tübülogenez ve polarite alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu model sistemin temel avantajı, apikal ile bazal lateral membran arasındaki 2000 katlık devasa genişlemenin tek hücrede in vivo olarak görsel olarak kontrol edilebilmesidir.Genel olarak, bu modele yeni başlayan kişiler, C.elegans boşaltım kanalı çok ince olduğu ve ozmotik strese ve görüntüleme için gereken her türlü manipülasyona karşı hassas olduğu için zorluk yaşayacaklardır. Boşaltım kanalı tübülogenezine ilişkin bu videoya, polarize membran biyogenezinin in vivo analizi için birbirini tamamlayan modeller olan bağırsak tübülogenezi hakkında bir video eşlik etmektedir. İşaretleme ile ilgili olarak, bağırsak tübülogenezi hakkındaki eşlik eden video, hücresel bileşenlerin floresan işaretli antikorlarla boyandığı alternatif işaretleme prosedürünü açıklamaktadır.Bu teknik boşaltım kanalı için de uygulanabilir. Bu video, floresanla işaretlenmiş füzyon proteinlere sahip hayvanlar kullanılarak yapılan canlı görüntüleme analizini açıklamaktadır. İlgi duyulan bir genin GFP'ye bağlı olduğu bir plazmitin nasıl oluşturulacağı ve füzyon protein eksprese eden transgenik hayvanların nasıl üretileceği metinde açıklanmıştır.Protokol ayrıca boşaltım kanalıya özgü membran belirteçleri, organel belirteçleri ve promoter örnekleri de içermektedir. Her iki etiketleme prosedürü için diğer kaynaklar da sağlanmıştır. Bu videoda, kanal sitoplazmasını GFP ile etiketleyen ve kistik kanal fenotipine sahip olan transgenik bir suş, RNAi kullanılarak modifiyeler için taranmaktadır.Fenotip, bir lümen morfojenez geni olan ERM-1'in aşırı ekspresyonundan kaynaklanmaktadır. Ampisilin ve tetrasiklin içeren plakalarda gece boyunca büyütülen RNAi eksprese eden bakterilerden koloniler seçin ve bunları ampisilinli 600 µL sıvı LB besiyerine inoküle edin. Bu tüpleri altı saat boyunca 37 °C'de çalkalayıcıda inkübe edin.Sıvı kültürlerden, altı kuyucuklu RNAi plakalarının kuyucuklarına 70 µL'lik alikotları çift veya üçlü setler halinde ekleyin. Ardından, RNAi plakalarını 20 ila 22 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, üç adet L4 evresindeki solucanı seçin ve RNAi plakalarının her bir kuyucuğuna yerleştirin.Her biri sağlıklı ve iyi beslenmiş görünmeli ve boşaltım kanalında uygun markörü eksprese etmelidir. Ardından, plakaları 20 ila 22 derece Celsius'ta üç gün boyunca inkübe edin. Üç gün boyunca RNAi bakterilerini tükettikten sonra, F1 progenilerinin kanal fenotiplerini bir diseksiyon floresan mikroskobu altında inceleyin.Kanal uzanmasını skorlamak için L3 L4 larval evresindeki solucanları inceleyin. Bu prosedür için, taramanın tüm olası fenotiplerini içeren bir skorlama sayfası hazırlayın. Metin protokolünde çeşitli kanal fenotipleri tanımlanmıştır.Boş vektör RNAi bakterileriyle beslenen solucanlar gibi bir kontrolle başlayarak kuyucukları sistematik olarak tarayın. Önce düşük büyütmede ve ardından yüksek büyütmede parlak alan mikroskobu kullanarak embriyonik letalite, sterilite, şeffaf görünüm ve "dumpy" (çökük/kısa) görünüm gibi genel fenotipleri belirleyin. Bu gözlemleri değerlendirme formuna kaydedin.İkinci olarak, floresan ışık altında, önce düşük büyütmede, ardından daha yüksek büyütmede ekskresyon kanalı fenotiplerini inceleyin. Yakınlaştırarak kanal uzunluğu, lümen genişliği veya kist boyutu gibi ölçülebilir fenotipleri puanlayın. role gibi marker plazmidler, hayvanların ileriye doğru hareket etmesini engelleyip oldukları yerde kalmalarını sağlayarak görüntüleme için faydalı olabilir.Ayrıca, hayvanın kendi çevresinde dönmesiyle fenotip üzerinde geliştirilmiş bir görünüm sağlayabilir. Daha düşük penetransa sahip fenotipleri dikkate alan kantitatif bir analiz için plaka başına en az 100 hayvanı skorlayın. Bu deneyleri üç paralel (triplicate) olarak gerçekleştirin.Bu işlem sırasında, bir CCD kamera ve görüntü yakalama yazılımı kullanarak en az üç farklı hayvandan baskın fenotiplerin görüntülerini elde edin. Ardından hem düşük hem de yüksek büyütmelerde görüntüler alın. İlgilenilen solucanları konfokal mikroskopi ile analiz etmek için önce onları monte edin ve sabitleyin.Bir lam üzerine elle ince bir vakum gresi veya vazelin halkası oluşturun. Gres tabakası 0,1 milimetreden daha kalın olmamalıdır. Ardından, halkanın ortasına yaklaşık altı mikrolitre yüzde beşlik lidokain solüsyonu ekleyin.Ardından, çözelti kurumadan önce bir diseksiyon mikroskobu altında ilgi duyulan solucanları hızla seçerek çözeltinin içine alın. Sonra, bir lamelle örtü camını nazikçe gres dairesinin üzerine yerleştirin ve kendi ağırlığıyla oturmasını sağlayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında hareketsizliği kontrol edin.Solucanlar hasarsız olmalı ve çözelti içinde yüzmek yerine lama yapışmış durumda olmalıdır. Şimdi, lamellenin üzerine bir damla yağ damlatın ve konfokal mikroskoptaki 10x objektif ile parlak alan ışığı altında solucanlara odaklanın. Ardından, dikkatlice yağ daldırma objektife geçiş yapın ve işaretlenmiş boşaltım kanallarını görüntülemek için floresan ışık kullanımına geçin.Şimdi, görüntüleme için uygun bir örnek bulmak amacıyla boşaltım kanallarının hücresel ve alt hücresel fenotiplerini inceleyin. Fotobleaching'i önlemek için hızlı çalışın. Lümen şekline, lümen çapına ve kistlerin boyutuna ve şekline bakın.Ayrıca, apikal membran, bazal membran, sitoplazma, veziküller veya organeller gibi analiz için işaretlenmiş hücre altı bileşenleri inceleyin. Yazılım kontrolünü kullanarak lazer yoğunluğunu ayarlayın ve görüntüleri elde edin. En iyi çözünürlük için düşük kazanç (gain) kullanın, pinhole'u çok fazla açmayın ve görüntü başına yaklaşık dört ortalama kullanın.Ayrıca, renk yoğunluğunu aşırı doyurmayın. İlk olarak tek bir kesitin görüntüsünü alın, ardından z ekseni boyunca birden fazla kesitin görüntüsünü elde edin. Genellikle 15 ila 20 kesit yeterlidir.Kontrol panelindeki tarama alanında, boşaltım kanalının belirli bir bölgesine ayraç (bracket) yerleştirilerek kanalın bir alanı büyütülebilir. Çift veya çoklu etiketli kanallar için, kanallar arasındaki renk karışmasını (bleed-through) önlemek amacıyla ardışık tarama kullanılması kritik önem taşır. Aksi takdirde sinyallerin ko-lokalizasyon çalışmaları doğru olmayacaktır.Eş zamanlı olarak, kanal uzunluğunu veya lümen çaplarını solucanın vücut uzunluğu ve çapı ile ilişkili olarak nicelleştirmek için karşılık gelen DIC Nomarski görüntülerini edinin. Daha sonra, belirleyici noktaları göstermek için floresan ve Nomarski görüntülerini üst üste bindirin. Bu protokol, tek bir hücredeki tek hücreli tübülogenezi ve hücre içi lümen morfojenezini görsel ve moleküler olarak analiz etmek için C. elegans ekskresyon kanallarının nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.Apikal membranlar, sitoplazma ve endozomal veya kanaliküler veziküller gibi hücresel alt bileşenler, bileşene özgü floresan füzyon proteinleri kullanılarak aynı hücre içinde görselleştirilebilir ve birbirinden ayırt edilebilir. ERM-1 adı verilen apikal membranla ilişkili bir molekülü aşırı ifade eden bir solucan, kendine özgü ekzositor kanal fenotipindeki modifikasyonları taramak amacıyla RNAi bakterileriyle beslenmiştir. Baskılayıcılar ve artırıcılar, floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak tanımlanmıştır.Modifiye fenotiplerin birçok hücre altı yönü, konfokal mikroskopi ile daha yüksek büyütmede detaylı olarak incelenebilirdi. Bunlar arasında anormal membranlar, sitoplazmik vakuoller yerine lümenal kistler, hücre içi kanalikül yerleşimleri, anormal kanal ucu morfolojisiyle birlikte kesintili lümen, lümen ile kanal uzama kusurları ve hücre altı bileşenlerin lümene göçü yer alıyordu. ERM-1 ile indüklenen fenotipin baskılayıcılarının ve artırıcılarının etkilerinden birçokları, kist boyutu, kanal uzunluğu ve floresanla işaretlenmiş hücre altı bileşenler gibi niceliksel olarak da belirlenebilirdi.Bu videoyu izledikten sonra, floresan diseksiyon ve konfokal mikroskoplar altında C. elegans boşaltım kanalı fenotiplerini karakterize etmek için standart RNAi ve ERM prosedürlerinin nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknikleri kullanarak, canlı hayvanlarda tek bir hücredeki de novo polarize membran biyogenezini ve tübülogenezi inceleyebilmelisiniz.

the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Bu protokol, tüm embriyonik sonrası gelişim boyunca mikroakışkan tabanlı C. elegans hızlandırılmış görüntülemeyi tanımlar.

Tüm larva aşamalarında yüksek çözünürlüklü C. elegans görüntüleme

Öğrenin C. elegans atık kanalında tek hücreli tübülogenez ve polarize membran biyogenezini in vivo analiz etmek için GFP füzyon etiketleme, RNAi tarama ve konfokal görüntüleme yöntemlerini.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme (Video) | JoVE Journal

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

Daha fazla video keşfet