Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin
1 Eylül 2017
Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.
Bu protokolün genel amacı, standart mikroskopi ekipmanı kullanılarak fare SN'sindeki dopaminerjik hücre sayısının tasarım tabanlı stereolojik tahminini tanımlamaktır. Bu yöntem, tasarım tabanlı tarafsız stereoloji kullanarak klinik öncesi Parkinson hastalığı araştırmaları için fare substantia nigra'daki dopaminerjik nöronların sayısını tahmin etmek için kullanışlıdır. Bu tekniğin ana avantajı, ticari olarak temin edilebilen tam bir stereoloji kurulumuna ihtiyaç duymadan standart mikroskopi ekipmanı ile gerçekleştirilebilmesidir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Louisa Friez olacak. Paraformaldehitle sabitlenmiş bir fare beynini bir beyin matrisine yerleştirerek ve bregmadan artı 0.74 milimetrelik bir kesim yaparak başlayın. SN dahil olmak üzere beynin kaudal kısmını 0.1 molarda% 4 PFA'ya aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin.
Ertesi gün, PFA'yı 0.1 molar PBS'de% 30 sükroz ile değiştirin ve numuneyi kriyo korumak için dört santigrat derecede iki gün daha inkübe edin. Beynin sakaroza batmasından iki gün sonra, dokuyu optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile doldurulmuş bir Cryomold'a yerleştirin ve dokuyu sıvı kuru buzla soğutulmuş izopentan içinde yavaşça dondurun. Koronal düzlemde 30 mikronluk kriyo kesitlerini seri olarak kesmek için bir kriyostat kullanın.
Beyin sapının üst bölgesine küçük bir delik açarak sağ yarım küreyi işaretleyin. Bregma'dan eksi 2,46 milimetre'den başlayan ve bregma'dan 4,04 milimetre'de biten dört dizi bölüm toplayın. Her bir bölüm serisini kriyoprotektan ile doldurulmuş bir tüpe aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Bir mikroskoba bağlı görüntüleme yazılımı kullanarak tirozin hidroksilaz immünohistokimyasal olarak boyanmış SN kesitlerinin dijital görüntülerini yakalayın. Bölüm başına rastgele seçilen üç sayma alanında bölümlerin gerçek montajını ve kalınlığını belirleyerek başlayın. Bölümün üst kısmını tanımlamak için önce üst ofseti görüntüle'ye tıklayın.
Ardından üst görünümü durdur'a tıklayın. Daha sonra, alt ofseti görüntüle'ye tıklayın ve ardından alt görünümü durdur'a tıklayın. Bölümün kalınlığını yazın.
Üst ofsetten üç mikron çıkararak koruma bölgesini hesaplayın ve sonucu üst ofset kutusuna yazın. Ardından, optik disektörün 13 mikron yüksekliğini üst ofset numarasından çıkarın ve sonucu alt ofset kutusuna yazın. Aşağıdaki parametreleri, adım 14, boyut 1.00'ı seçin.
Dosyanın kaydedileceği dizini seçin. Satın almayı başlatmak için sıraya tıklayın. Görüntüler elde edildikten sonra, işlemeye tıklayın ve aşağıdaki parametreleri seçin, dizi, montaj ve %10'luk bir görüntü örtüşmesine sahip hızlı ve birleştirme kutularındaki tüm düzlemlerBaşlat'a tıklayarak görüntüleri birleştirmeye başlayın.
Bu, analiz için yığın görüntüleri oluşturur. Başlamak için, dosyaya tıklayarak resmi açın ve açın. Çözümle ve ölçeği ayarla komutunu kullanarak görüntü ölçeğini ayarlayın.
Bu adımdan itibaren, tanımlanan boyutu pikselden mikrona değiştirin. Eklentileri seçin, ardından ızgarayı seçin, ardından rastgele bir ızgara eklemek için ızgara türü çizgileri komutunu verin. Rastgele ofset kutusunu işaretleyin.
Izgara içindeki bir karenin boyutunu 130 mikron x 130 mikron olarak tanımlayın ve 16.900 mikron kareye eşit olun. Görüntüye tıklayarak görüntü türünü 16 bit'ten RGB rengine değiştirin, ardından RGB rengini yazın. Substantia nigra pars compacta'yı bulun.
11 fırça genişliği kullanarak bölgeyi boya fırçası aracıyla çevreleyin. Analiz et'e tıklayarak ölçek ayarla komutunu geri alın, ardından ölçeği ayarlayın ve ardından mikron yerine piksel cinsinden hesaplamak için ölçeği kaldırmak için tıklayın. Bir ekran görüntüsü alın, görüntü dosyasını kaydedin ve yeni dosyayı ImageJ ile açın.
Fırçayı ve 25 fırça genişliğini seçin. Optik bir disektörün yerleştirilmesi için SN ile temas eden her ızgara karesini işaretleyin. SN'nin bölümlerini içeren bir ızgara karesi seçin. Başlangıç x ve y koordinatlarını tanımlamak için imleç ImageJ'deyken karenin sol üst köşesini ölçün.
Optik disektör konumu başlıklı elektronik tablo şablonunu seçin ve optik disektör konumunu hesaplayın. Ardından, protokolün yazılı bölümünde açıklandığı gibi hücre sayısı elektronik tablosunun hesaplanmasını kullanarak hücre numarasını tahmin edin. Bu düşük güçlü görüntü, dopaminerjik nöronlar için TH boyamadan sonra fare beyninin bir bölümünü göstermektedir.
Daha yüksek büyütme, TH pozitif dopaminerjik nöronları gösterir. İç kısım, kutulu bölgeyi artırılmış büyütmede gösterir. Bu görüntü, rostraldan kaudal'a kadar tüm fare SN'sini kaplayan bir dizi TH lekeli SN kesitini göstermektedir.
Her bölüm ardışık bölümden 120 mikron ile ayrılır. Sağ ve sol fare SN'deki TH pozitif nöronların sayısı, bu videoda gösterilen yöntem kullanılarak ve ticari olarak temin edilebilen bir stereoloji sistemi kullanılarak tahmin edildi. Burada görüldüğü gibi, her iki yöntem de karşılaştırılabilir hücre sayımları ile sonuçlandı ve veri setleri arasında önemli bir fark yoktu.
Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu eldiven gibi kişisel koruyucu ekipmanların giyilmesi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, optik fraksiyon yöntemi ve standart mikroskopi ekipmanı kullanılarak fare substantia nigra'daki dopaminerjik nöron sayısının tarafsız stereolojik tahmininin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, standart mikroskopi araçlarını kullanarak fare substantia nigra'sındaki dopaminerjik nöronal hücre sayılarının tarafsız stereolojik tahminine yönelik bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, özel stereolojik sistemlere ihtiyaç duymadan hücre sayımı için güvenilir bir yaklaşım sağlayarak Parkinson hastalığına yönelik preklinik araştırmaları kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Parkinson Hastalığı Araştırmaları
Arka Plan
- Dopaminerjik nöronlar, motor kontrol için kritiktir.
- Substantia nigra, Parkinson hastalığında etkilenen temel bir bölgedir.
- Tarafsız stereoloji, güçlü bir kantitatif yöntem sunar.
- Standart mikroskopi ekipmanları, tekniği erişilebilir kılar.
Çalışmanın Amacı
- Nöronal kantifikasyon için adım adım bir protokol oluşturmak.
- Canlı fare modellerinde tasarım tabanlı yanlılığı önleyen stereolojiyi kullanmak.
- Dopaminerjik nöron kaybını inceleyen preklinik çalışmalara olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Işık mikroskopisini ve dijital görüntü analiz yazılımını içeren standart mikroskopi.
- Biyolojik model olarak fare substantia nigra'sı.
- Fare beyin dokusunun detaylı fiksasyonu, kriyoproteksiyonu ve kesilmesi.
- Dijital görüntüleme ve spesifik immünohistokimya teknikleri.
- Nöron sayısını belirlemek için yapılan dikkatli ölçümler ve hesaplamalar.
Ana Sonuçlar
- SN'deki dopaminerjik nöronların doğru tahmini gösterilmiştir.
- Hem standart hem de gelişmiş yöntemler karşılaştırılabilir nöron sayımları üretmiştir.
- Standart araçlar kullanılarak yöntem güvenilirliğine verilen önem vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, araştırmalarda nöronal popülasyonların nicelleştirilmesi için uygulanabilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Parkinson hastalığındaki nöronal kaybın anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Kolayca erişilebilen araçlar kullanarak sinirbilim çalışmalarında daha geniş uygulama imkanı sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Substantia nigra'daki dopaminerjik nöron kaybının doğru şekilde miktarlaştırılması, preklinik Parkinson hastalığı araştırmalarında kritik bir uç noktadır ve hedef doğrulama ile nöroprotektif stratejilerin mekanistik risklerinin azaltılması konusunda doğrudan bilgi sağlar. Bu protokol, standart mikroskopi ekipmanları kullanılarak güvenilir ve tarafsız stereolojik tahmin yapılmasına olanak tanıyarak, özel stereoloji sistemlerine olan bağımlılığı azaltır ve keşif biyolojisi iş akışları için erişilebilirliği artırır. Yöntem, kantitatif ve tekrarlanabilir hücre sayım verileri sunarak, erken evre hedef hipotezi testlerinde ve portföy önceliklendirme kararlarında öngörüsel güveni destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Preklinik Parkinson hastalığı modellerinde dopaminerjik nöron sağkalımının tarafsız bir şekilde nicelleştirilmesini sağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına imkan tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşim çalışmalarında gözlemci yanlılığını ve teknik değişkenliği minimize eden tasarım tabanlı stereoloji aracılığıyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: Hedef modülasyon etkinliğinin değerlendirilmesine yardımcı olan ve erken keşif aşamasındaki devam/dur kararlarını bilgilendiren kantitatif nöronal sayım verileri üretir.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Dopaminerjik nöron bütünlüğünü korumayı amaçlayan tarama sonuçlarının doğrulanması için uygun, standartlaştırılmış ve kantitatif histolojik çıktılar üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Kesitler ve hayvanlar arasında tutarlı hücre sayısı ölçümleri sağlayarak, sonraki bileşik değerlendirmeleri için analiz standartlaştırmasını destekler.
- Ölçeklenebilirlik: Standart mikroskopi ve görüntü analiz yazılımlarıyla uyumlu olup, özel donanım gerektirmeden keşif platformları genelinde daha geniş çaplı kullanıma olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Parkinson hastalığının temel patolojik bir özelliği olan substantia nigra'daki dopaminerjik nöron kaybını doğrudan modeller ve translasyonel geçerliliği artırır.
- Preklinik Süreklilik: Ticari stereoloji sistemleriyle karşılaştırılabilir veriler sunarak, keşif taramasından preklinik doğrulamaya kadar nicel bir köprü kurar.
- Riskle Ayarlanmış İlerleme: İstatistiksel olarak sağlam nöronal sağkalım metriklerine dayanarak, bileşiklerin ilerlemesi hakkında objektif ve veri odaklı kararlar alınmasını sağlar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik etkinlik değerlendirmesine kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, mekanistik anlayışı ve hedef güvenini bilgilendiren kantitatif bir histolojik çıktı sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Preklinik modellerde yolak modülasyonunun fonksiyonel bir çıktısı olarak dopaminerjik nöron popülasyonlarını nicelleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin nöronal sağkalım üzerindeki etkilerinin güvenilir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanıyan, tekrarlanabilir ve nicel görüntüleme tabanlı çıktılar üretir.
- Analitikler: Sayısal hücre sayımı verileri ve deneysel gruplar arasında istatistiksel karşılaştırılabilirlik sağlayarak veri odaklı koşul karşılaştırmalarını kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilişkili bir beyin bölgesindeki nöron kaybını ölçerek Parkinson hastalığı patolojisiyle uyum sağlar ve biyobelirteç odaklı preklinik doğrulamayı destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Sermaye yoğun ekipman gerektirmeden birden fazla nörobilim keşif programında uygulanabilecek standartlaştırılmış ve erişilebilir bir stereoloji iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tarafsız, tasarım tabanlı stereolojik nicelendirme yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Yaygın olarak erişilebilen mikroskopi ve görüntüleme analiz araçlarını kullanarak laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Verilerin ticari platformlarla karşılaştırılabilirliğini korurken, özel stereoloji sistemlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Nicel, histolojik olarak doğrulanmış dopaminerjik nöron koruma verilerine dayanarak, preklinik adayların riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Hassas doku hazırlama ve bölge tanımlama işlemleri için histoloji, immünohistokimya ve stereolojik prensipler konusunda uzmanlık gerektirir.
- Sistematik kesit analizi için z-ekseni kontrollü motorize mikroskopi ekipmanına ve görüntü birleştirme (stitching) yazılımına bağımlıdır.
- Saha genelinde tekrarlanabilirliği sağlamak amacıyla boyama protokollerinin, kesit kalınlığının ve sayım kurallarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer beyin bölgelerine veya nöron tiplerine adaptasyon; boyama parametrelerinde, ızgara boyutunda ve optik dissektör boyutlarında düzenlemeler gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında kesit kalitesine olan bağımlılık ile sayım doğruluğunu korumak ve örnekleme yanlılığını önlemek için gereken titiz eğitim süreci yer alır.
Biyofarma SSS
- Bilimsel Değer: Birden fazla kesit ve hayvan üzerinden yapılan tekrarlar, biyolojik ve teknik değişkenliği karşılayarak, gözlemlenen nöron sayılarının örnekleme hatalarından ziyade gerçek deneysel etkileri yansıttığına dair güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Tutarlı örnekleme protokolleri, operatörler arası değişkenliği azaltır ve çok merkezli keşif projeleri için temel teşkil eden laboratuvarlar arası standardizasyonu destekler.
