Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

Bu prosedürün genel amacı, gen iletimi için rekombinant sivrisinek densovirusü kullanarak sivrisinek larvalarının gen fonksiyonlarını analiz etmektir. Bu yöntem, ilişkili hücre dışı ve hücre içi engellerin nasıl aşılacağı gibi viral tabanlı iletim sistemlerindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajları; kolay manipülasyon, yüksek transdüksiyon verimliliği, ekspresyonların uzun süreli ve güçlü kullanımı ve in vivo kalıcı etkiler yaratabilme kapasitesidir.

Bu çalışma, geliştirilen densovirus taşıma sisteminin kullanılarak sivrisinek larvalarında spesifik küçük RNA'ların veya hedef genlerin aşırı ifade edilebileceğini veya susturulabileceğini göstermiştir. Bu tekniğin etkileri, larvaların kolayca transdüksiyonuna olanak tanıdığı için, tanımlanan ekspresyon stratejisinin uygulamalarını sivrisinek biyolojisini araştırmak üzere genişletmektedir. Prosedürü, laboratuvarımızdan doktora adayı Pei-Wen Liu gerçekleştirecektir.

Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı şekilde, öncül miRNA'lar, miRNA süngerleri ve shRNA için tam uzunluktaki cDNA dizilerinin kimyasal sentezini sipariş ederek başlayın. Sipariş edilen DNA'lar ulaştıktan sonra, kurutulmuş DNA'nın tamamının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için DNA bloklarını içeren tüpleri santrifüjleyin. Ardından, mikrolitre başına 10 nanogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için DNA'yı DNase içermeyen suda yeniden süspande edin.

Plazmit iskeletini ve cDNA dizilerini sindirmek için altı mikrolitre XbaI ekleyin ve reaksiyonu 37 °C'de bir saat boyunca bekletin. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak, doğrusal hale getirilmiş plazmit iskeletinin beş-prime uçlarını sığır bağırsak alkali fosfatazı ile defosforile edin. Verimli paketleme için genom boyutu, yaban tipi sivrisinek densovirus genomu uzunluğunun %110'unu temsil eden 4.400 nükleotidi aşmamalı veya Aedes aegypti genomuna 400 nükleotitten fazla olmayan intronik mikroRNA ekspresyonu dahil edilmelidir.

Ardından, alkali fosfatazı 65 °C'de ısıtarak inaktive edin. Daha sonra, DNA'yı %1'lik agaroz jelde yürütün ve lineerize edilmiş omurgayı kesin. Üretici talimatlarını takip ederek, bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı jel diliminden çıkarın.

Ekstraksiyon işleminden sonra, T4 DNA ligaz kullanarak DNA fragmanını omurgaya ligasyonla ekleyin. Ardından, ligasyon reaksiyonu ürünlerini yetkin DH5-alpha E.coli hücrelerine aktarmak için ısı şoku uygulayın. Transforme edilen bakterileri, mililitre başına 100 µg ampicillin içeren bir LB agar plağına ekin.

Ertesi gün, plakadan tek bir koloni seçin ve mililitre başına 100 micrograms ampicillin içeren üç milliliters zenginleştirilmiş besiyeri kullanarak bir başlangıç kültürü oluşturun. Son olarak, üretici talimatlarını izleyerek, bir miniprep kiti yardımıyla bakteriyel kültürden plazmid DNA'yı ekstrakte edin. Doğrulama için DNA örneğini bir DNA dizileme şirketine gönderin.

Yapay intronik küçük-RNA ekspresyon kaseti için gösterilen yöntemleri kullanarak, pre-miRNA veya shRNA'yı pUCA plazmit iskeletindeki AaeDV NS1 kodlama bölgesinin HpaI bölgesine ligalte edin. DH5-alpha hücreleri yerine, DNA'yı Stbl3 kompetan E.coli hücrelerine transforme edin. Ardından, transforme edilmiş hücreleri mililitrede 100 mikrogram ampicillin içeren bir LB agar plakasına ekim yapın ve pozitif bir klondan başlangıç kültürü oluşturun. Bunu takiben, üretici talimatlarını izleyerek bir maxiprep kiti yardımıyla bakteriyel hücrelerden rAaeDV plazmidini ekstrakte edin.

Sıfırıncı günde, %90 ila %95 konfluense ulaşmış C6/36 hücresi içeren flaskları, bir veya ikiye bölerek 10 adet T-25 kültür flaskına aktarın. Flaskları, tekrar %90 ila %95 konfluense ulaşana kadar 28 °C'de 18 ila 20 saat boyunca inkübe edin.

Birinci günde, hücreleri oluşturulan rAaeDV plazmidleri ile transfekte edin. Bunu gerçekleştirmek için 10 µg DNA'yı 600 µL RPMI-1640 ortamında seyreltin ve çözeltiyi nazikçe karıştırın. Bu sırada, her bir transfeksiyon için 600 µL RPMI-1640 ortamı ve 25 µL transfeksiyon reaktifi hazırlayın.

Hücreleri DNA ile oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. Ardından, plazmit DNA karışımına 625 microliters RPMI-1640 transfeksiyona reajen karışımı ekleyin ve bu karışımı oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri RPMI-1640 medyumu ile iki kez yıkayın ve ardından transfeksiyon karışımını her bir T-25 kültür flaskına ekleyin.

Hücreleri transfeksiyon karışımı içerisinde 28 °C'de altı saat inkübe edin. Altı saat sonra, transfeksiyon medyasını uzaklaştırın, hücreleri beş mL RPMI-1640 medyumu ile iki kez yıkayın ve ardından %10 FBS içeren taze RPMI-1640 medyumu ekleyin. Transfeksiyondan beş gün sonra, kaplardaki hücreleri kültür medyumu ile pipetleyerek yerinden ayırmak ve süspansiyona getirmek için beş mL'lik bir cam damlalık kullanın.

Her bir flasktaki hücre süspansiyonlarını kendilerine ait steril 50 mililitrelik tüplere aktarın. Yüksek eşik bağımlı bir virüs hasat etmek için, hücrelerin transfeksiyondan sonra beş gün boyunca muhafaza edilmesi gerekir. Münferit tüpleri negatif 80 derece Celsius'ta veya kuru buz etanol banyosunda 30 dakika boyunca dondurun.

Ardından, bunları 37 °C'de hızlıca çözdürün ve hücre süspansiyonunu bir dakika boyunca vorteksleyin. Sonra, santrifüj edilen örnekten süpernatantı toplayın ve peleti atın. Daha sonra, süpernatantı 0,22 µm'lik tek kullanımlık bir şırınga filtresinden geçirin.

Saflaştırılmış nihai virion stoklarını alikotlayın ve -80 °C'de saklayın. 100 adet birinci instarda A. albopictus larvasını deiyonize su kullanarak üç kez yıkayın. Ardından, larvaları 95 mL deiyonize su içeren bir behere aktarın.

Beş mililitre rAaeDV stok ekleyin ve larvaları 28 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Larva enfeksiyonunun başarısı için, yüksek enfeksiyon oranları sağlamak amacıyla larvaların 24 ila 36 saat boyunca enfeksiyon virüsü partikülleri ile birlikte tutulması esastır. İnkübasyonun ardından, larvaları deiyonize su kullanarak üç kez yıkayın ve ardından larvaları tekrar plakalara aktarın. Larvaları düzenli olarak besleyin. Standart teknikleri kullanarak, kantitatif PCR veya western blot aracılığıyla larvalardaki hedef gen ekspresyon seviyesini izleyin.

Bu örnekte, aşırı ekspresyon gösteren aal-let-7 ekspresyon kasetini içeren rekombinant virüs ile enfekte edildikten sonra, 100 adet birinci instarda larva endojen miRNA ekspresyonu açısından analiz edilmiştir.

Anti-let-7 konstrüktünün etkinliği, knockdown kapasitesini vurgulayacak şekilde sağda gösterilmiştir. rAaeDV vektörlerinin V-ATPase mRNA knockdown etkinliğini izlemek amacıyla, toplam 100 adet birinci dönem larva, farklı tiplerdeki rAaeDV'den eşit miktarlar virüs larvaların habitatındaki su kütlesine eklenerek tedavi edilmiştir. V-ATPase mRNA seviyeleri, miRNA eksprese eden rAaeDV ve intronik shRNA eksprese eden rAaeDV tarafından önemli ölçüde azaltılmıştır.

Sonuçlarımız, hatalı genomlu sivrisinek densovirüslerinin sınırlamalarını aşarak yabancı genlerin sivrisineklere verimli bir şekilde aktarılmasını sağlayan ve yeni bir paradigma sunan intronik ekspresyon stratejisini doğrulamaktadır. Bu prosedürü uygularken, Aedes aegypti densovirüs genomuna en fazla 400 nt uzunluğunda bir intronik microRNA ekspresyon kasetinin yerleştirilebileceği unutulmamalıdır. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, sivrisinek genlerinin fonksiyonel analizlerini incelemek amacıyla microRNA'ları ve hedef genleri aşırı eksprese edebilen veya baskılayabilen, hatalı olmayan rekombinant sivrisinek densovirüslerin üretimi yönündeki araştırmalara yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, sivrisinek larvalarında gen fonksiyonlarını analiz etmek için geliştirilen sivrisinek densovirus iletim sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.