Name: Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi Drosophila Motor Nöron Dejenerasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Keşfedin Drosophila larvalarında segmental sinirlere mekanik hasar indükleyerek nörodejenerasyonu görselleştirme ve nicelendirme yöntemini. Bu uygun maliyetli teknik, nöronal yaralanmanın hücresel mekanizmalarını araştırmak için standart ekipman kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Quinnipiac Üniversitesi&#39;ndeki Keller ve Magie Labs&#39;ın tüm üyelerine yararlı öneriler için teşekkür ederiz. Özellikle, Keller Laboratuarı&#39;nda bu hasar analizinin geliştirilmesi için Barron L. Lincoln II&#39;ye teşekkür etmek isteriz. LC Keller&#39;e ödül verilen Quinnipiac Üniversitesi Sanat ve Bilim Hukuku Yüksek Okuluna teşekkür ederiz.

1. Reaktiflerin ve Ekipmanların Hazırlanması <ol><li> 1x tahlil tamponuna hazırlama (70 mM NaCI, 5 mM KCI, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCOj 3, 115 mM sakaroz, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES, pH 7.2). </li><li> 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) hazırlayın. </li><li> % 0.01 Triton X-100 ile 1x PBS kullanarak 1x PBT hazırlayın. </li><li> Meyve suyu agar plakaları hazırlayın. 14 Kısaca, H2O ve otoklav, 700 ml 30 g agar karıştırılır. 0.5 g metil parabeni 10 mL etanol içinde eritin ve 300 mL meyve suyu konsantresine (üzüm veya elma) solüsyon ekleyin. Konsantre otoklavlanmış agar solüsyonuna karıştırın ve 10 mm x 35 mm Petri kaplarının kapaklarına dökün. NOT: Üzüm agar gücü premix de çeşitli firmalardan satın alınabilir (bkz . Malzemelerin Tabloları ). </li><li> Larvaları mekanik olarak yaralamasına izin verecek boyutta 5 forseps edin. </li><li> Standart Drosophila CO 2 kullanın </sUb&gt; temelli anestezi aleti. </li></ol> 2. Drosophila larvalarının seçilmesi <ol><li> 25 ° C&#39;de kültüre edilmiş dolaşan üçüncü instar larvaları içeren bir şişe veya şurup Drosophila al. </li><li> Görünüşe göre on bireysel 2. ya da 3. instar larva seçin. Üçüncü instar larva, ön dallı spirallerin görünümü ile tanımlanabilirken, ikinci instar larva daha küçüktür ve daha çok club benzeri anterior spiracles içerir. NOT: Larva aşamaları aynı zamanda zamanlama ile de tanımlanabilir. 25 ° C&#39;de ikinci instar larva kuluçkadan yaklaşık 48 saat sonra, üçüncü instar larva molt yaklaşık 24 saat sonra ortaya çıkar. NMJ&#39;de nörodejenerasyon incelemekle ilgileniyorsanız, ikinci instar larvalarının yaralanması gerekir. </li></ol> 3. Drosophila Larvalarının Mekanik Yaralanmalara Hazırlanması <ol><li> Dikkat çekerek, formaps veya bir fırça ile bireysel larvaları dikkatli bir şekilde seçinHer neyse onu sıkıştırmamak. </li><li> Herhangi bir yiyecek artıkını temizlemek ve larva hareketliliğini yavaşlatmak için on adet larvayı soğuk 1X PBS içeren bir cam tabakaya veya diseksiyon tamponuna doğrudan yerleştirin. </li></ol> 4. Drosophila larvalarının mekanik yaralanması ve tedavisi <ol><li> Her bir larva&#39;yı CO 2 anestezi cihazına yerleştirin. </li><li> Diseksiyon mikroskopu altında, cilt kütlesi boyunca segmental sinirleri görselleştirmek için dikkatle her larvayı dorsal yanlarına döndürün. </li><li> Konum büyüklüğü 5, ağız kancalarından başlayarak larva uzunluğunun yaklaşık 1/2 ila 2 / 3&#39;ünü forseps eder. Yerleştirdikten sonra, boyut 5 forseps ile segmental sinirleri içeren ventral kütaniğin yaklaşık 1 / 3&#39;ünü tutun. <ol><li> Larval segmental sinirlerin yaralandığından emin olmak için, segmental sinirleri ezmek için kütikülü sağlam halde bırakacak kadar kuvvet uygulayın. Doğru miktarda kuvvet belirlemek için, 10 larvayı ezin ve5 saat sonra ölüm oranı% 50&#39;nin altındadır. </li></ol></li><li> Hasar gördükten sonra, larvaları yaklaşık 0.5 g maya macunu içeren bir meyve suyu agar plakasına dikkatle aktarın. Her larvayı ön ucunun maya macununa gelecek şekilde yerleştirin, böylece hareketlilik bozulmasına rağmen beslenmeye devam edilir. NOT: larval segmental sinirlerin yaralandığından emin olmak için agar plakasına aktarıldıktan sonra bozulmuş larval motilite gözlemlenebilir. Yaralı larvalar, yaralanma yerine posteriferale felç ederler, ancak yine de ağız kancalarını hareket ettirebilir ve besleyebilirler. Yaralanmadan sonra hayvanların ölüm oranının yüksek olması yaygın olduğundan bir deney için gerekli olanlardan% 20-50 daha fazla hayata zarar vermek en iyisidir. </li><li> Boş bir 100 x 15 mm petri tabağın altına maya yapıştırın ve 10 yaralı larva içeren agar plakaları yerleştirin. Yaralı larvaları içeren bu petri plakasını nemli bir kağıt havlu içeren bir agar plakası üzerine örtün ve kağıt havluun larvalara veya agar plakalarına dokunmamasına dikkat edin. Yerleştir şunu.Petri, oda sıcaklığında daha büyük, hava geçirmez bir kaba koyun. </li><li> Zarar sonrası belirlenen periyotlardan sonra (6, 12 veya 24 saat sonra) diseksiyon için larva alın. NOT: Hasarın aksonal hücre iskeletine olan ani etkilerini incelemek için, larvalar yaralanmadan sonra doğrudan disseke edilebilir. Aksonal transport kusurlarını incelemek için yaralanmadan yaklaşık 6 saat sonra larvalar disseke edilebilir. Yaralanmadan yaklaşık 12 saat sonra, ubikitleşmiş proteinlerin birikmesi gözlemlenebilir ve hasardan 24 saat sonra, NMJ&#39;de motor nöron dejenerasyonu gözlemlenebilir. </li></ol> 5. NMJ&#39;de Nörodejenerasyon Analizi <ol><li> Drosophila larva NMJ&#39;yi daha önce tarif edildiği gibi parçalara ayırın. 15 , 16 Kısaca, pinleri bir Sylgard plakasına yerleştirin, sırt yüzeyi boyunca kesin ve vücut duvarı kas sistemini açığa çıkarmak için bir damla diseksiyon tamponunda pimleri bulunan fileto. Ya da% 4 paraformaldehit (PFA) ya da Bouin&#39;s Solveni antiNöronları ve kasları görselleştirmek için kullanılan cesetler. NOT: Yeşil Floresan Protein (GFP) gibi flüoresan protein etiketleri Bouin&#39;in fiksatif maddesi çok sert olabileceği için görülebilecekse, PFA fiksasyonu kullanılmalıdır. </li><li> Önceden presinaptik motor nöronları ve komşu postsinaptik (SSR) kas kıvrımlarını eşzamanlı olarak işaretlemek için daha önce 11 , 13 , 16 tanımlanmış olan immünofloresansı uygulayın. Presynaptik zarları ve aksonları floresan ile konjuge horseradish peroksidaz (HRP) (1: 300) 17 ile görselleştirin ve aktif bölgeler bir anti Bruchpilot (Brp) antikoru (nc82; 1: 100 Gelişimsel Çalışmalar Hibritoma Bankası) kullanılarak boyanabilir. Sinaptik sonrası kasları anti-Dics Large (Dlg) antikoru (1: 10,000) ile aynı anda etiketleyin. 18 </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi NMJ&#39;de nörodejenerasyonun nicelleştirilmesi için kurulmuş bir test yapın. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Kısaca, hem ön hem de son sinaptik bölmeler için bireysel NMJ&#39;leri aynı anda görselleştirin. Postinaptik belirteçlerle etiketlenmiş ancak presinaptik belirteçlerle etiketlenmemiş herhangi bir buton, nörodejenerasyon alanlarını gösterir ( Şekil 1 ). NMJ başına ortalama bouton sayısı ve hayvan başına ortalama NMJ sayısı nicelenebilir. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilia%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li>
<li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li>
<li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin%2Fankryin%2Fmicrotubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li>
<li>Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.rec065672.short">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19329927">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Daha önce tarif edilen ve burada gösterilen nöronal mekanik yaralanma, Drosophila larvalarının segmental sinirlerinde hasar / stres yaratmak için kullanılabilir. 4 , 5 , 6 , 14 Bu deneysel teknik, yaralanmadan sonra motor nöron hücre cisimciklerinde transkripsiyonel değişikliklerin incelenmesinin yanı sıra nörodejenerasyona yol açan olayların zamansal dizilimini incelemek için daha ön...

Nöronal dejenerasyon normal gelişim sırasında oluşur ve doğal yaşlanma süreci, yaralanma, stres veya hastalık durumlarından kaynaklanabilir. Ortak meyve sineği olan Drosophila melanogaster , nöronların dejenerasyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalardaki olağanüstü benzerliklerden dolayı nörodejenerasyonu incelemek için basit ve güçlü bir model organizması sağlar. Bu benzerlikler, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70&#39;inde bir Drosophila homologunun varlığı ile vurgulanır. 1 Ek olarak, sayısız deneyleri ve insan nörodejeneratif hastalıklar çalışma teknolojik araçlar geliştirilmiştir ve Drosophilia&#39;daki kullanılmıştır. 2, Drosophila içinde 3, nöro-musküler eklem (NMJ) hem hücresel hem de elektrofizyolojik özelliklerin analizi için izin veriyor ve görünür n nöromüsküler hastalığı araştırmak için önemli bir sistem olduğu kanıtlanmıştırEuron-kas bağlantıları. 2 Bu çalışmada, segmental sinirlerin tekrarlanabilir yaralanmasına izin veren Drosophila larvalarında bir in vivo nöron hasar analizini açıkladık. Bu motonöron yaralanması, yaralanmadan 24 saat sonra NMJ&#39;de nörodejenerasyona neden olan hücresel olayların zamansal bir dizilimiyle sonuçlanır. Nörodejenerasyonla sonuçlanan tekrarlanabilir yaralanma motoneuronları yeteneği, dejeneratif işlem için gerekli spesifik genlerin belirlenmesi, nöronal hasara transkripsiyonel cevapların diseksiyonu ve koruyucu sinyalleme çağlayanlarının analizi gibi farklı uygulamalar içerir. 4 , 5 , 6 Bu yöntem aynı zamanda canlı hayvanlarda nöronal dejenerasyon ve yenilenmeyi incelemek için mikroakışkanlarla birlikte kullanılmıştır. 7 Motor nöron dejeneratını incelemek için kurulan niceliksel bir tahlilden yararlanıyoruzIyonu mekanik yaralanma sonrası Drosophila NMJ&#39;de. Bu tahlil, presinaptik zar ve proteinlerin kaybedilmesinin, postsınaptik kas membranı kıvrımlarıyla karakterize edilen subsynaptik retikulumun (SSR) sökülmesinden önce gelmesi üzerine kuruludur. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Bu tahlil, pre-sinaptik nöronun bitişik postsinaptik kas ile olan bağlantısını kaybettiği &quot;sinaptik ayak izlerinin&quot; ölçülmesine izin verir. Dejeneratif sürecin larva gelişimi boyunca ilerici olduğu gösterilmiştir 12 ve değişen sinaps gelişimi veya filizlenmesiyle açıklanamaz. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ReklamMevcut mutasyonlar üzerine mekanik yaralanma kullanmanın avantajı, NMJ&#39;de nörodejenerasyona yol açan hücresel olayların geçici diziliminin parçalanmasına izin vermesidir. 13

<table><tbody><tr><td>Mikro diseksiyon makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11231-30</td><td>Bazı insanlar 3 bedeni tercih ederken, diğerleri 5 bedeni tercih eder</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td>Bazı insanlar 3 bedeni tercih ederken, diğerleri 5 bedeni tercih eder</td></tr><tr><td>CO2 Hava Tankı</td><td>Teknik Hava</td><td>UN 1013</td><td>Çeşitli tank boyutları satın alınabilir</td></tr><tr><td>CO2 Anestezi Cihazı</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik pimler, boyut 0.1</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silikon Elastomer, Baz ve Kürleme Maddesi</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Diseksiyon plakalarını dökmek için</td></tr><tr><td>Bouin'in Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antikorlar, Fosfat</td></tr><tr><td>Tamponlu Salin (PBS) içinde Bouin ve PFA% 4 Paraformaldehit'teki (PFA)</td> etkinlikleri açısından test edilmelidir <td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antikorlar, Bouin ve PFA</td></tr><tr><td>Diseksiyon Stereo Mikroskobunda</td> etkinlikleri açısından test edilmelidir <td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Işık Kaynağı</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 antikoru</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-diskler büyük antikor</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-yaban turpu peroksidaz</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>Alexa Fluor & reg; 488, 594 veya 647</td></tr><tr><td>Flystuff Üzüm Suyu Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Cam Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Hizmet</td><td>Kutusu Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Larva geri kazanımı için nemli oda oluşturmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

Çalışmak İçin basit bir nöronal mekanik yaralanma metodolojisi<em&gt; drosophila</em&gt; motor nöron dejenerasyonu

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Nöronların dejenerasyonu normal gelişim sırasında, yaralanma, stres ve hastalığa yanıt olarak ortaya çıkar. Nöronal dejenerasyonun hücresel özellikleri, insanlarda ve omurgasızlarda bu işlemleri yönlendiren moleküler mekanizmalarda olduğu gibi oldukça benzerdir. Meyve sinek, Drosophila melanogaster , nörodejeneratif hastalıkların hücresel karmaşıklıklarını incelemek için güçlü ama basit bir genetik model organizması sağlar. Nitekim, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70&#39;inde bir Drosophila homologu vardır ve çok sayıda alet ve tahliller, insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için sinekler kullanılarak tarif edilmiştir. Daha spesifik olarak, Drosophila&#39;daki nöromüsküler kavşak (NMJ), nöron ile kas arasındaki yapısal bağlantıları analiz etme kabiliyeti nedeniyle nöromüsküler hastalıkları incelemek için etkili bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Burada, Drosophila&#39;daki bir in vivo motor nöron hasarı tayini üzerinde rapor veriyoruz;NMJ&#39;de 24 saat nörodejenerasyonu uyarılabilir şekilde uyarır. Bu metodolojiyi kullanarak, motor nöron dejenerasyonuna neden olan hücresel olayların geçici bir dizisini açıkladık. Hasar yöntemi, çeşitli uygulamalar içerir ve ayrıca nörodejenerasyon için gerekli spesifik genleri tanımlamak ve nöronal hasara transkripsiyonel cevapları incelemek için kullanılmıştır.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, mekanik nöronal hasarın nörodejeneratif olayların zamana bağlı olarak parçalanmasına izin verdiğini gösterdik. 14 , 18 Olaylar dizisi önceden karakterize edildi ve hasar sonrası 24 saat boyunca, aksonal trafik kusurları, ubikitinasyonlu proteinlerin birikimi ve bunu izleyen nörodejenerasyon, ardından hücre iskeletinin derhal bozulmasıyla başladı. Yaralanmadan önce, WT NMJ&#39;ler presinaptik a...

Burada, Drosophila larva&#39;daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila larvalarında motor nöronlarda mekanik yaralanma indüklemektir. Bu yöntem, nörodejenerasyonla sonuçlanan hücresel olayların zamansal sırası gibi nörodejeneratif araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, düşük maliyetli olması ve çoğu Drosophila laboratuvarında halihazırda bulunan ekipmanları kullanmasıdır.Bu tekniğin etkileri, nörodejenerasyonu tetikleyen moleküler mekanizmaların anlaşılmasına kadar uzanmaktadır. Protokole başlamak için, 25 °C'de kültüre edilmiş, gezen üçüncü instar larvalar içeren bir Drosophila flakonu veya şişesinden 10 adet ikinci veya üçüncü instar larva seçin. Bireysel larvaları, sıkıştırmadan, pens veya bir resim fırçası yardımıyla dikkatlice alın.Yiyecek kalıntılarını temizlemek ve larval motilitesini yavaşlatmak için 10 larvayı doğrudan soğuk 1x PBS içeren bir cam kaba yerleştirin. Üçüncü instar larvaları ön dal spiraküllerinden, ikinci instar larvaları ise daha küçük boyutlarından ve topuz benzeri ön spiraküllerinden ayırt edin. Her bir larvayı bir CO2 anestezi cihazına yerleştirin.Bir dissection mikroskobu altında, kütikül boyunca segmental sinirleri görüntülemek için her bir larvayı dikkatlice dorsal tarafı üzerine yuvarlayın. Yaralanma meydana gelmeden önce, kütikül aracılığıyla segmental sinirleri görselleştirmek için her bir larvanın dikkatle dorsal tarafı üzerine yuvarlanması esastır. Ağız kancalarından başlayarak, 5 numara pensi larva uzunluğunun yaklaşık yarısı ile üçte ikisi arasındaki bir konuma yerleştirin.Konumlandırma yapıldıktan sonra, segmental sinirleri içeren ventral kütikülün yaklaşık üçte birini 5 numara pens ile sıkıştırın. Larval segmental sinirlerin hasar gördüğünden emin olmak için, kütikülü sağlam bırakacak ancak segmental sinirleri ezmeye yetecek miktarda kuvvet uygulayın. Doğru kuvvet miktarını belirlemek için 10 larvayı ezin ve beş saat sonraki ölüm oranının %50'nin altında olduğundan emin olun. Yaralama işleminden sonra, larvaları yaklaşık 0,5 gram maya pastası içeren bir meyve suyu agar plakasına dikkatlice aktarın.Beslenmeye devam etmeleri için her bir larvayı, ön ucu maya macununun üzerine gelecek şekilde yerleştirin. Maya macunu içeren agar plakalarını ve 10 yaralı larvayı, boş bir 100 x 15 milimetrelik Petri kabının tabanına yerleştirin. Kağıt havlunun larvalara veya agar plakalarına temas etmediğinden emin olarak Petri kabını nemli bir kağıt havluyla kapatın.Ardından, Petri kabını oda sıcaklığında hava geçirmez bir kaba yerleştirin. Son olarak, yaralanma sonrası belirtilen sürelerin ardından larvaları diseksiyon için geri alın. Yaralanma öncesinde, vahşi tip nöromüsküler kavşaklar (NMJ'ler), tüm NMJ boyunca presinaptik aktif zon belirteci Brp'yi, postsinaptik belirteç Dlg ile bitişik konumda gösterir.Segmental sinirlerin mekanik olarak zedelenmesi, Dlg ile boyanmış butonların artık presinaptik aktif zon proteini Brp'den yoksun olduğu orta ile şiddetli derecede nörodejenerasyona yol açabilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, nöronal yaralanmaları inceleyen araştırmacıların, Drosophila'da nöromüsküler kavşaktaki nörodejenerasyona yol açan hücresel olayların zamansal dizilimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Drosophila nöromüsküler kavşağı (NMJ), sinapsların morfolojisini ve işlevini incelemek için bir model olarak kullanılır. Bu video, araştırmacıların NMJ'yi karakterize etmek için ölçtüğü önemli özellikleri açıklamaktadır. Örnek protokol, nicelemeyi otomatik olarak gerçekleştirebilen bir yazılımı gösterir.

Drosophila Nöromüsküler Kavşak (NMJ) Miktar Tayini: Sinaptik Morfoloji ve Fonksiyonu Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, bir Drosophila melanogaster larvasındaki aksonların iki fotonlu lazer ablasyonu ve yaralanmayı indüklemek ve yaralanma bölgesini görüntülemek için örnek bir protokol açıklanmaktadır.

İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunu Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Video, mekanik yaralanma yoluyla Drosophila larva segmental sinirlerinde nörodejenerasyonun indüklendiğini göstermektedir. Anestezi uygulanmış larvaların ventral kütikülü, segmental sinirlerin yaralanmasına neden olmak için forseps kullanılarak sıkıştırılır. Yaralı larvalar yiyecekle korunur, bu da yaralanmanın sinirlerdeki motor nöronların dejenerasyonuna neden olmasına ve nöromüsküler kavşaklarının (NMJ'ler) bozulmasına neden olmasına izin verir.

Nörodejenerasyonu İndüklemek için Drosophila larvalarının segmental sinirlerini mekanik olarak yaralamak

Bu video, Drosophila'nın dorsal longitudinal kaslarındaki nöromüsküler kavşakların yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokolü göstermektedir. Prosedür, nöronların ve kasların iki farklı antikorla boyanmasını ve mutant ve vahşi tip sinekler arasındaki floresan modellerinin karşılaştırılmasını içerir. Mutant sineklerde nöronal lekelenmede bir azalma, kas yapısı bozulmadan kalırken nörodejenerasyonu gösterir.

Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

Drosophila larvaları nedeniyle saydam manikür ve güçlü genetik canlı görüntüleme için çekici bir model sistem. Bu protokol 3 instar Drosophila larvaları nöronların içindeki hücresel süreçlerin canlı görüntüleme için 'larva çip' olarak adlandırılan bir tek katmanlı PDMS cihaz, nasıl kullanılacağını açıklar.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Burada, Drosophila melanogaster'de üç basit yaralanmaya bağlı akson dejenerasyonu (akson ölüm) tahlilleri yaparak kopmuş aksonların ve sinapslarının morfolojik ve fonksiyonel korunmasını değerlendirmek için protokoller salıyoruz.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Bu işlemin amacı Drosophila melanogasterkullanarak nörodejeneratif hastalık modellerinde DLM nöromüsküler kavşaklar (NMJs) yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için dorsal uzunlatanal kas (DLM) doku incelemektir.

Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

Nöromüsküler kavşağın mimarisini koruyan ve yetişkin Drosophila bacağındaki motor nöronların ayrıntılı bir immünostokimyasal çalışmasını sağlayan bir diseksiyon tekniğini tarif ediyoruz.

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Keşfedin Drosophila larvalarında segmental sinirlere mekanik hasar indükleyerek nörodejenerasyonu görselleştirme ve nicelendirme yöntemini. Bu uygun maliyetli teknik, nöronal yaralanmanın hücresel mekanizmalarını araştırmak için standart ekipman kullanır.

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi

Daha fazla video keşfet