Name: Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, dokulardaki antijen-spesifik CD8 T hücrelerinin yerini, bolluğunu ve fenotipini belirlemek için in situ MHC-tetramer boyama yöntemini. Bu teknik bağışıklık araştırmalarında hızlı analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser tarafından desteklenmiştir halk sağlığı hizmeti verir Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. gün 1: taze doku kesit ve birincil kuluçka <ol><li>kullanımı bir neşter taze doku küçük (yaklaşık 0.5 cm geniş x 0.5 cm boyunda) parçalar halinde kesilmiş. Ayrı ayrı her dokusu bir dalgıç ile tutkal ve PBS içinde 3-5 mL ile % 4 düşük-melt özel katıştırabilirsiniz. Pistonu bir etiket kullanarak doku bilgileri ile etiketleyin. Nedense odamızda buz kovası içinde soğutulmuş bir sahibi katılaşmaya koymak.</li>
	<li>Microtome ve 200 µm. yükleme jilet microtome ve INSERT pistonu bölümlerine kalınlığı monte microtome banyoda dokusuyla kümesi açın.</li>
	<li>Fosfat tamponlu tuz heparin (PBS-H) ile 100 µg/mL veya 18.7 U/mL heparin PBS RNA korumak için ve potansiyel ISH uygulamalar aşağı izin vermek için ekleyerek hazırlayın. Katıştırılmış dokuyla soğutulmuş, steril PBS-h 100-120 mL kapsayan microtome banyo doldurmak 0 - sıcaklıkta korumak için Bath'a PBS-H buz küpleri ekleyin 2 ° C. Başlat microtome ve kesim 200 µm bölümleri dokusuna. 
	Not: Dokularda hücresel hareketlilik en aza indirmek buzda soğutulmuş doku tutmak önemlidir ve o soğutulmuş taze doku bölümüne daha kolay olduğu için. PBS yalnız-ebilmek var olmak kullanılmış Eğer aşağı akım ISH için bir planımız.</li>
	<li>İyi bir microtome ile (Örneğin, bağırsak ve akciğer), kesmeyin dokuları kullanmak için bir bistüri veya jilet doku ince şeritler halinde kesmek için alternatif olarak, 200 µm mümkün olduğunca yakın.</li>
	<li>Deneysel örnek bilgiler ile 24-iyi doku kültürü plakalar kapak etiketi ve karşılık gelen wells için yapılan doku chambers yerleştirin. Bölümleri bir doku odasına aktarmak için bir fırça set 1 mL içeren bir 24-iyi doku kültürü kalıbının kuyuya kullanım soğutulmuş PBS-H. 
	Not: Yeniden kullanılabilir doku chambers boyama başlatmadan önce yapılmalıdır. Doku Odalar bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt ek-Kapiler tüp kullanılarak yapılabilir ve Kafes Tel. Bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt ek-Kapiler tüp alt kesmeye keskin jilet kullanın. Tel örgü tüpün dibinde delik uyacak bir daire kes. Isı kadar kızgın Bunsen burner kullanarak tel kafes daire. Tel kafes daire çok hızlı bir şekilde aşağı ayarlamak ve tüp mesh itin. Tel örgü güvenli bir şekilde tüp altına yapıştırılmış ve tüp keskin jilet kullanarak 3 mL işareti üst kapalı dikkatle kesin emin olun. İlâ 3 doku bölümleri her doku odasına veya en çok 1 cm 2 doku iyi başına koy. Wells Çapraz bulaşma kaçınmak için farklı antikor kombinasyonları ile arasında en az bir boş şey devam.</li>
	<li>Devam et için birincil tetramer ve hemen tüm kesme bölümleri transfer doku odaları içine bitirdikten sonra boyama antikor. Sular altında ve her zaman PBS-H 1 mL soğutulmuş bölümlerine devam.</li>
	<li>Kuluçkaya doku bölümlerle gecede 0,5 µg/mL FITC Birleşik, peptid yüklü MHC-ben tetramers PBS-H %2 normal keçi serum (NGS) ile seyreltilmiş. Fare veya hücre dışı epitopları bu kuluçka ilgi yönelik diğer tavşan olmayan antikorlar içerir (Örneğin, fare anti-CD8 antikorlar PBS-h %1:500 2 ile seyreltilmiş NGS). Her kuyuya 1 mL sulandırılmış antikorları yerleştirin. 
	Not: CD8 antikorlar, bazı artırabilir ve bazı T hücre reseptörü 4 , 21 ' e bağlama MHC tetramers engellediğini seçerken özen gösterilmelidir. Burada açıklanan fare Anti-insan CD8 antikor kararsız ve bazen biraz zayıf boyama sonuçlanmaktadır. O burada çünkü bu tek sigara-tavşan ve fare CD8 antikor test o lekeli rhesus makak CD8 T hücreleri Üç Kişilik etiketleme için kullanılır.</li>
	<li>1 mL çözeltisi iyi birincil antikor ve sonraki tüm incubations için kullanın ve bu ve tüm izleyen incubations sallanan bir platformda plakalı 4 ° C'de gerçekleştirmek. 
	Not: Doku serbestçe odasında float.</li>
</ol> 2. 2. gün: Fiksasyon ve ikincil kuluçka <ol><li>birincil kuluçka sonra soğutulmuş PBS-H 20 min için 1 mL ile iki kez bölümlerini her yıkama yıkamak. Bunu karşılık gelen Wells soğutulmuş PBS-h 1 mL içeren bir farklı 24-iyi doku kültürü plakasına doku chambers aktararak. 
	Not: içindekiler--dan bir deneysel örneği diğerinin içine doku odaları arasında taşırken damla değil dikkatli olun. Benzer şekilde tüm sonraki incubations ve yıkama için doku odası uygun bir çözüm içeren temiz bir tabağa aktarın. Doku chambers bölümlerde bölümleri doku chambers taraf için sıkışmış değil emin olmak için yordamı sırasında izlemek emin olun. Eğer çözüm içine onlar geri onları itmek.</li>
	<li>1 mL taze PBS tamponlanmış %4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 2 h ile bölümleri düzeltmek (aşırı düzeltmek değil). Soğuk PBS-H iki kez 5 dakika süreyle ile yıkama 
	Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. 
	Not: Eğer hücre içi epitopları algılamak için antijen alma ve permeabilization tabi, antijenleri paraformaldehyde fiksasyon sonra 0.01 mol üre bölümlerde kaynatılarak alınabilir.</li>
	<li>Bölümleri 0,01 mol üre içeren 24-şey kültür kalıplara aktarmak ve bu plakaları bir mikrodalga fırında yerleştirin. Üç kez için yaklaşık 10 bölümleri kaynatın s 30 olmak üzere toplam her s. 
	Not: çok dikkat et, kaynar olarak çözüm bölümleri dışında kuyuları zorlayabilirsiniz. Bu durumda, bölümleri doku odasının tarafında veya kapak plaka uygun doku odası altına geri itmek için bir fırça kullanın.</li>
	<li>Önceden ikincil antikor kuluçka için permeabilize ve doku bölümleri PBS-H, % 0.3 deterjan (PBS-H-T) ve % 2 içeren engelleme çözümde kuluçka tarafından blok NGS bir rocker 4 ° C. gerçekleştir sonraki antikor incubations ile 1 h için üzerinde PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>İkincil kuluçka için tavşan anti-FITC seyreltilmiş antikor 1:10,000 PBS-H-T/2% NGS içeren wells doku chambers bölümlerde aktarmak. Gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Yerine counterstaining kullanarak fare anti CD20 antikor 1: 200 PBS-H-T/2% NGS içinde seyreltilmiş. Bu seçenek için gerekirse epitopları almak, hücreleri nüfuz ve yukarıda açıklandığı gibi bu kuluçka önce engellemek.</li>
</ol> 3. 3. gün: Üçüncül kuluçka <ol><li>sonra ikinci kuluçka, balıklarda üç kez PBS-H en az 20 dakika süreyle 4 ° C'de yıkama</li>
	<li>İle ilgili son bir kuluçka fluorescently antikorlar (Örneğin, keçiyi Anti-tavşan yeşilimsi sarı, keçi Anti-sıçan konjuge kadar kırmızı boya ve keçi Anti-fare konjuge yeşil boya antikorlar seyreltilmiş 1:5, 000, Birleşik etiketli gerçekleştirmek 1:5, 000, 000 ve 1:2, sırasıyla, PBS-H-T/2% NGS içinde). Gecede kuluçkaya. 
	Not: Bu noktada, kuluçka üç gün boyunca gerekirse genişletilebilir. Tabakları kalay folyo içinde bu incu sırasında sarma tarafından ışıktan korunan bölümleri tutmakbation adım ve bundan sonra ışık fluorophores quenches gibi.</li>
</ol> 4. 4. gün: bölümleri montaj <ol><li>yıkama bölümler üç kez PBS-H içinde en az 20 dk. 
	Not: Eğer aşağı akım ISH 19 için planlama, 1 h için %4 paraformaldehyde bölümlerde tetramers ve antikorlar yerde güvenli ve sonra yıkayın PBS-H 5 min için iki kez bölümlerle düzeltmek için. 
	Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.</li>
	<li>Bölümleri mikroskop slayda aktarmak için bir fırça kullanın. Çok fazla doku poke değil dikkatli olun. Her bölümün gliserol/jelatin içeren 4 mg/mL n-propil gallat veya bir fluorophore koruyucu içeren başka bir montaj orta kat. Kapak ile coverslip.</li>
	<li>-20, bir ışık korumalı slayt kapsayıcısında slaytları depolamak ° C. doku kültürü plakaları durulama ve kapakları alkol kullanarak etiketlerinizi kaldırın. 
	Not: Tabakları kullanılabilmesinden.</li>
</ol> 5. Confocal mikroskop görüntüleri edinimi <ol><li>confocal mikroskop her fluorophore ( şekil 1A ve B) için uygun lazerler ve filtreleri kullanarak, yakalama yüksek çözünürlüklü görüntülerle. 
	Not: Bu örnekte, confocal mikroskop (Tablo reçetesi görmek) kullanıldı. Görüntüleri yeşilimsi sarı etiketli antijen spesifik T hücreleri, % 10 güç 488-nm lazer yeşil etiketli CD20 ifade etme B hücreleri için ve % 15 güç 640-nm lazer kadar kırmızı etiketli CD8 T hücreler için % 20 güç 561 nm lazer kullanılarak toplanmıştır. 20 X objektif ve sayısal bir diyafram 0,8 kullanıldı.</li>
	<li>Sırayla birden fazla 800 x 800 piksel alanlarda üç kanal z-serisi 3 µm (veya diğer) aralıklarla toplamak. Bir montaj toplanan alanlarının oluşturmak ( şekil 1 c -E). Karşılık gelen slayt bilgilerini temel alarak her montaj görüntü adı ve çözümlemeyi kaydetmek.</li>
	<li>İlgili confocal mikroskop analizi ve miktar yazılım veya ImageJ kullanarak sayısal görüntü analizi gerçekleştirmek.</li>
</ol> 6. Sayısal görüntü analizi Not: sayısal görüntü analizi confocal mikroskop analizi ve miktar yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir veya ImageJ yazılım kullanarak. Burada, ImageJ örnek olarak kullanılmıştır.
<ol><li>Açık bir confocal montaj ( şekil 2A) ImageJ penceresine sürükleyerek. 
	Not: ImageJ birçok farklı confocal mikroskoplar tarafından toplanan montages doğrudan açabilirsiniz. Montaj ImageJ tarafından doğrudan açılamaz Eğer z-tarama onu açmak için TIFF dosyaları olarak dışa aktarmak</li>
	<li>Seçilen z tarama analizi için yinelenen (&#34; görüntü &#34;-&#62; &#34; yinelenen &#34;) ( şekil 2B).</li>
	<li>Farklı Kanallar split (&#34; görüntü &#34;-&#62; &#34; renk &#34;-&#62; &#34; Split kanalları &#34;) ( şekil 2C).</li>
	<li>Objektif ve basarak ROI yöneticisi eklemek için karşılık gelen kanal YG nicel analiz çizmek &#34; T &#34; üstünde belgili tanımlık klavye. Tedbir alan. 
	Not: ImageJ yatırım Getirisi Müdürü alan gösterir µm 2 ' ( şekil 2B).</li>
	<li>Floresan parlaklık ve kontrast çözümlenmesi için kanal (&#34; görüntü &#34;-&#62; &#34; ayarla &#34;-&#62; &#34; Parlaklık/Kontrast &#34;) ( şekil 2E).</li>
	<li>Yatırım Getirisi Görüntüye Düzleştir (&#34; ROI Yöneticisi &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( şekil 2F).</li>
	<li>Görüntü kullanarak pozitif hücrelerinin ölçmek &#34; çok noktalı &#34; aracı ( Şekil 2 g).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

IHC ile kombine IST tespit, karakterize ve antijen spesifik CD8 T hücreleri diğer hücre ve doku yapıları bağlamı ile doğal ortamlarda miktarının için gerekli bir araç sağlar. Burada, biz fenotip antijen spesifik CD8 T hücrelerinin rhesus makak lenf düğümleri, bereket ve konumunu belirlemek için nicel görüntü analizi tarafından takip IHC ile birlikte IST için ayrıntılı yordamlar nitelendirdi. Benzer boyama uygulanan insan, fare veya diğer türler doku hangi MHC için olabilir-ben tetramers mevcuttur. Buna ek olarak, peptid ...

T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Geliştirme peptit/MHC sınıf ı antijen spesifik boyama CD8 T hücreleri1 ve MHC sınıf II tetramer CD4 T hücre2 / Akış Sitometresi tarafından boyama daha yeni geliştirme çalışması ve anlamak yeteneğimizi devrim tetramer immunobiology T hücrelerinin. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi diğer hücreleri ve yapıları dokularda ve geçerli antijen spesifik T hücrelerinin kayma yerelleştirme tespiti için izin vermez T hücreleri ayıklamak için yükünün teknikleri etkinliği olmayan lenfoid doku3Akış Sitometresi için sınırlı.
Biz ve diğerleri peptid yüklü MHC sınıf ı ve sınıf II tetramer veya multimer reaktifler antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücreleri doku4,5,6,7, leke yöntemleri kullanarak geliştirdik 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. bu IST yöntemleri konumunu, bereket ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında belirlenmesi için izin ve diğer hücre ve dokularda yapıları göreli bu hücrelerinin tespit etmek için bir yol sağlar. Bizim grup yoğun MHC kullanılan-ben insan immün yetmezlik virüsü (HIV) - ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) - çalışmaya boyama tetramer lenfoid, genital ve rektal dokularda HIV ve SIV immunopathogenesis anlamak için belirli CD8 T hücreleri ve başarılı stratejileri14,15,16,17ilişkilendirir tanımlamak için. Buna ek olarak, aynı zamanda IST in situ hibridizasyon (ISH yerelleştirilmesine ve virüs özgü CD8 T hücreleri ve hücre bulaştırmak virüs ölçmek için) ile birleştirir bir teknik dokularda ve in vivo efektör hedef düzeylerini belirlemek için geliştirdiğimiz 18 , 19.
Burada, MHC peptid yüklü bir iletişim kuralı'nı tarif-ben tetramers antijen spesifik CD8 T hücreleri, taze doku bölümlerde için counterstain doku IHC kullanarak leke ve belirli doku bölmeleri içinde belirli fenotipleri hücrelerle ölçmek için. Bu bizim son yayında Li hangi biz konumunu, bereket ve fenotip lenfoid doku SIV özgü T hücrelerinin makak20kronik SIV enfeksiyon sırasında tespit ve ark.tarafından kullanılan aynı yordamlardır.
Bu yordam için taze doku kesitli ve gecede peptid yüklü MHC ile inkübe-ben tetramers Birleşik floresein thiocyanate molekülleri (FITC). O zaman paraformaldehyde içinde sabitlenir. Doku düzelttikten sonra MHC tetramers sinyalini tavşan anti-FITC antikorları kullanarak ve daha fazla ilişkili tetramers sinyali yükseltmek fluorescently tagged Anti-tavşan IgG antikorlar ile inkübe güçlendirilmiş. IHC IST ile birlikte antijen spesifik T hücreleri ve çevreleyen hücreleri tanımlamak için kullanılır. Hücre veya hücre dışı alanda yüzeyinde epitopları tanımak antikorlar tetramers ile birincil kuluçka eklenir. Hücre içi epitopları tanımak antikor boyama önce hücre duvarı Permeasyon gerektirir. Lekeli doku bölümleri confocal bir mikroskop kullanarak yansıma ve confocal yazılım kullanılarak analiz. Etiketli hücreleri ImageJ veya confocal mikroskobu yazılım sayılabilir. Açıklanan protokol için hangi MHC antijen spesifik CD8 T hücre herhangi bir doku aslında herhangi bir leke için kullanılabilir-ben tetramers mevcuttur.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer çekirdek tesisi</td><td></td><td>MHC-tetramer hazırlığı için malzemeler</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>MHC-tetramer hazırlanması için malzemeler</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime agaroz</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>JTBaker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propil gallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>sıçan-ah-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antikor kararsız, tek kullanımlık donmuş alikot kullanın</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>keçi-a-sıçan-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>keçi-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Sıkıştırma: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Ayarlı Anında Yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu düz tabanlı doku kültürü plakaları</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td># 1321</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı ve bıçak</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Tüy Tek Kullanımlık Neşter</td><td>TÜY GÜVENLİK USTURA CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak boya fırçası #2</td><td>PRINCETON ART & FIRÇA LTD. ŞTİ.</td><td>4350R</td><td>, jilet</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr> ile gerektiği gibi kırpabilir</tbody></table>

situ mhc-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik cd8 t hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Akış Sitometresi tarafından analiz antijen spesifik T hücrelerinin MHC-tetramer boyama geliştirme çalışma ve T hücrelerinin immunobiology anlamak yeteneğimizi devrim yarattı. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi antijen spesifik T hücreler diğer hücrelere ve dokulara ve geçerli yükünün teknikleri yapıları kayma lokalizasyonu belirleyemiyor T ayıklamak için hücreleri için Akış Sitometresi etkinliği olmayan lenfoid dokulara sınırlı. Situ MHC-tetramer (IST) Boyama belirli antijenleri dokularda ilgi için T hücreleri görselleştirmek için bir tekniktir. İmmünhistokimya (IHC) ile birlikte, bereket, konumu ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında IST belirleyebilirsiniz. Burada, leke ve antijen spesifik CD8 T hücreleri, belirli doku bölmeleri içinde yer alan belirli fenotipleri ile numaralandırmak için bir protokol açıklayın. Bu işlemleri başlıklı Li vdtarafından bizim son yayında kullanılan aynıdır "köklerinin kısmen CD8 tarafından bastırılmış hücrelerde Simian immün yetmezlik virüsü üreten hücreleri+ In Vivo." Çünkü onlar, fenotip, yerelleştirmek için kullanılan ve aslında herhangi bir antijen spesifik CD8 T hücre MHC tetramers herhangi bir doku elde edilebilir ölçmek açıklanan yöntemleri genel olarak geçerlidir.

Şekil 1 confocal görüntüleri confocal mikroskop kullanarak toplamak nasıl gösterir. Şekil 2 sayısal görüntü analizi ImageJ kullanarak gösterir. Şekil 3 ve 4 temsilcisi bir SIV dokulardan lenf nodu görüntülerini MHC tetramers, CD8 antikorlar ve CD20 antikorları ile lekeli rhesus makak enfekte göstermek ve MHC-tetramer boyama özgüllüğü göstermek için hizmet. Şekil 3 ka...

Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen dokulardaki antijene özgü CD8 pozitif T hücrelerinin konumunu, bolluğunu ve fenotipini belirlemektir. Bu yöntem, neredeyse her antijene özgü CD8 T hücresinin ve her türlü dokunun konumlandırılması, miktarının belirlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir araç sağlayarak CD8 T hücreleri hakkındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, antijene özgü CD8 pozitif T hücrelerinin, ilgilenilen dokulardaki diğer hücrelere ve yapılara göre uzamsal dağılımının belirlenmesine olanak tanımasıdır.Prosedürü Shengbin Li ile birlikte Gwantwa Mwakalundwa gösterecektir. Prosedürün birinci gününde, taze dokuyu yaklaşık 0,5 x 0,5 santimetrelik parçalara bölmek için bir bistüri kullanın. Burada, rhesus makak dalağı dokusu gösterilmektedir.Her bir doku fragmanını ayrı ayrı bir pistonun üst kısmının ortasına yapıştırın ve örnekleri, PBS içindeki 3 ila 5 mL ılık %4 düşük erime noktalı agaroz içine gömün. Pistonları ilgili doku bilgileriyle etiketleyin. Ardından, örnekleri bir buz kovası içindeki soğutulmuş tutucuya yerleştirin.Agar katılaştığında mikrotomu açın ve kalınlık ayarını 200 micrometers olarak belirleyin. Yeni bir jilet ta

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma...

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Burada, AIDS virüsü karşısında Rhesus macaque CD8 + T hücreleri, numaralandırma ve karakterize etmek için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu makale, HIV immünoloji alanında değil, aynı zamanda CD8 + T hücre yanıtları hastalık sonucunu etkileyebilecek bilinen biyomedikal araştırmanın diğer bölgelerine sadece yararlıdır.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi + Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.

Tek zincir MHC Co-agonism insan CD8 + T hücre aktivasyonu içinde araştırmak için teknoloji kullanımı

Bu makalede, manuel tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) multipleks immünofloresan (mIF) protokolü ile birlikte görüntü analizi ve uzamsal analiz anlatılmaktadır. Bu protokol, laboratuvarda bulunan slayt tarayıcısına bağlı olarak slayt başına iki ila altı antijenin boyanması için formalin sabit parafin gömülü (FFPE) bölümlerle birlikte kullanılabilir.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Bu protokol, formalin sabit parafine gömülü doku kesitlerinde protein görüntüleme kütle sitometrisi ile multipleks mRNA tespiti için bir metodolojiyi detaylandırır.

Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

Öğrenin, dokulardaki antijen-spesifik CD8 T hücrelerinin yerini, bolluğunu ve fenotipini belirlemek için in situ MHC-tetramer boyama yöntemini. Bu teknik bağışıklık araştırmalarında hızlı analiz sağlar.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz (Video) | JoVE Journal

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Daha fazla video keşfet