Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen dokulardaki antijene özgü CD8 pozitif T hücrelerinin yerini, bolluğunu ve fenotipini belirlemektir. Bu yöntem, hemen hemen her antijene özgü CD8 T hücresini ve herhangi bir dokuyu bulmak, ölçmek ve fenotiplemek için bir araç sağlayarak CD8 T hücreleri hakkında hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, antijene özgü CD8 pozitif T hücrelerinin, ilgilenilen dokular içindeki diğer hücrelere ve yapılara göre uzamsal dağılımının belirlenmesine izin vermesidir.

Shengbin Li ile prosedürü göstermek Gwantwa Mwakalundwa olacak. İşlemin ilk gününde, taze dokuyu yaklaşık 0,5 x 0,5 santimetrelik parçalar halinde kesmek için bir neşter kullanın. Burada rhesus makak dalak dokusu gösterilmektedir.

Her bir doku parçasını bir pistonun üst kısmının ortasına ayrı ayrı yapıştırın ve numuneleri PBS'de üç ila beş mililitre ılık% 4 düşük erime noktalı agaroz içine gömün. Pistonları ilgili doku bilgileriyle etiketleyin. Ardından, numuneleri bir buz kovasındaki soğutulmuş bir tutucuya yerleştirin.

Agar katılaştığında mikrotomu açın ve kalınlık ayarını 200 mikrometreye ayarlayın. Yeni bir tıraş bıçağı taktıktan sonra, pistonları mikrotom banyosuna yerleştirin. Mikrotom banyosunu 100 ila 200 mililitre taze hazırlanmış PBS-H ile doldurun ve sıcaklığı sıfır ila iki santigrat derece arasında tutmak için PBS-H buz küpleri ekleyin.

200 mikrometrelik kesitler elde ettikten sonra, her bölümü çevreleyen agarı çıkarmak için bir boya fırçası kullanın ve numuneleri, bir mililitre soğutulmuş PBS-H içeren 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının ayrı oyukları içindeki ayrı doku odalarına aktarın. Tüm numuneler elde edildiğinde, doku bölümlerini gece boyunca bir mililitre uygun konjuge peptit yüklü MHC sınıf bir tetramerde inkübe edin, PBS-H içinde seyreltilmiş% 2 normal keçi serumu ile desteklenmiş% 2 normal keçi serumu ile sallanarak. Ertesi sabah, her bir doku odasını, 20 dakika boyunca bir mililitre taze soğutulmuş PBS-H içeren yeni bir 24 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.

İkinci yıkamadan sonra, bölümleri oda sıcaklığında iki saat boyunca bir mililitre taze% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Ardından soğuk PBS-H'de beş dakikalık iki yıkama. Bölümleri 0.01 molar üre içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve üre kaynayana kadar bölümleri her seferinde yaklaşık 10 saniye boyunca üç kez mikrodalgada pişirin.

Numuneleri geçirgen hale getirmek ve bloke etmek için, bölümleri% 0.3 triton x100 deterjan ve% 2 normal keçi serumu ile desteklenmiş PBS-H içeren bloke etme çözeltisinde bir külbütör üzerinde dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, doku odalarını, tavşan anti-fitc antikoru, fare anti-insan CD antikoru ve sıçan antihuman CD3 antikoru içeren bir mililitre çözelti içeren yeni bir 24 oyuklu plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede sallayarak inkübe edin.

Üçüncü günde, bölümleri yıkama başına en az 20 dakika boyunca dört santigrat derecede taze PBS-H'de üç kez yıkayın ve ışıktan korunarak üç güne kadar uygun floresan konjuge ikincil antikorlarla son bir inkübasyon gerçekleştirin. Üçüncül antikor inkübasyonunun sonunda, numuneleri taze PBS-H'de 20 dakikalık üç yıkama ile durulayın ve numuneleri her bir doku odasından bir cam mikroskop lamına aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Her bölümü bir florofor koruyucu ile desteklenmiş montaj ortamı ile kaplayın ve numuneleri bir kapak astarı ile örtün.

Ardından, slaytları 20 santigrat derecede ışık korumalı bir slayt kabında saklayın. Görüntüleme gününde, ilk slaytı konfokal mikroskop tablasına yerleştirin ve doku örneğini etiketlemek için kullanılan her florofor için uygun lazerleri ve filtreleri seçin. 20x objektifi kullanarak, florofor kanallarının her birinde üç mikron aralıklarla, birden fazla 800 x 800 piksel alanında sırayla bir z serisi elde edin.

Ardından, toplanan alanların bir montajını oluşturun ve her montaj görüntüsünü karşılık gelen doku örneğine dayalı bir adla kaydedin. Bu temsili görüntülerde, bir SIV peptit ile yüklenmiş MHC sınıf bir tetramerleri ile boyanmış bir kesit, aynı dokudan, alakasız bir peptit ile yüklenmiş MHC sınıf bir tetramerleri ile boyanmış bir kesit ile karşılaştırılır ve tetramer boyamanın özgüllüğünü gösterir. Bu görüntülerde, SIV peptidi ile yüklü MHC sınıf bir tetramer ile boyanan virüse özgü T hücreleri, bir T hücresi alt kümesi belirteci olan CD8 için birlikte boyanır, ancak B hücreleri üzerinde eksprese edilen bir hücre yüzey proteini olan CD20 için değil.

Bu montaj, lenf nodu üzerinde spesifik fenotiplere ve farklı anatomik bölmelere sahip tetramer lekeli hücrelerin nicelleştirilmesi için kullanılan çoklu konfokal z serisi alanları için oluşturulmuştur. Bu büyütülmüş görüntü, IGM boyama ile tanımlanan bir B hücre folikülü içeren montaj lenf nodunun bir alanını vurgular. Bazıları T hücresi aktivasyonu ve proliferasyon markörünü birlikte eksprese eden MHC birinci sınıf tetramer boyalı hücreler, KI67, B hücre folikülünün içinde ve dışında tespit edilebilir.

Bu boyama kombinasyonu, SIV spesifik CD8 pozitif T hücrelerinin aktivasyon ve proliferasyon durumlarının yanı sıra ikincil lenfoid dokular içindeki lokalizasyonlarının belirlenmesine izin verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa yaklaşık beş gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, başarılı bir boyama için taze dokunun kritik olduğunu hatırlamak önemlidir.

Numuneleri hasattan sonra 24 saat veya daha kısa bir süre içinde işleyin ve fiksasyona kadar soğuk tutun. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen dokularda antijene özgü CD8 pozitif T hücrelerinin yerini, bolluğunu ve fenotipini belirlemek için bir tetramer boyamanın ve immünohistokimyanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Enfeksiyöz ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanların giyilmesi ve kesici aletlerin kullanımının sınırlandırılması gibi maruziyeti önlemek için önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.