Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Bu protokolün genel amacı, özellikle saha örneklerinden trofik ekoloji araştırmalarını iyileştirmektir. Bu yöntem, istilacı türlerin trofik etkileşimler üzerindeki etkisi gibi besin ağı ekolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ana avantajı, aynı numuneler için trofik analizleri entegre etmek için daha fazla zaman ayırmak için ek uygulama ve hemen hemen her ekolojist tarafından uygulanabilir olmasıdır.

Bu yaklaşımı, suda yaşayan tüketicilerin av tüketimi hakkında bilgi vermek için oluşturmuş olsak da, örneğin bentik makroomurgasız örneklerinde tür bileşimini belirlemek gibi başka amaçlar için de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Christian Sodemann olacaktır. Bu deneye başlamak için, daha önce diseke edilmiş yırtıcı gastrointestinal sistemi, 440 mikrolitre tuz ekstraksiyon tamponu içeren iki mililitrelik güvenli kilitli bir reaksiyon tüpüne aktarın.

DNA ekstraksiyonuna kadar numuneleri hemen eksi 20 santigrat derecede dondurun. Numuneleri dondurucudan çıkardıktan sonra, her numune tüpüne beş mililitrelik bir paslanmaz çelik boncuk eklemek için forseps kullanarak DNA ekstraksiyonuna başlayın ve ardından numuneleri çözülmesi için oda sıcaklığında tezgahta bırakın. Bir boncuk değirmeni kullanarak, numuneleri 15 hertz'de bir dakika boyunca homojenize edin.

Numuneleri kısa bir süre döndürdükten sonra, numunelere 90 mikrolitre% 10 SDS ve mililitre proteinaz K başına beş mikrolitre 10 miligram ekleyin. Ardından, numuneleri iyice girdaplayın ve bir ThermoMixer üzerinde bir saat boyunca 400 rpm'de sürekli çalkalayarak 60 santigrat derecede inkübe edin. Lizizi daha da teşvik etmek için, bu inkübasyon sırasında numuneleri her 10 dakikada bir girdaplayın.

Kısa bir santrifüj dönüşünden sonra, numunelere 350 mikrolitre beş molar sodyum klorür pipetleyin. Örnekleri tamamen karıştırmak için 30 saniye ila bir dakika arasında girdap. Daha sonra, 40 dakika boyunca beş santigrat derecede 16.200 kez g santrifüjleyin.

Bu nedenle, numuneleri santrifüjden çıkarırken en kritik şeylerden biri, boncukların hareket etmesini ve adımla çıkarılması gereken tüm parçacıkları içeren peleti rahatsız etmesini önlemektir. Ardından, yaklaşık 600 mikrolitre süpernatanı dikkatlice 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. 600 mikrolitre buz gibi soğuk izopropanol ekleyin ve tüpü birkaç kez dikkatlice ters çevirin.

Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın. Numuneleri dondurucudan çıkardıktan sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 16, 200 kez g sıcaklıkta santrifüjleyin. Peleti kaybetmemeye dikkat ederken süpernatanı atın ve tüpü dikkatlice kurutmak için bir kağıt mendil kullanın.

Bu DNA içeren peletleri 200 mikrolitre% 70 buz gibi soğuk etanol ekleyerek ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16, 200 kez g'de santrifüjleyerek yıkayın. Süpernatanı dikkatli bir şekilde atın ve tüpü dikkatlice kurutmak için tüy bırakmayan kağıt mendil kullanın. Son olarak, sekiz mikrolitreye ayarlanmış 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek kalan süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Tüm etanol buharlaşana kadar peleti kurutun. Daha sonra 50 ila 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin, kısaca girdap yapın ve peleti çözmek için gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Burada ekstrakte edilen DNA örneklerinin fonksiyonel verimliliğini doğrulamak için, ilgili gıda kaynağına uygun evrensel primer setleri kullanarak her birini PCR ile test edin.

1.5 veya 2.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne primerler, dNTP karışımı, reaksiyon tamponu, Taq DNA polimeraz ve saflaştırılmış su ekleyerek ve standart reaksiyon karışımını girdaplayarak başlayın. Şimdi, her DNA örneği için, bir mikrolitre karşılık gelen DNA ekstraktını bir PCR plakası içindeki standart reaksiyon karışımının dokuz mikrolitresine aktarın. Plakayı kapatın ve termocycler'a yerleştirin ve PCR programını başlatın.

Bitmiş PCR reaksiyonundan sonra, PCR ürünlerini döndürmek için kısa süreli bir mini santrifüj seçeneği kullanın. Daha sonra, her bir PCR ürününün üç mikrolitresini bir mikrolitre altı kez yükleme boyası ile karıştırın. Bu numuneleri önceden hazırlanmış bir agaroz jelin jel yuvalarına yükleyin.

1.5 mikrolitre 100 baz çifti DNA merdivenini, boyut standardı olarak jelin bir yuvasına yükleyin. Elektroforez ünitesinin kapağını kapatın, bir güç kaynağına bağlayın ve jeli 35 dakika boyunca santimetre başına 100 voltta çalıştırın. Elektroforez çalışmasından sonra jeli çıkarın ve yaklaşık 10 dakika boyunca önceden hazırlanmış bir boyama banyosuna koyun.

Son olarak, jeli boyama banyosundan çıkarın ve bir jel dokümantasyon sistemine yerleştirin ve kılavuza göre görselleştirin. Yırtıcı bağırsak içeriğini analiz etmek için, önceden hazırlanmış DNA özütü çalışma solüsyonlarını kullanın. 16 av grubuna özgü primer setinin her biri için ayrı PCR reaksiyonları gerçekleştirin.

İlgili av grubuna ait bir örnekten alınan DNA ile bir pozitif kontrol ve avcı türünden alınan DNA ile bir negatif kontrol ekleyin. Bir tahsis sıralayıcının tespiti için bir sıralama plakasına yüklenirken farklı numunelerin bir araya getirilmesini önlemek ve nihayetinde yanlış sonuçların bir tüketici bireyine atanmasını önlemek için, her bir PCR plakası içindeki numune tahsisini tam olarak belgelemek çok önemlidir. Ardından, PCR reaksiyonlarını, daha önce tarif edilenle aynı protokolü kullanarak, kullanılan her bir astar seti için spesifik tavlama sıcaklığına ve döngü numarasına göre ayarlayarak çalıştırın.

Bu PCR reaksiyonlarındaki amplifiye edilmiş fragmanları tespit etmek için, A ve B olmak üzere iki partide otomatik fragman analizleri yapın. Numune yükleme çözeltisi veya SLS içeren bir karışım ve her parti için ilgili boyut standardını hazırlayın. Ardından, ilgili partiye ait sekiz PCR reaksiyonunun önceden donmuş PCR ürünlerini çözün ve karanlıkta tutulduklarından emin olun. Onları döndürmek için kısa süreli bir mini santrifüj seçeneği kullanın.

Bir sıralama plakasında, analiz edilecek numune sayısına karşılık gelen kuyucuk sayısını, her numune için ilgili SLS boyut standart karışımından 22 mikrolitre ile yükleyin. Ardından, sekiz PCR reaksiyonunun her birinden bir mikrolitre PCR ürününü plakanın ilgili kuyucuklarına yükleyin. Ardından, bu karışımı dikkatli bir şekilde döndürmek için kısa süreli bir mini plakalı santrifüj seçeneği kullanın.

Bundan sonra, her kuyuyu bir damla mineral yağ ile örtün. Daha sonra bir tampon plakanın reaksiyon kuyularını 250 ila 300 mikrolitre DNA ayırma tamponu ile doldurun. Üreticinin talimatlarına göre bir örnek kurulum oluşturmak için kılcal sıralayıcı yazılımını kullanın.

Numune kurulumundaki numunelerin tahsisinin, sıralama plakasındaki numune tahsisi ile eşleştiğinden ve numune kurulumunun ilgili partiyi işlemek için uygun yöntemi içerdiğinden emin olun. Sonuçları analiz ederken, her bir numunenin elektroferogramını görsel olarak yeniden kontrol etmek ve her bir işaretleyici primer seti için çağrılan her bir zirveyi ayrı ayrı onaylamak/onaylamamak ve bir işaretleyici primer setinin kriterlerine uyan çağrılmamış pikleri manuel olarak eklemek veya yanlış olanları silmek önemlidir. Bu protokolde gerçekleştirilen PCR analizleri için oluşturulan gruba özgü primer setlerinin etkinliğini belirlemek için besleme deneyleri yapıldıktan sonra, predatör gastrointestinal sistemden alınan DNA kullanılarak PCR sonuçları, agaroz jel elektroforezi ve tek iplikli konformasyon polimorfizmi veya SSCP kullanılarak analiz edildi.

Agaroz jel elektroforezi, incelenen farklı av türleri arasında ayırt edilemeyen çift sarmallı DNA'nın tek bantlarını ortaya çıkardı. Bunun aksine, SSCP elektroforezi, bağırsak içeriği örneklerini referans örneklerle karşılaştırarak farklı av türlerini ayırt etmede başarılı oldu. Beslenme deneyinden sonra su akarının bağırsağından ekstrakte edilen DNA, av tüketiminden sonra farklı zaman dilimlerinde dizilendi.

Beslenmeden bir ila 50 saat sonra, tespit edilen av DNA'sının nispi miktarları önemli ölçüde azaldı. İnvaziv amfipod, Dikerogammarus villosus bağırsağından ekstrakte edilen DNA, bu protokolde açıklanan 16 gruba özgü primer seti kullanılarak makro omurgasız av DNA'sı için test edildi. D.villosus bağırsak içeriğinin sadece %16'sı, hedeflenen 16 av taksonundan herhangi birine ait DNA için pozitifti.

Ayrıca, test edilen 12 av taksonunun DNA'sı en az bir örnekte bulunurken, dört taksonun DNA'sı hiçbir zaman tespit edilmedi. Bu prosedürü denerken, kullanılan primerlerin sisteminizdeki taksonlara özgü olduğundan emin olmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, laboratuvarınızda rutin olarak kullanılan yöntemleri genetik analizlerle destekleyerek trofik etkileşimler üzerine araştırmanızı nasıl genişleteceğinizi iyi anlamış olmalısınız.