Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

Bu Lazer Yakalama Mikrodiseksiyon protokolünün genel amacı, moleküler analiz için travmatik beyin hasarından etkilenen belirli beyin bölgelerinden hücreler toplamaktır. Ben Doktor Helen Hellmich. Texas Üniversitesi tıp dalında İnsan Patofizyolojisi ve Translasyonel Tıp programında öğrenci olan lisansüstü asistanım Harris Weisz, beyin hasarı çalışmalarımızda lazer yakalama mikrodiseksiyon yöntemlerini nasıl kullandığımızı gösterecek.

Bu yöntem, yürütücü işlevleri kontrol eden frontal korteks gibi ayrı beyin bölgelerinde TBH'nin neden olduğu değişikliklerin mekanizmalarını ve sonuçlarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Ve hafızaya bağlı süreçler için önemli olan hipokampus. Bu tekniğin temel avantajı, bir hastalık sürecinin birden fazla ayrı beyin bölgesi veya aynı beyinden bireysel hücre tipleri üzerindeki etkisini inceleyebilmemizdir.

Transkripsiyonel analiz içeren herhangi bir LCM prosedüründen önce, kontaminasyon ve RNA bozulması riskini azaltmak için tüm yüzeyleri RNace ortadan kaldıran deterjanla temizleyin. Beyin dokusunu depodan alın. Ve eksi 20 santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir cyrostat içine yerleştirin.

Beynin yaklaşık on dakika boyunca kriyostat odasının sıcaklığına dengelenmesine izin verin. Beyni, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde, kriyostat aşamasının üstündeki bir gazlı bez tabakasına yerleştirin. Temiz bir RNA tıraş bıçağı ile serebellumun hemen arkasındaki kısmı ve optik kiazmanın hemen önündeki kısmı kesin.

Az miktarda optimum kesme sıcaklığı ortamını iki ayrı kriyo kalıba yerleştirin. Frontal birleşme korteksi ve çekirdek accumbens çekirdeğini içeren beyni, iç tarafı aşağı bakacak şekilde bir kriyo kalıba yerleştirin. Dokuyu kaplamak için yeterli OCT ortamı ekleyin.

Bu adımı, hipokampus ve suprakiazmatik çekirdeği içeren beyin dokusu parçası ile tekrarlayın. OCT ortamının kriyostatta yaklaşık 20 dakika tamamen donmasına izin verin. Doku ve OCT ortamı tamamen donduktan sonra, bir montaj kafasına az miktarda OTC sıkın.

Donmuş bir kriyokalıbı montaj kafasına bastırın ve dokuyu içeren kalıbın kafaya güvenli bir şekilde bağlanması için OCT'nin tamamen donmasına izin verin. Kafa ekini kesit yuvasına sabitleyin ve vidayı sıkın. Bölümlerin eşit şekilde kesilmesini sağlamak için ayar kolları ile kriyostat bıçağına göre kesme açısını ayarlayın.

Kesit kalınlığını 30 mikron olarak ayarlayın. Hipokampus ve SEN içeren doku bloğunu kesitlere ayırırken, optik kiazma bregma 0.48 milimetrede düzleşene kadar kesit Üçüncü ventrikül belirginleştiğinde. Daha sonra, oda sıcaklığındaki polietilen naftalat membran slaytlarını kesitli dokunun üstüne nazikçe yerleştirerek bu noktadan SEM için kesitleri toplayın.

Doku ve OTC'nin lam üzerine tamamen eridiğini teyit ederek lamın görsel olarak yapışmasını sağlayın. Doku kesitleri olan tüm slaytları lekelenene kadar kriyostatta saklayın. Supraoptik deküsasyon başladığında toplama bölümlerini 0.72 milimetre bregma'da durdurun.

Hipokampus toplanması için, granül hücre tabakası dentat girusun boynuzları 3.00 milimetre bregma'da görünene kadar olan bölüm. Hipokampal CA alt alanları, bregma 4.78 milimetrede koronal bölümlerde kaynaşana kadar bölümleri toplayın. Bu, hipokampusun kraniyotomi ve yaralanma bölgesi altında tamamen toplanmasına izin verir.

Boyamadan önce, tüm bulaşıkları ve lekelenme alanını RNase giderici deterjan ile kimyasal bir davlumbazda yıkayın. Kriyostattan yan rafı alın ve çeker ocak içine yerleştirin. Slaytların 30 saniye ısınmasına izin verin.

Bölümleri kresil menekşe ile boyayın ve tuzlu su ile temizleyin. Lekeli slaytların rafının, çeker ocakta oda sıcaklığında en fazla on dakika kurumasına izin verin. Kuruduktan sonra hemen LCM'ye geçin.

RNA analizi için herhangi bir LCM prosedürüne başlamadan önce, toplama alanını ve cihazın etrafındaki alanı RNAse ortadan kaldıran deterjan ve %100 etanol ile silin. Mikroskop tabanını açmadan önce kızılötesi lazer üretme ünitesindeki güç anahtarını çevirin ve yazılım masaüstünden başlatılmadan önce sistemin başlatılmasına izin verin. Yazılım başlatıldıktan ve başlatıldıktan sonra, başlatma adımlarına rağmen, yazılım kurulum panelini açın ve mevcut aşama düğmesine basın.

Modüler aşama, LCM makro kapaklarının ve kızaklarının yüklenip boşaltılacağı konuma hareket edecektir. Buzlu kenarı sağa bakacak şekilde tutuculara üç adede kadar kalem zarı sürgüsü yerleştirin. İlgili slaytın yanındaki kapağı ve slayt işleme alanını seçin ve yazılıma membran cam slaytların yüklendiğini bildirmek için MEM onay kutusunu tıklayın.

Ardından, önce yakalanması istenen slayta tıklayın. Kapak yerleşimleri için doku konumu ve yönlendirme için döşenmiş bir görüntü yakalamak için araç çubuğunda görüntüyü seçin ve Genel bakış al'ı seçin. İmleci döşenmiş görüntüdeki alanın üzerine getirin, sağ tıklayın ve bölge merkezine yerleştirme başlığını seçin.

Yazılım, seçilen konumun üzerine otomatik olarak bir kapak yerleştirecektir. Kızılötesi ve UV lazerleri bulduktan sonra, seçim araçları bölmesinde serbest çizim seçeneğini seçin. Dokunmatik ekran kalemini kullanarak, dokunmatik ekran ile ekran kalemi kafası arasındaki teması kaybetmemeye dikkat ederek ilgilenilen bölgenin çevresini çizin.

Başlangıç ve bitiş noktalarını birbirine bağladığınızdan emin olun. Hipokampus toplama için, CA1, CA2 ve CA3 hipokampal alt alanlarını bregma 3.00 milimetreden başlayarak ve dentat girusun tamamen oluşturulmuş granüler tabakasını morfolojik tanımlamanın fiziksel bir dönüm noktası olarak kullanarak lazerle yakalayın. Toplama işleminden sonra, LCM makro kapaklarını QC konumuna getirin ve UV kesim dokusunun zara yapıştığından görsel olarak emin olarak tam doku yapışmasını kontrol edin.

UV lazerin dokunun tamamını kesmesi zorunludur. Bunun yapılmaması, LCM başlığına eksik doku yapışmasına neden olacaktır. Daha sonra her bir kapağı hızlı bir şekilde 100 mikrolitre hücre lisus tamponu içeren RNAse içermeyen 0.5 mililitre inceltilmiş duvarlı bir reaksiyon tüpüne yerleştirin.

Tam bir lizus sağlamak için numuneleri kısa bir süre vorteksleyin ve aşağı akış genomik analizi yapmaya hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aşağıdakiler, LCM sistemi üzerinde kızılötesi ve UV lazer fonksiyonları ile yaralanma bölgesinin epsilateral tarafından toplanan doku kesitlerinin temsili görüntüleridir. Bu, frontal dernek korteksinin bir alanıdır.

Bu görüntü, koleksiyondan sonra aynı bölgeyi göstermektedir. Ve bu, toplandıktan sonra kapaktaki dokudur. Bu görüntü, dentat girusun granüler tabakasının tam olarak oluşmuş boynuzlarının yanında bulunan hipokampusun CA1, CA2 ve CA3 parameatal katmanlarının bileşenlerini göstermektedir.

CA2 ve CA3 bölgeleri toplandı ve bu hücre popülasyonları kapak üzerinde görüldü. Burada, anterior komissür için hedeflenen nucleus accumbens core proksimal adrostralin bir alanı, kapak üzerinde aslına sadık olarak yeniden üretilmiştir. Son olarak, supraoptik kiazmaya giden suprakiazmatik nükleus rostral, TBH'den sonra LCM tarafından yakalandı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bir beyni yaklaşık sekiz saat içinde işlemek için kullanılabilir. Buna doku işleme, boyama ve LCM dahildir. Bu prosedürü takiben, metilasyon paternleri veya mikronik ekspresyon ile ilgili soruları yanıtlamak için epigenetik analiz gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, aynı beyindeki birden fazla beyin bölgesinde LCM'nin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.