Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

Phaseolus'ta raportör bir yapıya sahip dönüştürülmüş kökler elde etmek için saçlı kökler kullanılır. Elde edilen transgenik kökler, raportör genin ekspresyonunu incelemek için kullanılır. Promotör ekspresyon çalışmaları, genlerin uzay-zamansal ekspresyon modellerini anlamak için çok önemlidir.

Bugün, Phaseolus'ta kök nodülü simbiyotik koşulları altında tüylü kök indüksiyonu için metodolojileri göstereceğiz ve transgenik tüylü köklerde promotör ekspresyon paternlerini inceleyeceğiz. Estrada-Navarrete ve meslektaşları daha önce Phaseolus'ta Agrobacterium rhizogenes'in neden olduğu tüylü kök sistemini kurmuşlardır. Mevcut yöntem, tüylü kök indüksiyonunun süresini hızlandırmaya ve böylece sistemin çok yönlülüğünü artırmaya yardımcı olacaktır.

Prosedürleri göstermek için meslektaşım Manoj-Kumar Arthikala ve laboratuvarımdan lisans öğrencileri Alma Leticia ve Brenda Mariana olacak. Başlamak için, Phytozome'dan Phaseolus vulgaris genom veritabanında NIN gen dizisini arayın ve ATG'ye yukarı akışta gerekli dizi uzunluğunu seçin. Uygun promotör dizi analizini takiben oligonükleotidleri tasarlayın.

Yeni hazırlanmış Phaseolus genomik DNA, promotör dizisini PCR amplifiye etmek için şablon görevi görecektir. PCR ana karışımını, önceden tasarlanmış oligonükleotidlerle birlikte yüksek kaliteli Taq polimeraz ve standart PCR bileşenleri ile hazırlayın. Ana karışımı 2 mL PCR tüplerine ayırın ve promotör fragman amplifikasyonunu bir termodöngüleyicide ve uygun bir programla gerçekleştirin.

PCR ürününü elektroforetik olarak %1.2'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın. UV transillüminasyonu altında 700 baz çiftinde amplifiye edilmiş NIN fragmanını görselleştirin. Standart talimatları izleyerek parçayı Gateway giriş vektörü pENTR/D-TOPO vektörüne çıkarın, çıkarın ve klonlayın.

Reaksiyon karışımının iki mikrolitresini 50 saniye boyunca 42 santigrat derecede yetkin E.coli hücrelerine dönüştürün ve dönüştürülmüş E.coli'yi litre başına 50 miligram kanamisin ile desteklenmiş LB üzerine yerleştirin. Kaplanmış hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. M13 oligonükleotidleri kullanarak rastgele seçilen E.coli kolonilerinden izole edilen plazmitler için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.

1024 baz çiftindeki parça, pozitif klonları göstermelidir. Pozitif giriş klonu ile hedef ikili vektör arasındaki LR reaksiyonunu gerçekleştirin. İki mikrolitre reaksiyon karışımını E.coli'ye dönüştürün ve 37 santigrat derecede litre spektinomisin başına 100 miligram kolonileri seçin.

Plazmitleri NIN'e özgü oligonükleotidlerle çoğaltın. Pozitif klon 700 baz çiftinde yükselmelidir. Klon parçasının doğruluğunu sıralayın ve doğrulayın.

NIN promotör yapısını elektroyetkin K599 Agrobacterium rhizogenes hücrelerine mobilize edin. Ve bir kez daha, klonu promotöre özgü oligonükleotidlerle onaylayın. Kükürt, Phaseolus vulgaris tohumlarını sterilize eder ve 28 santigrat derecede karanlıkta iki gün boyunca steril, ıslak filtre kağıtları üzerinde çimlenir.

Spektinomisin seçimi ile LB plakalarına NIN yapısı ve kontrol vektörü ile 150 mikrolitre Agrobacterium rhizogenes hücresi yayın. Kültürü bir gecede 28 santigrat derecede büyütün. Phaseolus fidelerini ayırın ve plakadan bükülmüş, 200 mikrolitrelik bir uçla Agrobacterium rhizogenes hücrelerini kazıyın.

Ve bir mL steril, damıtılmış su ile Eppendorf Tüpüne tekrar süspanse edin. Agrobacterium rhizogenes hücrelerini üç mL'lik bir şırıngaya toplayın ve Phaseolus fidelerini önceden hazırlanmış tüp kurulumuna yerleştirin. Çimlenmiş tohumların hipokotillerini iğne ucuyla hafifçe delin ve aynı anda Agrobacterium rhizogenes hücrelerini enjekte edin.

İğnenin hipokotilden geçmemesine dikkat edilmelidir. Enjekte edilen fideleri 16 saat aydınlık ve sekiz saat karanlık fotoperiyot ile 28 santigrat derecede bir büyüme odasında tutun. Yaralı hipokotiller üzerindeki nasır beş ila yedi gün arasında görünür olmalıdır.

İki hafta sonra, saçlı köklerin iki santimetre altından sapı keserek birincil kökü çıkarın ve steril vermikülit içeren saksılara nakledin. Aynı zamanda, nodülasyonu indüklemek için bitkileri bir ml Rhizobium tropici ile aşılayın. Rhizobium kültürünü OD 600'de 6'ya seyrelttiğinizden emin olun.

Bitkileri 28 santigrat derece, 16 saat aydınlık ve sekiz saat koyu fotoperiyotta bir büyüme odasında tutun ve B ve D solüsyonu ile sulayın. NIN promotörün uzay-zamansal ifade modellerini incelemek için örnekleme farklı zaman noktalarında yapılır. Bitkileri köklere zarar vermeden çıkarın ve kökleri vermikülit lekesi olmadan yıkayın.

NIN ve kontrol bitkilerinden kökleri rastgele seçin ve numuneleri GUS tahlil tamponunda 37 santigrat derecede karanlıkta 16 saat inkübe ederek GUS histokimyasal boyamaya devam edin. GUS lekeli kökleri stereo ve bileşik mikroskop altında gözlemleyin. Bu resim, birincil köklerde Rhizobium ile indüklenen NIN promotör ekspresyonunu göstermektedir.

NIN promotör ekspresyonu, Rhizobium ile enfekte kök saç hücrelerinde de görülebilir. Ayrıca, GUS ekspresyonu kök nodülü gelişiminin farklı aşamalarında belgelenebilir. Vektör kontrol köklerinde GUS ifadesi görülmedi.

Bu videoyu izledikten sonra, promotör yapılarınızı tasarlamayı ve Phaseolus'un transgenik tüylü köklerindeki promotör ekspresyon modellerini incelemeyi iyi anlamış olmalısınız. Bu sistem, Phaseolus'taki diğer simbiyotik ve patojen etkileşimleri ve ayrıca diğer ödikotlar altındaki promotör ekspresyon modellerini incelemek için daha da genişletilebilir.