Name: Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin ortak fasulyede kök nodülü spesifik promotörlerin karakterizasyonu için Agrobacterium rhizogenes ile tüylü kök indüksiyonu ve transgenik köklerde gen ifadesi analizi yöntemlerini. Bu protokol bitki gen düzenlemesi araştırmalarında değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen Dirección General de Asuntos del tarafından desteklenen kişisel Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (Hayır verin. IN219916 M.L ve IA205117 için M-K. A) ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT grant No 240614 M.L. için).

1. kimlik, yalıtım ve P. Vulgaris NIN organizatörü klonlama
<ol>
	<li>Gen ilgi için organizatörü sırasını tanımlayın. Orada birkaç genom veritabanları ve analiz araçları için bitkiler gibi Phytozome, Ensembl bitkiler, NCBI, vb A baklagil organizatörü P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) bu çalışma20dakika içinde kullanıldı.</li>
	<li>Tasarım oligos için ağ geçidi veya geleneksel restriksiyon enzimi vektör sistemine bağlı olarak klonlama (şekil 1A) kullanılır. Not: Standart (25-35 bp), desalted astar iş para cezası. Organizatörü ve gen arasında sarmayı ters oligo dizileri tavsiye vardır.</li>
	<li>PvNIN organizatörü bölge (veya gen ilgi organizatörü bölge) taze izole P. vulgaris yükseltmek genomik DNA organizatörü özgü oligo seti kullanarak. Yüksek sadakat polimeraz ile aşağıdaki PCR koşullar kullanın: 95 ° C 5 dakika; 30 döngüsü (95 ° C 30 s, 30 55 ° C s, 1 dk 72 ° C); ve 5 min için 72 ° C.</li>
	<li>% 1'özel jel 60 V 7 x 10 cm jel tepside güçlendirilmiş parçası çalıştırın ve karşılık gelen amplicon elute (700 bp, şekil 1B) ve üreticinin yönergelerine göre pENTR/D-TOPO vektör içine klon.</li>
	<li>Tepki yetkili Escherichia coli içine 2 µL dönüştürmek lysogeny kardeşim (LB) 50 mg/L sefaloridin (Kan50) ile desteklenmiş üreticinin yönergeleri ve plaka 150 µL dönüştürme karışımı kullanarak hücreleri. 37 ° C'de kaplama hücreleri gecede büyümek.</li>
	<li>3-6 kolonileri ve onları Kan50 içeren LB ortamda gecede kültür seçin. Plazmid DNA seçtiğiniz yöntemi kullanarak yalıtmak ve plazmid tarafından PCR vektör belirli M13 oligos kullanarak çözümleyebilirsiniz. PCR, plazmid, 0 pm 3, oligos, kullanım 100 ng için 10 PCR arabellek, 0.5 U Taq DNA polimeraz ve 10 mM dNTPs X.</li>
	<li>Aşağıdaki PCR güçlendirme koşullar kullanın; 3 min için 95 ° C; 30 döngüsü (95 ° C 30 s, 30 58 ° C s, 75 72 ° C s); ve 7 dk. 72 ° C % 1'özel jel PCR ürünlerde görselleştirin. Doğru eklemeleri 1.024 bp ve vektörler ekler olmadan bir 324 bp grup (şekil 1 c) sahip bir band olduğundan emin olun.</li>
	<li>LR tepki bir giriş vektör (pENTR/D-TOPO-PvNIN) ve üreticinin yönergelerine göre ticari enzim karışımı kullanarak hedef vektör pBGWFS7.021 arasında gerçekleştirin.</li>
	<li>LR tepki yetkili E. coli içine 2 µL dönüşümü üreticinin yönergeleri ve plaka 150 µL dönüştürme karışımı 100 mg/L Spektinomisin (Spe100) ile desteklenmiş LB açıklandığı gibi standart yöntemlerle hücreleri. 37 ° C'de kaplama hücreleri gecede büyümek.</li>
	<li>Yaklaşık 5 kolonileri alın ve onları bir gecede Spe100 içeren LB ortamda kültür. Plazmid DNA seçtiğiniz yöntemi kullanarak yalıtmak ve plazmid tarafından PCR organizatörü özgü oligos kullanarak çözümleyebilirsiniz.</li>
	<li>PCR koşulları adım 1.3 kullanın. Amplifikasyon onaylamak için % 1'özel jel PCR ürünlerde görselleştirin. Amplicons olan 700 bp.</li>
	<li>Pozitif plazmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (şekil 1 d) ekleme orijinalliğini doğrulamak için organizatörü özgü oligos ile sıra.</li>
	<li>Plazmid ( A. rhizogenes diğer suşların ancak, kullanılabilir) A. rhizogenes süzün K599 dönüşümü. Aşağıdaki ayarlarla electrocompetent hücreleri ve electroporate 1 mm küvet içinde 50 µL plazmid hazırlık 2 µL ekleyin: 1.8 kV, 25 µF ve 200 Ω.</li>
	<li>Hücreleri kurtarmak ~ 500 µL SOC orta ve 28 ° c için 2 h. LB-Spe100 tabağa sallamak ve 28 ° C de 2 gün büyümek.</li>
	<li>1.7. adımda belirtildiği gibi koloni tarama gerçekleştirmek ve PCR koşulları adım 1.3 olduğu gibi kullanın. Gliserol hisse senetleri olumlu klonları yapamaz ve stok onları içinde-80 ° C.</li>
	<li>A. rhizogenes kültür negatif kontrol olarak boş pBGWFS7.0 vektör yataklık kullanın.</li>
</ol>
2. A. Rhizogenes kıllı kökleri ortak Bean dönüştürdü
<ol>
	<li>Fasulye (P. vulgaris cv. zenci Jamapa) tohumları (yaklaşık 20) 50 ml % 96 etanol 1 dk. için sterilize ve etanol atın; daha sonra sabit bir laminar akış mahallede karıştırma ile 10 dakika, 50 mL % 20 çamaşır suyu (sodyum hipoklorit) ekleyin. Çamaşır suyu kaldırmak ve 3 kat fazla steril suda yıkayın. Not: Diğer P. vulgaris çeşitlerin kıllı kök indüksiyon için kullanılabilir.</li>
	<li>Steril filtre kağıtları Broughton ile nemlendirilmiş sterilize tohumlar çimlenme &#38; Dilworth (B &#38; D) çözüm22 (Tablo 1) içinde belgili tanımlık karanlık 28 ° C'de 2 gün</li>
	<li>Dönüşüm önceki gün birini hazırlayın:
	<ol>
		<li>A. rhizogenes kültür (1.13 ve 1.14 adımlarda hazır) ikili vektör yataklık 150 µL dışarı katı LB Spe100 üzerinde çizgi ve 28 ° C'de gecede büyümek.</li>
		<li>15 mL tüp B ile doldurmak &#38; D çözüm ve Değiştir çift katmanlı alüminyum folyo ile vidalı kapak. B 10 mL içeren bir 22 cm cam tüp monte &#38; D çözüm (şekil 2C) ve basınçlı kap onu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dönüşüm günü, laminar akış hood aşağıdaki steril malzemeler montajı: germinated tohum kimden adım 2.2, adım 2.3.1, adım 2.3.2 tüpler, steril Çift Kişilik distile su (10 mL), Pipetler ve pipet ipuçları, steril forseps, kültür plaka ve 3 mL şırınga.</li>
	<li>Bükülmüş bir 200 µL ipucu plaka A. rhizogenes hücrelerden microcentrifuge tüpüne scrape ve 1 mL çiftli steril su resuspend için kullanın. Benzer şekilde, ayrı ayrı vektör kontrol hücreleri hazırlayın.
	<ol>
		<li>Yavaşça resuspend hücrelere karıştırın. Değil girdap yapmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tüpler alüminyum folyo adım steril pipet ucu kullanarak 2.3.2 üzerinde 3 mm delik açın.</li>
	<li>Adım 2.5 şırınga hücreleri (organizatörü ya da vektör kontrolü) toplamak ve biraz hypocotyls iğne ucu (Şekil 2 g) ile germinated tohum dikmek. Not: iğne nüfuz eder (4 - 6 kat) damar dokusu emin olun ve küçük enjekte (~ 5 µL) hücre hypocotyl etrafında farklı pozisyonlarda yaranın üzerine düşer.</li>
	<li>Dikkatle sokmak enjekte fidan köklerinin B içeren 15 mL tüp 3 mm delik &#38; D çözüm. Tüm kurulum 22 mL cam tüpler dönmek ve onları nem korumak için mühür.</li>
	<li>16 h ışık: 8 ile 28 ° C'de tutulan bir büyüme odası tüplerde kuluçkaya s karanlık photoperiod. Notlar: 3-4 gün sonra kuluçka, 22 mL cam tüpler azına kadar bitkiler büyümek.</li></ol>Bu aşamada, caps kaldırmak ve şekil 2Iiçinde gösterildiği gibi RIM ile parafilm kök etrafında mühür.
	<li>Kallus yaralama sitelerdeki 5-7 gün gözlemlemek ve bulmak ~ 2 cm kıllı kökleri tarafından 10-12 gün sonra dönüştürme. Not: B sağlamak önemlidir &#38; D sürekli plastik ve cam tüpler çözümde.</li>
	<li>2 hafta sonra birincil kök kök kıllı kökleri aşağıda 2 cm kesim tarafından kaldırmak ve birincil kökleri steril vermikülit içeren tencere nakli. Bir büyüme odası (16 h ışık: 8 h 28 ° C'de karanlık) tesislerinde korumak ve B ile sulama &#38; D çözüm.</li>

3. organizatörü analizi: NIN organizatörü ifade ortak Bean Rhizobial nodüller
<ol>
	<li>Kök nodüller indüksiyon için aşılamak Rhizobium tropici veya (ortak fasulye uyumlu olan) Dana eti tas Rhizobium 700 mM CaCl2 ve 20 mg mL– 1 ile desteklenmiş PY orta (0.5 g pepton, 0.3 g maya özü) 100 ml nalidixic asit. 24 h 30 ° C'de 300 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya. Not: Belirli herhangi bir antibiyotik transgenik Rhizobiumsöz konusu olduğunda kullanılabilir.</li>
	<li>2.800 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj hücrelerde cips ve 10 mL 10 mM MgSO4resuspend. 0,6 OD600 hücrelere OD seyreltme 10 mM MgSO4ile ayarlayın.</li>
	<li>1-2 mL (3.2 adımından hazır) kültür kıllı kökleri üzerinde nodül büyümesini teşvik için bitki (organizatörü ve vektör kontrolü) başına aşılamak. B bitkilerle sulama &#38; nodulation tanıtmak için sınırlı azot (2 mM KNO3) ile D çözüm.</li>
	<li>Deneysel ihtiyaç bağlı olarak, farklı zaman noktalarda kıllı kökleri toplamak. 3-5 gün arasında enfeksiyon konu çalışmak için toplama örnekleri aşılama (dpi) sonrası. Not: İlkel nodül ve genç nodüller 6-9 dpi ve 10-12 gün dpi, sırasıyla ele. Son olarak, olgun ve fonksiyonel nodüller, 14-21 dpi ve senesced nodüller, okudu &#62; 28 dpi.</li>
	<li>Kök/nodüller reporter genler (GUS veya GFP) etkinlik için işlem. GUS etkinlik Jefferson23tarafından açıklanan protokolüne göre analiz. GFP floresan mikroskop altında gözlemlemek. GFP floresan mavi argon iyon lazer ile tahrik (488 nm) ve verilmiş Floresans 510 toplamak için 540 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li>
<li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing%2C+Data+Interpretation%2C+and+Database+Usage+in+Genomic+Era%3A+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321(2015).</li>
<li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation%2C+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris%3A+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53(2016).</li>
<li>Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+of+a+symbiosis-specific+phosphate+transporter+is+mediated+by+a+transient+reorientation+of+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).</li>
<li>Kryvoruchko, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MtSWEET11%2C+a+Nodule-Specific+Sucrose+Transporter+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).</li>
<li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li>
<li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090(2016).</li>
<li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li>
<li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li>
<li>Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene%2C+enhances+symbiosome+number%2C+bacteroid+size%2C+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li>
<li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li>
<li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li>
<li>Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li>
<li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5%27-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li>
<li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li>
<li>Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseolus+vulgaris+RbohB+functions+in+lateral+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development.</a> Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).</li>
<li>Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+genes+in+mycorrhized+and+nodulated+roots+of+common+bean+are+associated+with+defense%2C+cell+wall+architecture%2C+N+metabolism%2C+and+P+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182328(2017).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control of leghemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1178271/">Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system.</a> Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).</li>
<li>Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+soybean+hairy+roots+and+propagation+of+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode.</a> Planta. 210 (2), 195-204 (2000).</li>
<li>Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Composite+Plants+in+Medicago+truncatula+used+for+Nodulation+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2633(2011).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+expression+of+hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules.</a> Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e795">Hairy Root Transformation in Lotus japonicus.</a> Bio-protocol. 3 (12), e795(2013).</li>
<li>Jacobs, T. B., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+CRISPR+Vector+Construction+and+Characterization+of+DNA+Modifications+by+Generation+of+Tomato+Hairy+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots.</a> J. Vis. Exp. (110), e53843(2016).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sırasında fonksiyonel analiz genlerin çalışma gen ifade kalıplarının genler vivo içindekayma ve temporal Yönetmeliği anlamada önemli bir rol oynar. Gen ifade desen çalışması için iyi bilinen bir yöntem gen düzenleyici bölgesi faiz, clone etmektir muhabir genlerle floresan marker gen (GFP, RFP, vb) veya β-glucuronidase gibi ters yönde. Burada, kök nodül sembiyoz (RNS) belirli bir gen, P. vulgaris spatio-temporal ifade desenleri RNS sırasında çalışmaya NIN, organizatörü bölgenin seçtiniz. Seçili ...

Organizatör ilgi genlerin ifade Yönetmeliği anlamada önemli bir rol oynamak önemli moleküler biyolojik araçlardır. Organizatör akıntıya karşı bulunan DNA dizileri vardır çeviri başlama kodonu gen dizileri ve gen; Merkezi düzenleyici bilgi taşırlar Bu nedenle, onların doğru ek açıklama ve karakterizasyonu gen işlevini anlamak için çok önemlidir. İfade desenleri bağlı olarak bitki rehberleri bünye, doku özgü veya geliştirme aşamasında özel ve indüklenebilir1sınıflandırılır. Transcriptomic teknolojileri, Bilgisayar modellemesi gelişmeler ve artan sayıda genom dizileri farklı bitki türü için kullanılabilirlik gelişmeler organizatörü dizileri2büyük ölçekli tahmin kolaylaştırdı.
Öte yandan, organizatörü değerlendirme araçları ve hızlı, verimli ve tekrarlanabilir genetik dönüşüm teknikleri kurmak için önemlidir. Diğer model bitkilerin esas Phaseolus sp. istikrarlı genetik dönüşümü için inatçı doğası gereği ortak fasulye baklagil (P. vulgaris) gen işlevsel karakterizasyonu engellemiştir. Geçici dönüşüm sistemleri hızlı gen işlevsel karakterizasyon çalışmaları3için bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Baklagil sembiyoz araştırmada, baklagil ana bitki ve rhizobial bakteri arasındaki etkileşimi nodül özel genler ve organizatörü çalışmaların fonksiyonel analiz için en uysal modeli sistemlerinden biridir. Şimdiye kadar bu symbioses ilgili birkaç baklagil rehberleri-si olmak be karakterize, sırasıyla, Medicago truncatula PT4'ü4, SWEET115, Lotus japonicus Tepegöz, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, vs. CIS öğeleri doğrudan gen düzenlemesi etkiler. Transkripsiyon faktörü ENBP1A bir CIS düzenleyici bölgenin erken nodulin VfENOD12 için (−692 bp) bağlar ve bu nodül primordia Vicia faba16bir muhabir gen ifadesinin kolaylaştırır. CIS düzenleyici bölgeleri değiştirme (−161 −48 bp için) nodül özgü düzenleyicinin leghemoglobin GLB3 kapaklı ile kesilmiş rehberleri δ-p35S ve δ-pNOS, nodül özgüllük kaybına neden ve organizatörü faaliyet17 azaltılmış .
Önceki raporlar NIN kök saç hücreleri rhizobial enfeksiyonu başlatılması için gerekli olduğunu ve aynı zamanda nodül organogenesis L. japonicus18için gerekli transkripsiyon faktörü gösterin. Bu da çalışmanın, bir protokol tanıma, yalıtım, klonlama ve nodül özgü organizatörü ortak fasulye kıllı kökleri karakterizasyonu açıklar. Bunu başarmak için biz P. vulgaris rhizobial bir sembiyoz özgü NIN organizatörü seçili ve transkripsiyon bir füzyon chimeric gazeteciye GUS enhanced::GFP klonlanmış. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir hızlı ve çok yönlü sistem indüklenen A. rhizogenes kıllı kökleri kullanarak P. vulgaris genetik dönüşümünün açıklar. Bu sistem dönüştürme sonra 2 haftadan az kıllı kökleri oluşturur. Son olarak, boyama GUS tarafından kolonize rhizobia kök nodüller NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade değerlendirilir.
Burada açıklanan yordamı sadece nodulation ve mycorrhization11 baklagil bitkilerin incelenmesi, ancak aynı zamanda organizatörü ifade desenleri kökleri19çalışma için yararlı olabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı olmayan uzman laboratuvarlarda kullanımı kolay.

<table><tbody><tr><td><qRT-PCR testi için güçlü > primerler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN İleri</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Ters</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 İleri</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Ters</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > < / güçlü></td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim Karışımı&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&nbsp;</td><td>Bitki sistemleri biyolojisi</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr> <tr><td>Platin Taq DNA Polimeraz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Bitki Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Hızlı Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platin Pfx DNA Polimeraz</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Sertifikalı Moleküler Biyoloji Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atış TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spektinomisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Nalidiksik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Jel yükleme çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</strong</td><td>>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Veriti Termal Döngüleyici</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Jel dokümantasyon ünitesi</td><td>Carestream</td><td>Jel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 Çalkalama İnkübatörü - 115VAC</td><td>Termo bilimsel</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>Bitki büyüme odası</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Yatay laminarair akış kabini</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Bıçağı</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Konik Santrifüj Tüpler</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22 mL cam tüpler</td><td>Thomas scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

bitki organizatörü analizleri: kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

Gen dizileri kodlama ters yönde dizisi organizatörü sırası olarak denir. Organizatör ifade şekillerinin eğitim gen düzenlemesi ve kronolojik zamanmekansal ifade desenleri hedef genlerin anlamakta çok önemli. Öte yandan, organizatörü değerlendirme araçları ve hızlı, verimli ve tekrarlanabilir genetik dönüşüm teknikleri kurmak için önemlidir. Bu çalışmada, biz Phaseolus vulgaris rhizobial sembiyoz özgü nodül kuruluşundan (NIN) organizatörü transgenik kıllı kökleri kronolojik zamanmekansal ifade desenini araştırdık. Bitki genom veritabanları ve biz tespit, analiz araçları kullanmak izole ve P. vulgaris NIN organizatörü chimeric gazeteciye transkripsiyon bir füzyon klonlanmış β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir hızlı ve çok yönlü sistem indüklenen Agrobacterium rhizogenes kıllı kökleri kullanarak P. vulgaris genetik dönüşümünün açıklar. Bu sistem, 10-12 gün sonra dönüştürme ≥2 cm kıllı kökleri oluşturur. Daha sonra aşı Rhizobium kıllı kökleri sonrası aşılama belirli aralıklarla NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade değerlendirildi. GUS etkinliği tarafından tasvir bizim sonuçlar NIN organizatörü nodulation işlemi sırasında etkin gösterir. Birlikte, mevcut iletişim kuralı tanımlamak, ayırma, klon ve ortak fasulye kıllı kökleri bir bitki organizatörü karakterize gösterilmiştir. Ayrıca, bu iletişim kuralı olmayan uzman laboratuvarlarda kullanımı kolay.

Bu çalışmanın amacı nodül özel P. vulgaris NIN kronolojik zamanmekansal ifade desenini değerlendirmek için yapıldı. Bunu yapmak için çeviri başlama kodonu NIN gen, akıntıya karşı 700 bp bölge seçildi ve birtakım oligos şekil 1A' tasvir gibi tasarlanmıştır. Yüksek sadakat polimeraz kullanarak NIN organizatörü parçası güçlendirilmiş, (şekil 1B) izole ve transkripsiyon bir füzyon oluşturmak için bir ağ geçidi yakla...

Organizatörü ifade analizleri gen düzenlemesi anlayış ve hedef genlerin kronolojik zamanmekansal ifade geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada biz tanımlamak, ayırma ve bir bitki organizatörü klon için bir protokol mevcut. Ayrıca, ortak fasulye kıllı kökleri nodül özgü organizatörü karakterizasyonu açıklar.

Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Phaseolus'ta raporlayıcı bir yapı içeren transforme kökler elde etmek için tüylü kökler kullanılır. Elde edilen transgenik kökler, raporlayıcı genin ekspresyonunu incelemek için kullanılır. Promotör ekspresyon çalışmaları, genlerin uzaysal ve zamansal ekspresyon modellerini anlamak için kritik öneme sahiptir.Bugün, Phaseolus türlerinde tüylü kök indüksiyonu metodolojilerini göstereceğiz ve kök nodül simbiyoz koşulları altında transgenik tüylü köklerde promotor ekspresyon modellerini inceleyeceğiz. Estrada-Navarrete ve arkadaşları daha önce Phaseolus'ta Agrobacterium rhizogenes ile indüklenen tüylü kök sistemini kurmuşlardır. Mevcut yöntem, tüylü kök indüksiyonu süresini hızlandırmaya ve böylece sistemin çok yönlülüğünü artırmaya yardımcı olacaktır.Prosedürler, meslektaşım Manoj-Kumar Arthikala ve laboratuvarımdan lisans öğrencileri Alma Leticia ve Brenda Mariana tarafından gösterilecektir. Başlamak için, Phytozome'un Phaseolus vulgaris genom veritabanında NIN gen dizisini arayın ve ATG'nin yukarısında gerekli dizi uzunluğunu seçin. Uygun promotör dizi analizini takiben oligonükleotidleri tasarlayın.Yeni hazırlanmış Phaseolus genomik DNA'sı, promotör dizisinin PCR ile amplifikasyonu

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kıllı kök kompozit bitkiler, bitki-Rhizobium etkileşimleri ve nodül-dönüşümü zor olan türlerin çalışma nasıl kullanılabileceğini Biz...

Kompozit Bitkiler Üretimi Medicago truncatula Nodül Tahliller için kullanılan

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi (LRIS), lateral köklerin senkron indüksiyonuna izin verir ve Arabidopsis thaliana ve mısır için sunulmuştur.

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Ve Mısır

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Burada sunulan Protokolü amacı endosphere izole Bacillus mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Bu yöntem önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tanımlamasını kolaylaştırır ve prensip olarak diğer endophytes ve bitkilerle küçük ayarlamalar için geçerli olduğunu.

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için

Görselleştirme ve kök büyüme in situ ölçme son derece zordur. Biz kök gelişimi ve nükleer silahların yayılmasına karşı zaman içinde yanıt-e doğru besin zenginleştirme izlemek için özelleştirilebilir rhizobox Yöntem mevcut. Bu yöntem kök plastisite yanıt bir organik azot kaynağı olarak Mısır genotypic farklılıklar analiz etmek için kullanılır.

Kök büyüme ve yerelleştirilmiş besin kavramaları görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir Rhizobox Protokolü

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Burada, kompozit bitkiler üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği tek adımlı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz.

Agrobacterium rhizogenes Bazlı Tüylü Kök Dönüşümü ile Kompozit Bitkilerin Üretilmesi İçin Verimli ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Öğrenin ortak fasulyede kök nodülü spesifik promotörlerin karakterizasyonu için Agrobacterium rhizogenes ile tüylü kök indüksiyonu ve transgenik köklerde gen ifadesi analizi yöntemlerini. Bu protokol bitki gen düzenlemesi araştırmalarında değerli bir araç sunar.

Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet