Name: Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Öğrenin bakteriyofaj sentezi için E. coli hücre dışı transkripsiyon-translasyon sistemini kullanarak moleküler kendi kendine toplanma mekanizmalarını inceleyin. Bu yöntem sentetik biyoloji araştırmalarında biyokimyasal sistemlerin yapılandırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu malzeme Office deniz Araştırma Ödülü sayıya N00014-13-1-0074 (V.N.) tarafından desteklenen çalışma dayanır, insan Sınır Bilim Programı hibe numarası RGP0037/2015 (V.N. için) ve iki uluslu Bilim Vakfı (V.N.) 2014400 verin.

<ol><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metab Eng. , (2011).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2FmL+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+cell-free+expression+toolbox%3A+application+to+synthetic+gene+circuits+and+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells.</a> ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expanded+cell-free+protein+synthesis+using+endogenous+pyrrolysyl+orthogonal+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system.</a> Biotechnol Bioeng. , (2015).</li>
<li>Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li>
<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li>
<li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+DNA+for+Rapid+Prototyping+of+Synthetic+Biological+Circuits+in+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System.</a> Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth Biol. , (2016).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies%3A+tubes%2C+rings%2C+and+doughnuts%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762(2013).</li>
<li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li>
<li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+biochemical%2C+biophysical%2C+and+physiological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar aşağıdaki rakip mali interest(s) ilan: Noireaux laboratuvar MYcroarray, MYtxtl protein boş hücre sağma seti distribütörü araştırma fonları alır.

Chen, et al. teknikte takip 14 SPMC için önemli bir adım superinfection için uygun koşullar belirlerken ulaşılır. En yakın bir ana yük'ın yeteneği superinfection dayanacak şekilde denetleyen parametre sık ilk bulaşmasını fajının bölgedir. Konak hücreleri Logaritmik büyüme aşamasında ilk enfeksiyon fajının çok küçük bir miktar ile önce olması gerekir. Sonunda, fajının Ayrıca Logaritmik büyüme ulaşacak ve bırakmak fajının her konak hücrede birden çok kopyası için hücre sayısı hızla geçmek ü...

Son on yıl içinde ifade boş hücre teknolojisi acil çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili sentetik ve nicel Biyolojide adres roman uygulamaları için tasarlanmış. Aslında proteinler yaşayan bir organizma bağımsız ifade etmek için kullanılan, önemli ölçüde bu teknoloji kapsamını genişleterek her iki temel ve Uygulamalı Bilimler1,2, yeni boş hücre TXTL sistemleri geliştirilmiştir. TXTL platformları yeni nesil kullanıcı dostu, olmak için tasarlanmış daha verimli (2 mg/mL toplu iş modu3protein sentezi, daha ulaşan) transkripsiyon4düzeyde çok yönlü ve böylece olarak için modüler kolayca roman doğal entegre veya varolan biyolojik sistemleri5,6yeteneklerini genişletmek sentetik işlevleri. Özellikle, boş hücre TXTL sistemleri tasarım yapı testin azaltarak, düzenleyici elemanlarının veya küçük genetik devreleri7,8,9, gibi genetik programların hızlı prototipleme için kullanışlı hale gelmiştir bir kaç gün için döngüsü. Dikkat çekici, yeni TXTL da coliphages10,11güçlü aktif genomik sulandırma desteklemek için yeterli performans gösteren, tam sentezi gibi büyük DNA programları işleyebilme yeteneği olan sistemlerdir DNA canlı varlıklar kodlanmış.
TXTL sistemleri geleneksel vitro yapıcı biyokimyasal deneyleri için karşılaştırıldığında birçok teknik avantajları mevcut. Boş hücre TXTL gen ekspresyon sürecin nihai ürün yaşam hücrenin karmaşık sitoplazma aksine, azaltılmış ve açık bir ortamda bağlar. TXTL DNA, modern DNA montaj teknikleri ile uygun fiyatlı ve titiz protein saflaştırma adımlar gerektirmeyen yanı sıra hızlı olan biyokimyasal sistemleri vitro, yeniden oluşturmak için kullanır. İfade boş hücre bileşenlerinin biyokimyasal reaksiyonlarda böylece moleküler etkileşimleri12daha derin bir diseksiyon izin doğrudan erişim sağlar. TXTL tepki olarak bir yaşam hücrede neredeyse imkansız olacaktır, biyokimya ve biyofizik ayarlarını değiştirebilirsiniz. Bu avantajları ve son gelişmeleri göz önüne alındığında, TXTL teknoloji sentetik ve nicel Biyoloji için alternatif bir platform olarak daha popüler hale geliyor. TXTL standart bir teknoloji olan Biyomühendislik hale geliyor ve TXTL kullanarak araştırma topluluğu hızla büyüyor olsa da, nasıl TXTL reaksiyonlar ve için icra etmek ile ilgili yeterli yöntemler geliştirmek için böyle platformlar kullanılacağını anlamak önemlidir sonuçların yorumlanması.
Bu makalede, biz nasıl sentez, one-pot tepkiler onların genom11, MS2 gibi bacteriophages için bütün bir E. coli TXTL sistemi kullanılacağını açıklar (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) ve T7 (dsDNA, 40 kb). Biz nasıl phages miktarı ile ilgili olarak bazı reaksiyonlar (magnezyum ve potasyum konsantrasyonu) biyokimyasal ayarları değişiklikleri sentezlenmiş gösterir. Moleküler kalabalık, taklit bir PEG aralığı 8000 konsantrasyonları ile büyüklükte birkaç emir fajının sentezi üzerinde dramatik bir etkisi vardır. Aynı anda transkripsiyon, çeviri, süreçleri özetlemek ve kendinden montajlı Biyoloji ve biyofizik ile ilgili temel sorulara adresleme için ilginç tek tüp reaksiyonlar büyük tür biyokimyasal sistemlerde gerçekleşme 10 (gen düzenlemesi, kendinden montajlı), yanı sıra yeni nanoyapıların13oluşturmak için fajının işlevleri repurposing gibi uygulamalar, geliştirmek gibi. TXTL üzerinde bir pratik ek olarak, biz yöntemleri fajının amplifikasyon, genom çıkarma ve arıtma ve FAJ miktar için plak tahlil tarafından sağlar. Bu el yazması sunulan E. coli dayalı özü boş hücre sistemleri kullanan ve bacteriophages içinde ilgilenen araştırmacılar için uygun yöntemlerdir.
Bu çalışmada sunulan protokolleri takip özetlenebilir: 1) fajının amplifikasyon (gün 1: aşılama hazırlamak hücreleri, 2. gün: tek plak, birden çok fajının büyüme ve konsantrasyon ve 3. gün: FAJ arıtma), 2) çift sarmallı genomu DNA ekstraksiyon (fenol/kloroform çıkarma) ve 3) boş hücre fajının tepki ve titresi deney (gün 1: konak hücreleri plaka ve Ağar Kaplamalar, yapmak 2. gün: öncesi kültür ve gün 3 hücre hücre-Alerjik reaksiyon ve ana bilgisayar: konak hücre kültür ve FAJ titresi).

<table><tbody><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Gradyan yapıcı</td><td>BioComp Gradient Master</td>, <td>bakınız Anal Biochem. 1985 Temmuz; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga ve Künt Kanül</td><td>Monoject</td><td>8881513918 ve 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Geniş çaplı pipet uçları</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Plak sayacı</td><td>Yeni Brunswik Bilimsel</td><td>Koloni Sayacı Modeli C-110</td><td></td></tr><tr><td>Kültür tüpleri</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Hücresiz sistem</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Model 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB agar plakası tarifi</td><td></td><td></td><td>25 g/L Luria-Bertani ortamı (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents ürün numarası BP1426) ve 15 g/L Bacto-Agar katı (Brenton, Dickenson and Company - ürün numarası 214010).</td></tr></tbody></table>

bir e. coli -bulaşıcı bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Boş hücre transkripsiyon-çeviri (TXTL) sistemleri, bir daha fazla çok yönlülük ve modülerlik, temel ve Uygulamalı Bilimler test tüpü tepkileri gerçekleştirmek için yeni yetenekleri sağlamak için tasarlanmış yeni bir nesil. Son on yıl içinde boş hücre TXTL roman çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili nicel ve sentetik Biyoloji geniş bir yelpazesi için güçlü bir teknik haline gelmiştir. Yeni TXTL platformlar oluşturmak ve sentetik veya doğal gen devreleri yürütülmesini biyokimyasal sistemlerde sorgulamak özellikle yararlıdır. Vitro TXTL uygun hızla prototip düzenleyici elemanlarının ve biyolojik ağlara de özetlemek için kendinden montajlı mekanizmaları oturma sistemlerinde bulunan moleküler kanıtlamıştır. Bu makalede, tarif biz nasıl bulaşıcı bacteriophages, gibi MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) ve T7 (dsDNA), tamamen kendi genom kullanarak tüm Escherichia coli, TXTL sistem boş hücre bir pot reaksiyonlarda gelen sentez. Üç coliphages sentezi plak tahlil kullanarak sayılabilir. Gösterdiğimiz nasıl sentezlenmiş fajının verim reaksiyonlar biyokimyasal ayarlarına bağlıdır. Moleküler kalabalık, taklit 8000 PEG, kontrollü bir konsantrasyon büyüklükleri emriyle sentezlenmiş phages miktarını etkiler. Biz de phages yükseltmek ve onların genleri arındırmak anlatan. İletişim kuralları ve sonuçları bu çalışmada sunulan bir dizi boş hücre sentetik Biyoloji ve Biyomühendislikte multidisipliner araştırmacılar dahil ilgi olmalıdır.

Biz dört temsilcisi sonuçları göster. Şekil 1' de, biz boş hücre TXTL sistemi ve FAJ DNA stokları yaşam ile kontamine değil olduğunu emin olmak için negatif denetimler kümesi mevcut E. coli hücreleri. Boş hücre TXTL sistem sağlam E. coli ücretsiz olduğundan emin olun hücre kirlenme genomik DNA (şekil 1A veB şekil 1) geçersiz bir iki sigara inkübe ve...

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bu deneyin genel amacı, tamamen E.coli hücre dışı transkripsiyon translasyon sistemi kullanılarak bakteriyofajların genomlarından nasıl sentezlendiğini tanımlamaktır. Bu yöntem, yaşayan sistemlerdeki moleküler kendi kendine montaj mekanizmalarının aydınlatılması gibi sentetik biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, platformun çok yönlülüğüdür.Birçok biyolojik sistem, deneysel analiz için tamamen yeniden oluşturulabilir ve hassas bir şekilde ayarlanabilir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde faj plaklarının hazırlanmasıyla başlayın. Tek bir plağı çıkarmak ve örneklemek için steril bir Pasteur pipetinin ucunu kullanın.Plakları seyreltilmiş hücrelerin içine üfleyin. Ardından 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Tam enfeksiyonu test etmek için, 1,5 mL'lik bir tüpe 500 µL örnek alın ve 10 µL kloroform ekleyin.Karışımı hemen yüksek hızda vorteksleyin ve faji enfeksiyonuna işaret eden çözeltinin berraklaşıp berraklaşmadığını gözlemleyin. Hücreler tamamen enfekte olduktan sonra iki saat daha inkübe edin. Ardından, hücreleri 8, 000 ×g ve dört °C'de santrifüjlemeden önce DNaz ekleyin.Süpernatantı dökün, ardından pelletini 10 milliliters 1X Tris magnezyum klorür içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri liz etmek için 500 microliters kloroform ekleyin ve yüksek hızda vorteksleyin. Dört degrees Celsius'ta, 10 dakika boyunca 12, 000 times g'de santrifüj ederek berraklaştırın.Ardından süpernatantı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Dört adet ultrasentrifüj tüpüne 2,5 mililitre %45 sükroz pipetleyerek dört adet %5'ten %45'e sükroz gradyanı hazırlayın. Tabakanın üzerine, sıvı tüpün kenarından iki milimetre aşağıya ulaşana kadar yaklaşık 2,6 mililitre %5 sükroz ekleyin.Gradyanları, bir gradyan oluşturma cihazı kullanarak 86 derecede ve 23 RPM'de 43 saniye boyunca tüpü eğerek döndürerek karıştırın. Bir mililitrelik pipet kullanarak, pipet ucunu sıvı yüzeyiyle temas ettirip hacmi sakroz gradyanının üstüne çok yavaş bir şekilde dağıtarak 500 µL havuzlanmış faj süspansiyonu ekleyin; hızlı pipetleme yaparak karıştırmamaya dikkat edin. 4 °C'de 20 dakika boyunca 70.000 ×g'de santrifüjleyin.Küt uçlu bir kanülü, ucu faj bandının en üst kenarına merkezlenene kadar çözeltiye daldırın. Faj bandının büyük çoğunluğu alınana kadar şırınga pistonunu çekerek bandı çıkarın. Ardından, süspande edilmiş fajı içeren sakroz hacmini üç veya dört ultrasantrifüj tüpüne ekleyin.Tüpleri, soğuk 1XTM ile tüpün üst kısmından üç ila dört milimetre mesafe kalacak şekilde doldurun. Tüpleri parafin film ile kapatın ve karıştırmak için ters çevirin. Tüpleri tekrar bir ultrasantrifüje yerleştirin ve dört °C'de bir saat boyunca 145,000 ×g hızında santrifüjleyin.Süpernatantı hızla dökün ve tek kullanımlık mendiller üzerinde ters çevirerek süzün. Tüm peletlere 200 ile 400 µL soğuk 1XTM paylaştırın ve dört °C'de gece boyunca yeniden süspanse edin. Çalkalama gerekmemektedir.Titrasyonlar yapılmadan bir gün önce, 10 mililitre LB büyüme ortamında E.coli konak hücre kültürü hazırlayın ve kültürü 250 RPM ve 37 derece Celsius'ye ayarlanmış çalkalamalı bir inkübatörde gece boyunca bekletin. Ardından, 14 mililitrelik bir kültür tüpüne 5,25 mililitre üst agar, 220 mikrolitre seyreltilmiş faj örneği ve 50 mikrolitre konak bakteri hücresi pipetleyerek bir ana karışım hazırlayın. Kültür tüpünün kapağını kapatın ve yüksek hızda vorteksleyin.37 derece Celsius'lik inkübatörden iki kültür plağını çıkarın. Ardından, ilk plağın merkezine 2,5 mililitre master mix yavaşça ekleyin. Master mix'in tüm kültür plağına yayılmasını sağlamak için plağı elinizle nazikçe döndürerek eşit şekilde dağıtın.Üst agarın katılaştığından emin olmak için 20 dakika bekleyin. Plakları 37 °C'de dört ila yedi saat inkübe edin. Plakları sayın ve her bir reaksiyon örneği için faj konsantrasyonunu belirleyin.Faj stokunun bir kısmını, yeni bir 1,5 mililitrelik tüp içerisinde 1XTM tamponu ile 400 µL'ye seyreltin. Seyreltiye eşit hacimde Tris fenol kloroform ekleyin. Karışımı bir laboratuvar sallayıcıda veya elle beş dakika boyunca nazikçe çalkalayın.Ardından, ortaya çıkan emülsiyonu bir masaüstü santrifüjde 17,000 ×g hızında beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Arayüz sınırını bozmamaya dikkat ederek üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Toplamda üç fenol ekstraksiyonu gerçekleştirmek için bu adımları iki kez daha tekrarlayın.Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın ve eşit hacimde kloroform ekleyin. Sulu DNA örneğini temiz bir tüpe aktarmadan önce çalkalayın ve santrifüjleyin. Ardından, 0,4 hacim üç molar sodyum asetat ve üç hacim %95 etanol ekleyin.Tüpü, gece boyunca çöktürme işlemi için -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Masaüstü santrifüjde 10 ila 15 dakika boyunca 17,000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı, dökme veya pipetleme yoluyla uzaklaştırıp atın.Ardından 500 µL %70 etanol ekleyin ve pellet tüpün tabanından ayrılarak serbestçe yüzene kadar tüpü nazikçe çalkalayın. Santrifüj işleminden sonra, pellete zarar vermemeye dikkat ederek etanolü uzaklaştırın ve atın. Daha önce olduğu gibi etanol ekleyip santrifüj yaptıktan sonra, pelletin bozulmamasına yeniden dikkat ederek etanolü ikinci kez uzaklaştırın ve atın.Peleti tezgah üzerinde 30 ila 60 dakika boyunca havada kurutun. Kuruduktan sonra, pelete 50 µL çift distile su ekleyin ve yeniden süspanse etmek için oda sıcaklığında bir saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. DNA konsantrasyonunu 280 nm'deki absorbsiyon ölçümlerini kullanarak belirleyin.Hücreden bağımsız reaksiyonu gerçekleştirmek için, ham ekstraktın belirtilen hacmini (final reaksiyon hacminin %33'ü) bir mikrocentrifuge tüpüne paylaştırın. Metin protokolünde listelenen şekilde master mix'i hazırlayın. Her bir bileşenin uygun hacmini ham ekstraktın üzerine ekleyin.Son bileşen eklendikten sonra, reaksiyonu vorteksleyerek homojen hale getirin. Ardından, master mix'i n adet mikro santrifüj tüpüne paylaştırın. Sonra, değişken bileşenlerin belirtilen hacimlerini master mix dizisine ekleyin.Vortekslemeden önce, istenen son reaksiyon hacmine ulaşmak için her reaksiyona su ekleyin. Ardından mikro santrifüj tüplerini 29 °C'de en az sekiz saat veya gece boyunca inkübe edin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde hücreleri faj titresi için hazırladıktan sonra, bu videoda daha önce gösterildiği gibi hücre içermeyen son reaksiyon LB çözeltisinin titrasyonunu yapın.Burada, phi X 174 fajını sentezleyen hücre dışı bir reaksiyonun temsili sonuçları gösterilmektedir. Bu faj plağı, sayılabilir plakt sayısı ile kanıtlandığı üzere, uygun bir seyreltmede titresi belirlenmiş başarılı bir faj reaksiyonunu göstermektedir. Bununla birlikte, seyreltme faktörü reaksiyonun faj verimi için çok düşükse, başarılı bir reaksiyon yetersiz görünebilir.Bu plaka, sayılamayacak kadar çok plak göstermektedir. Burada, kültür plakası sıcaklığının yetersiz ön-dengelemesi nedeniyle faji plaklarının homojen olmayan dağılımına sahip bir plaka gösterilmiştir. Faj titrasyonu sırasında kültür plakası, plakanın sağ alt kısmındaki reaksiyonu katılaştırmıştır.Moleküler kalabalıklaşma koşulları, phi X 174 ve T7 için faj sentezi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir. Özellikle, PEG konsantrasyonları hacimce ağırlıkça %4'ten %2'ye düştüğünde T7 faj verimi üç büyüklük mertebesinde azalır. Bir kez ustalaşıldığında, fag saflaştırma ve DNA ekstraksiyonu uygun şekilde gerçekleştirilirse iki günde tamamlanabilir. Herhangi bir sorun yaşanmadığında hücre dışı reaksiyon sadece birkaç saat sürer.Bu videoyu izledikten sonra, fajların nasıl büyütüleceği, DNA'larının nasıl ekstrakte edilip saflaştırılacağı ve elde edilen sonucun hücre dışı reaksiyon sistemini kullanarak tam enfeksiyöz fajları yeniden oluşturmak için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Fenol ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir; bu prosedür gerçekleştirilirken laboratuvar önlüğü, göz koruması ve eldiven gibi önlemler alınmalıdır. Fenol içeren açık kaplarla yapılan tüm çalışmalar bir çeker ocak içerisinde gerçekleştirilmelidir.

synthesis-infectious-bacteriophages-an-e-coli-based-cell-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makale bakteriyofaj lambda, enfeksiyon bir floresan etiketli versiyonu hazırlamak için prosedürü...

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Bu makalede, alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru kullanılarak immünofloresan yoluyla dokulardaki izolevuglandinlerin ölçümü için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Hem farelerde hem de insanlarda hipertansiyon modelleri, doku örneklerinde izolevuglandin ölçümü ile ilişkili adım adım prosedürleri ve temel ilkeleri açıklamak için kullanılır.

D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

Bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajlar (fajlar), bağırsak mikrobiyomunun ayrılmaz bir bileşenidir. Bu simbiyotik sakinler bakteriyel zindeliği ve popülasyon dinamiklerini yönlendirse de, bağırsak homeostazını ve hastalığını nasıl etkiledikleri hakkında çok az şey anlaşılmıştır. Bu protokol, diğer faj-bakteri çiftlerine uyarlanabilen bir fare modeli içinde izole edilmiş T4 fajlarını inceler.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

Öğrenin bakteriyofaj sentezi için E. coli hücre dışı transkripsiyon-translasyon sistemini kullanarak moleküler kendi kendine toplanma mekanizmalarını inceleyin. Bu yöntem sentetik biyoloji araştırmalarında biyokimyasal sistemlerin yapılandırılmasına olanak tanır.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Daha fazla video keşfet