Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Bu deneyin genel amacı, bakteriyofajların tamamen E.coli hücresi içermeyen bir transkripsiyon çeviri sistemi kullanılarak genomlarından nasıl sentezlendiğini açıklamaktır. Bu yöntem, canlı sistemlerde moleküler kendi kendine birleşme mekanizmalarının aydınlatılması gibi sentetik biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, platformun çok yönlülüğüdür.

Birçok biyolojik sistem, deneysel analiz için tamamen özetlenebilir ve hassas bir şekilde ayarlanabilir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi faj plaklarının hazırlanması ile başlayın. Steril bir Pasteur pipetinin ucunu çekirdek almak için kullanın ve tek bir plağı çıkarın.

Plakayı seyreltilmiş hücrelere üfleyin. Daha sonra iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tam enfeksiyonu test etmek için, 1.5 mililitrelik bir tüpe 500 mikrolitrelik bir numune alın ve 10 mikrolitre kloroform ekleyin.

Karışımı hemen yüksek hızda girdap haline getirin ve çözeltinin berraklaşıp arınmadığını gözlemleyin, bu da faj enfeksiyonunu gösterir. Hücreler tamamen enfekte olduktan sonra, iki saat daha inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 8.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjlemeden önce DNaz ekleyin.

Süpernatanı atın, ardından peleti 10 mililitre 1X Tris magnezyum klorür içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri parçalamak için 500 mikrolitre kloroform ekleyin ve yüksek hızda girdap yapın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 kez g'de santrifüjleme ile netleştirin.

Daha sonra süpernatanı 15 mililitrelik konik bir tüpe koyun ve dört santigrat derecede saklayın. Dört ultrasantrifüj tüpüne 2,5 mililitre %45 sükroz pipetleyerek dört adet beş ila %45 sükroz gradyanı hazırlayın. Katmanı yaklaşık 2,6 mililitre% 5 sükroz ile doldurun ve sıvı tüpün kenarından iki milimetreye ulaştığında durun.

Degradeleri, 86 derece ve 23 RPM'de 43 saniye boyunca bir gradyan şekillendirme aleti kullanarak eğim tüpü dönüşü ile karıştırın. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, ucu sıvı yüzeyle temas ettirerek ve hacmi çok yavaş bir şekilde sakaroz gradyanının üstüne dağıtarak, hızlı pipetleme yoluyla karıştırmamaya dikkat ederek 500 mikrolitre havuzlanmış faj süspansiyonu ekleyin. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 70.000 kez g'de santrifüjleyin.

Uç faj bandının en üst kenarında ortalanana kadar künt bir kanülü çözeltiye batırın. Faj bandının çoğunluğu çıkarılana kadar şırınga pistonunu çizerek bandı çıkarın. Daha sonra sükroz hacmini askıya alınmış fajla birlikte üç veya dört ultrasantrifüj tüpüne ekleyin.

Tüpleri, tüpün üstünden üç ila dört milimetre arasında soğuk 1XTM ile doldurun. Tüpleri parafin film ile örtün ve karıştırmak için ters çevirin. Tüpleri tekrar bir ultrasantrifüje yerleştirin ve dört santigrat derecede bir saat boyunca 145.000 kez g'de geçirin.

Süpernatanı hızla dökün ve tek kullanımlık mendillerin üzerine baş aşağı boşaltın. 200 ila 400 mikrolitre soğuk 1XTM'yi tüm peletlere bölün ve gece boyunca dört santigrat derecede yeniden askıya alın. Çalkalamaya gerek yoktur.

Titreleri yapmadan bir gün önce, 10 mililitre LB büyüme ortamında bir E.coli konak hücre kültürü hazırlayın ve kültürü gece boyunca 250 RPM ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir çalkalama inkübatöründe bırakın. Daha sonra, 5.25 mililitre üst agar, 220 mikrolitre seyreltilmiş faj örneği ve 50 mikrolitre konakçı bakteri hücresini 14 mililitrelik bir kültür tüpüne pipetleyerek bir ana karışım hazırlayın. Kültür tüpünü kapatın ve yüksek hızda girdap yapın.

37 santigrat derece inkübatörden iki kültür plakası alın. Daha sonra ilk plakanın ortasına yavaşça 2,5 mililitre ana karışım ekleyin. Ana karışımı, tüm kültür plakasını kaplayacak şekilde eşit şekilde dağıtmak için plakayı elle hafifçe döndürün.

Üst agarın katılaşmasını sağlamak için 20 dakika bekleyin. Plakaları 37 santigrat derecede dört ila yedi saat inkübe edin. Plakları sayın ve her reaksiyon örneği için faj konsantrasyonunu belirleyin.

Faj stoğunun bir kısmını 1.5 mililitrelik taze bir tüpte 1XTM tamponu ile 400 mikrolitreye seyreltin. Seyreltmeye eşit hacimde Tris fenol kloroform ekleyin. Karışımı bir laboratuvar külbütöründe veya elle beş dakika boyunca hafifçe çalkalayın.

Daha sonra elde edilen emülsiyonu 17.000 kez g'de bir tezgah üstü santrifüjde beş ila 10 dakika santrifüjleyin. Fazlar arası sınırı bozmamaya dikkat ederek üst sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın. Toplam üç fenol ekstraksiyonu için bu adımları iki kez daha tekrarlayın.

Sulu fazı taze bir tüpe aktarın ve eşit hacimde kloroform ekleyin. Sulu DNA örneğini temiz bir tüpe aktarmadan önce çalkalayın ve santrifüjleyin. Daha sonra, 0.4 hacim üç molar sodyum asetat ve üç hacim% 95 etanol ekleyin.

Gece boyunca yağış için tüpü eksi 20 santigrat derece dondurucuya yerleştirin. Bir tezgah üstü santrifüjde 10 ila 15 dakika boyunca 17.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak veya pipetleyerek çıkarın ve atın.

Daha sonra 500 mikrolitre %70 etanol ekleyin ve pelet tüpün altından serbest kalana kadar tüpü hafifçe sallayın. Santrifüjlemenin ardından, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek etanolü çıkarın ve atın. Etanol ekledikten ve daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, peleti bozmamaya bir kez daha dikkat ederek etanolü ikinci kez çıkarın ve atın.

Peletleri tezgah üzerinde havayla kurutun 30 ila 60 dakika. Kuruduktan sonra, pelete 50 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin ve yeniden süspanse etmek için oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. 280 nanometrede absorpsiyon ölçümlerini kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin.

Hücresiz reaksiyonu gerçekleştirmek için, belirtilen ham ekstrakt hacmini, nihai reaksiyon hacminin% 33'ünü bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Ana karışımı metin protokolünde listelendiği gibi hazırlayın. Ham ekstrakta her bileşenin uygun hacmini ekleyin.

Son bileşeni ekledikten sonra, girdaplama ile reaksiyonu homojenize edin. Daha sonra ana karışımı n mikrosantrifüj tüpüne bölün. Ardından, değişken bileşenlerin belirtilen hacimlerini ana karışım dizisine ekleyin.

Girdaplamadan önce istenen son reaksiyon hacmine ulaşmak için her reaksiyona su ekleyin. Daha sonra mikrosantrifüj tüplerini en az sekiz saat veya gece boyunca 29 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi faj titresi için hazırladıktan sonra, bu videoda daha önce gösterildiği gibi son hücresiz reaksiyon LB çözeltisini titre edin.

Burada gösterilenler, phi X 174 fajını sentezleyen hücresiz bir reaksiyonun temsili sonuçlarıdır. Bu faj plağı, sayılabilir plak sayısı ile açıkça görülen, uygun bir seyreltmede titrelenmiş başarılı bir faj reaksiyonu gösterir. Bununla birlikte, seyreltme faktörü reaksiyonun faj verimi için çok düşükse, başarılı bir reaksiyon kötü görünebilir.

Bu plaka sayılamayacak kadar çok sayıda plak göstermektedir. Burada, kültür plakası sıcaklığının yetersiz ön dengelenmesi nedeniyle faj plaklarının homojen olmayan dağılımına sahip bir plaka gösterilmektedir. Faj titresi sırasında, kültür plakası, plakanın sağ alt kısmındaki reaksiyonu katılaştırdı.

Moleküler kalabalıklaşma koşulları, phi X 174 için faj sentezi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir ve özellikle T7.In, PEG konsantrasyonları hacimce ağırlıkça dört ila %2 arasında düştüğünde, T7 için faj verimi üç büyüklük sırası düşer. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa faj saflaştırması ve DNA ekstraksiyonu iki gün içinde yapılabilir. Hücresiz reaksiyon, herhangi bir sorun olmadığında sadece saatler sürer.

Bu videoyu izledikten sonra, fajın nasıl yetiştirileceğini, DNA'larının nasıl çıkarılacağını ve saflaştırılacağını ve sonucun hücresiz reaksiyon sistemini kullanarak tamamen bulaşıcı fajı yeniden oluşturmak için nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız. Fenol ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve bu prosedür uygulanırken laboratuvar önlüğü, göz koruması ve eldiven gibi önlemler alınmalıdır. Açık fenol kapları ile yapılan tüm çalışmalar bir davlumbazda yapılmalıdır.