Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Bu protokolün genel amacı, homojen insan kaynaklı pluripotent kök hücreler elde etmektir. Bu yöntem, hastalık modellemesi, ilaç taraması dahil olmak üzere birçok amaç için insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri türetmek veya klinik öncesi hücre tedavisi denemeleri için hücre türetmek için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı, sağlam olması ve kullanıcı dostu, Xeno içermeyen ve tamamen kimyasal olarak tanımlanmış bir kültür sisteminde tutulan homojen hücreler üretmesidir.

İnsan iPS hücreleri, donör dokunun genetik arka planını özetlediğinden ve potansiyel olarak hastalıkla ilgili herhangi bir hücre tipine farklılaştırılabildiğinden, tez modellemesi için mükemmel araçlar sağlarlar. Biyopsi diseksiyonu ve koloni toplama karmaşık prosedürlerdir. Bunların deneyimli ellerde yapıldığını görmek, işlemlerin anlaşılmasına yardımcı olur ve tekrarını kolaylaştırır.

Bugünkü prosedürü, Karolinska Enstitüsü'ndeki iPS Çekirdek Tesisi'nden son derece deneyimli iki laboratuvar teknisyeni olan Harriet RonnHolm ve Kelly Day gösterecek. Deri biyopsi örnekleri PBS artı% 1 penisilin streptomisin içinde dört santigrat derecede 48 saate kadar saklanabilir, ancak elde edildikten sonra mümkün olduğunca hızlı işlenmelidir. Biyopsiyi 35 milimetrelik bir tabağa aktarın.

Deri biyopsisini 30 saniye boyunca iki mililitre% 70 etanol ile 35 milimetrelik bir tabağa batırın. 35 milimetrelik yeni bir tabağa %1 penisilin streptomisin takviyeli bir mililitre steril Hank's Balanced Salt Solution ekleyin ve biyopsiyi yeni tabağa aktarın. Biyopsiyi, bir mililitre taze hazırlanmış% 0.1 dispas çözeltisi ile doldurulmuş dört adet 35 milimetrelik bir tabağa aktarın.

Steril cerrahi neşter ve forseps kullanarak, cilt biyopsisini bir ila iki milimetreküp parçaya bölün. Biyopsi parçalarını dispas solüsyonu ile 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve iki mililitre daha dispas ekleyin. 35 milimetrelik kabı bir mililitre dispas solüsyonu ile durulayın ve durulanan solüsyonu 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Biyopsiyi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, biyopsi parçalarıyla birlikte tüpe dört mililitre% 0.1 kollajenaz I ekleyin ve dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin tohumlanmasından otuz dakika önce, DPBS'de bir mililitre% 0.1 jelatin ile altı oyuklu bir doku kültürü plakasında bir kuyu kaplayın.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kollajenaz ile dört saatlik inkübasyondan sonra, sindirilmiş hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve sindirimi iki mililitre fibroblast ortamında yeniden süspanse edin.

Jelatin çözeltisini önceden hazırlanmış altı oyuklu doku kültürü plakasından çıkarın. Kalan doku parçaları da dahil olmak üzere hücre süspansiyonunu altı oyuklu plakaya aktarın. Hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte yüksek nemde inkübe edin.

Fibroblastlar,% 80 birleştiğinde bir T25 doku kültürü şişesine geçmeye hazırdır. İki ila dört pasajdaki fibroblastlar, yeniden programlama verimliliği genellikle düşük pasajlı fibroblastlar için daha yüksek olduğundan, yeniden programlama için idealdir. Hücre kültürü ortamını şişeden aspire edin ve hücreleri bir mililitre DPBS ile yıkayın.

DPBS'yi aspire edin ve bir mililitre% 0.5 Tripsin EDTA ekleyin. 37 santigrat derecede beş dakika veya hücreler ayrılana kadar inkübe edin. İki mililitre fibroblast ortamı ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti iki mililitre fibroblast ortamında yeniden süspanse edin. Bir hematitometre kullanarak fibroblastları saydıktan sonra, tohum 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğunda beş kez 10 ila dördüncü hücreye çarpar.

Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, Sendai virüsü ele alınacağından, uygun kişisel koruyucu ekipmanı kullanırken belirlenmiş bir BSL-2 laboratuvarında işleme devam edin. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 250 mikrolitre Sendai virüsü çözeltisi ekleyin.

Plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Kolonileri toplamadan bir gün önce, LN-521 kaplı 24 oyuklu doku kültürü plakalarını hazırlayın. 250 mikrolitre LN-521 çözeltisini 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna pipetleyin.

Plakayı parafilm kullanarak kapatın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, LN-521 çözeltisini 24 oyuklu plakanın bir kuyusundan aspire edin ve kuyuya 500 mikrolitre E8 ekleyin. Stereo mikroskop altında koloni toplanırken saç filesi ve işlem maskesi kullanılması önerilir.

Koloniler, çapı bir milimetreden daha büyük bir boyuta ulaştıklarında, keskin kenarlar sergilediklerinde ve homojen tek tabakalar halinde büyüdüklerinde toplanmaya hazırdır. Bulanık sınırları ve büyük, kompakt olmayan heterojen hücre kütleleri olan kolonileri seçmeyin. Her koloniyi bir neşterle ızgara benzeri bir düzende daha küçük parçalar halinde kesin.

Hücre tabakalarını tabaktan mekanik olarak sıyırmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve ardından tabakayı daha önce LN-521 ile kaplanmış 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir kuyusuna aktarın. Koloni seçimi bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Birkaç ek koloni toplamak, yeterli sayıda bağlanmayı sağlayacaktır.

E8 ortamını 48 saat boyunca değiştirmeden hücrelerin bağlanmasına izin verin. Koloniler beş milimetreden daha büyük bir boyuta ulaştığında hücreleri enzimatik olarak geçer. Hücre kültürü ortamını hücrelerden aspire edin ve 250 mikrolitre DPBS ile yıkayın.

DPBS'yi aspire edin ve 250 mikrolitre ayrışma reaktifi ekleyin. 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Hücrelerin toplanmaya başladığını gözlemleyin.

Hücreleri ayrışma reaktifi ile durulayarak hücreleri plakadan ayırın. 15 mililitrelik bir tüpe 500 mikrolitre E8 ortamı ekleyin ve hücreleri ve ayrışma reaktifini tüpe aktarın. Üç dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı 15 mililitrelik tüpten aspire edin ve hücre peletini 500 mikrolitre E8 ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hematitometre kullanarak sayın ve 500 mikrolitre oda sıcaklığında E8 ortamı içeren önceden hazırlanmış başka bir LN-521 önceden kaplanmış kuyucuğunda 2,5 ila beş kez 10 ila dördüncü hücrelere tohum atın. ROCK inhibitörünü 10 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu protokolü kullanarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonileri, transdüksiyondan yaklaşık 12. günde transdüksiyon fibroblastlarından ortaya çıkar. Koloniler, transdüksiyondan yaklaşık üç ila dört hafta sonra toplanmaya hazırdı.

Tercih edilen özellikler arasında düzleştirilmiş kompakt hücre kütleleri, homojen tek tabakalar olarak büyüme ve keskin kenarlar bulunur. Bu parlak alan görüntüleri, oldukça heterojen bir hücre hattına kıyasla erken geçişli homojen, tamamen yeniden programlanmış bir insan iPS hücre hattını göstermektedir. Sendai virüsü vektörünün kaybı, üçüncü pasajdaki insan iPS hücrelerinin aksine, 12. pasajda insan iPS hücrelerinde Sendai virüsü vektörüne özgü belirteçlerin yokluğu ile doğrulandı.

Türetilmiş hücrelerin pluripotens belirteçleri OCT4, SSEA-4 ve NANOG için immünositokimya boyaması homojen olarak pozitif bir sonuç verdi. Endojen pluripotens genlerinin mRNA ekspresyonu ters transkriptaz PCR ile gösterildi. Pluripotens faktörlerini ifade etmeyen kısmen yeniden programlanmış hücreleri içeren hücre kültürleri atıldı.

İnsan iPS hücrelerinin farklılaşma potansiyeli, embriyoid cisimciklerinin oluşumu ile değerlendirildi. 21 günlük embriyoid vücut farklılaşmasından sonra gerçek zamanlı PCR, türetilmiş insan iPS hücrelerinin üç germ katmanına farklılaşabildiğini doğrulayan endoderm, mezoderm ve ektoderme özgü belirteçlerin mRNA ekspresyonunu tespit etti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık 16 haftalık bir süre boyunca yaklaşık 22 saatlik uygulamalı süre ile yapılabilir.

Türetilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücreler, araştırma alanınızla ilgili herhangi bir soruyu yanıtlamak için yetişkin insan vücudunun herhangi bir hücre tipine farklılaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, cilt biyopsilerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreleri elde etmek için gerekli adımların nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde anlayacağınızı umuyoruz.