Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla

Bu tekniğin genel amacı, düşük uçuculuğa sahip koku vericileri, elektrofizyolojik kayıt için koku alma reseptör nöronlarına ve drosophila'ya etkili bir şekilde sunmaktır. Bu nöronlar trikoid sensillada bulunur ve uzun zincirli kütiküler feromonlara yanıt verir. Bu yöntem, gelişmiş bir koku verme tekniği sağlayarak böcek feromon iletişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, düşük uçuculukları nedeniyle daha önce erişilemeyen koku maddelerinin in vivo kayıt sırasında etkili bir şekilde sunulmasına izin vermesidir. Spesifik olarak, feromonlar, kur yapan erkekler ve hedef dişiler arasındaki aralığı simüle eden yakın mesafelerden sunulur. AT4 kayıtları için koku dağıtım kartuşu bileşeninin hazırlanması, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun dar ucundan 0,9 santimetre çıkarılmasıyla başlar.

Ardından, ikinci bir pipet ucundan, 1,8 santimetre uzunluk elde etmek için dar uçtan 1,7 santimetre ve geniş uçtan 1,5 santimetre çıkarın. Ardından, 1,8 santimetrelik bölümün ucuna 1/8 inç çapında bir filtre kağıdı diski yerleştirmek için forseps kullanın. Havanın geçebileceği küçük bir açıklık bırakın.

Ardından, hazırlığı hedeflemek için pipet bölümlerini aşağı doğru açılı olarak daha küçük bölümle birlikte sabitleyin. Şimdi koku maddesini filtre kağıdına istenen seyreltmede uygulamak için bir P10 kullanın. Ardından, çözücüyü buharlaştırmak için, yüklü kartuşları bir saat boyunca vakumlu bir desikatörde bekletin.

İlk olarak, bir sinek hazırlama slaydı oluşturun. Bir cam slayt üzerinde, slayt ve kapak lamı arasında yaklaşık üç derecelik bir açı oluşturmak için modelleme kili ile bir cam kapak fişi takın. Ardından, kapak kaymasının iç kenarı ve kapak kaymasının hemen altındaki sürgü olmak üzere iki yere çift taraflı bant takın.

Daima yeni bant kullanın. Şimdi bir aspiratör tüpünde ilgilenilen sineği toplayın. Daha sonra tüpün ucuna 200 mikrolitrelik bir pipet ucu yerleştirin ve sineği pipet ucunun ucuna itmek için üfleme sırasında aynı anda tüpü hafifçe vurun.

Ardından, sineğin gövdesinin hemen altındaki ucu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Şimdi, sineğin kafasını daha küçük açıklığa zorlamak için kalıplama kilini ucun geniş ucuna dikkatlice yükleyin. Her iki anten de açığa çıktığında, kil ile paketlemeyi bırakın.

Şimdi hazırlığı slaytın üzerine yerleştirmek için forseps kullanın. Clipeus'u, antenin yan tarafı bantlanmış kapak kayma yüzeyine gelecek şekilde yatay olarak bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, anteni banda sabitlemek için tutma çubuğunu arista'nın üzerine yerleştirin.

Ardından, hazırlığı teçhizatın sahnesine yerleştirin. Trikoidlerin, antenin üçüncü segmentinin distal lateral kenarı boyunca görünür olduğunu onaylayın. Sensilla, arka plana karşı net bir şekilde siluet haline getirilmelidir.

Hazırlığı, yaklaşık iki santimetre mesafeden ayrı bir tüp aracılığıyla sağlanan sabit bir nemlendirilmiş hava akışı altında tutun. Kayıt almak için referans elektrodu hızlı ve yumuşak bir hareketle klipse yerleştirin. Hemolenf ile temas edeceği kütikülün hemen altına yerleştirin.

Ardından, kayıt elektrodunu hedef sensillum ile aynı görüş düzlemine girene kadar yavaşça indirin. Ardından kayıt elektrodunu hassas tabana yerleştirin. Devam etmeden önce, AT4-A ve AT4-C nöronlarından tanımlanabilir ani artışlarla yüksek bir sinyal-gürültü oranı olduğundan emin olun.

AT4-A nöronları 20 hertz'den daha hızlı ateşlenmemelidir. Şimdi kartuşu koku verici dağıtım tüpüne bağlayın. Solvent kontrolü ile başlayın ve en yüksek koku konsantrasyonuna doğru ilerleyin.

Bu durumda, bir palmitoleik asit kartuşu takılır. Ardından, kartuşu kafaya doğrultarak hazırlığa doğru manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın. Kartuş ucunu yaklaşık dört milimetre mesafeden doğrudan antene bakacak şekilde konumlandırın.

Kartuş ayrıca sürgünün yaklaşık bir milimetre üzerinde olmalıdır. Kartuşun hazırlığa göre hassas bir şekilde konumlandırılması, bu prosedürün en kritik adımıdır. Tutarlı nöronal tepkiler, denemeler boyunca kartuşun tekrarlanabilir konumuna bağlıdır.

Kartuş, elektrotlar ve sürgü ile yakından sınırlanmış olabilir. İdeal olarak her iki elektrottan da en az dört milimetre uzakta olmalıdır. Stimülasyon için, koku akış kontrol cihazını 500 milisaniyelik patlamalara ayarlayın ve dakikada 500 mililitrelik bir akış hızı kullanın.

Her uyaran patlaması için, elektriksel aktiviteyi 10 saniye boyunca kaydedin. Bir koku verici uygulamasından sonra, bir sonraki en yüksek konsantrasyonu içeren bir kartuşla değiştirmeden önce kartuşu dikkatlice geri çekin. Gün boyunca tüm kayıtları aldıktan sonra, kayıt elektrodunu damıtılmış suyla iyice durulayın.

Yedi günlük erkek Berlin yabani tip sinekleri üzerinde tarif edilen yöntemler kullanılarak, trans ve cis palmitoleik asidin nispi etkinliği karşılaştırıldı. Trans-palmitoleik, Or47b koku alma reseptör nöronlarının daha güçlü bir uyarıcısıydı. Her sinekten sadece tek bir nöron kaydedildi.

Koku kartuşunun açılması ile sineğin başı arasındaki mesafe, nöronal tepkiler üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Dört milimetrede, palmitoleik aside yanıt olarak ateşlenen çok daha fazla sivri uç vardı. 11 milimetrelik bir mesafede, O47b nöronları tarafından neredeyse hiç gözlemlenebilir yanıt yoktu.

Palmitoleik asidin yakın mesafeden sunumu, bir koku verici olarak etkilerini incelemek için oldukça önemliydi. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo single sensillum kaydı sırasında palmitoleik asit veya diğer düşük uçuculuklu koku maddelerini drosophila koku alma reseptörü nöronlarınıza nasıl sunacağınızı net bir şekilde anlayacağınızı umuyoruz. Bu tekniğe hakim olduktan sonra, tek bir sinekten tüm dozaj eğrisinin kaydedilmesi yaklaşık 20 dakika içinde elde edilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, böcek koku alma alanındaki araştırmacıların feromon tespiti için nörofizyolojiyi ve sinyal iletim mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açtı.