Name: Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Keşfedin, düşük uçuculukta feromonları Drosophila trikoid sensillasındaki koku alma reseptör nöronlarına elektrofizyolojik kayıt için nasıl sunulur. Bu yöntem, böcek feromon iletişiminin nörofizyolojisini in vivo ortamda araştırmayı mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Resimlerle ilgili yardım için örnek eserleri ve Tin Ki Tsang&#39;a yardım için Ye Zhang&#39;a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ray Thomas Edwards Vakfı Erken Kariyer Ödülü ve JWW&#39;ye verilen C.-YS ve NIH hibelerine (R01DC009597 ve R01DK092640) NIH hibe (R01DC015519) tarafından desteklendi.

1.4 Kayıt için Donanımın Hazırlanması <ol><li> Alüminosilikat cam kapiller (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm) ile elektrotlar hazırlamak için bir pipet çekme aletini kullanın. Sineğin sivri içine sokmayı kolaylaştırmak için referans elektrodun ucunu hafifçe bir çift forsepsle hafifçe kıvırın ( ör . Sinek başının önünde, ağız parçalarının üzerinde yuvarlak bir plaka). NOT: Bu çalışmada 7 günlük WT erkekleri (Berlin) kullanıldı. Her iki elektrot için elektrolit olarak AHL tuzlu su çözeltisi 14 kullanın. </li><li> NaCI 6,312 g, KCI 0.373 g, NaHCO 3 0.337 g damıtılmış su 900 mL karıştırılmasıyla AHL 1 L hazırlayın, NaH2? 4, Trehaloz ּ 2H 2 O 1.892 g 0,1120 g, sükroz 3,423 g HEPES 1.192 gr, ve 1 M MgCl2 8.2 ml&#39;si. Damıtılmış su kullanarak toplam hacmi 1 L&#39;ye getirin. 1 N NaOH kullanarak pH&#39;ı 7.4&#39;e getirin ve çözeltiyi bir a ile sterilize edinVakumla çalışan filtre sistemi. Uzun süreli saklama için AHL alikotları 4 ° C&#39;de tutun. NOT: Tutarlı palmitoleik asit salınımı, kartuşlar arasındaki tekdüzeliğe bağlıdır. Her kartuşun tekrarlanabilir bir şekilde monte edilmesi kritik önem taşır. </li><li> Bir tıraş bıçağı kullanarak, 200 ml&#39;lik pipet ucunun ucundan 0,9 cm çıkarıp, ilk kartuş bölümünü oluşturun, 4,1 cm ölçün; Şekil 1A&#39;da ayrıntılı olarak verilen boyutlara bakın. Başka bir 200 mcL pipet ucu kullanın ve 1,8 cm ( Şekil 1A ) ikinci kartuş bölümü oluşturmak için, sırasıyla ucu ve tabandan 1,7 cm ve 1,5 cm kaldırın. Tekrarlanabilir olmasını sağlamak için bir cetvel kullanın. </li><li> Diskleri filtre kağıdından kesmek için ¼ &quot;delik açıcı kullanın. </li><li> İkinci kartuş bölümünün ucuna bir filtre kağıdı diski yerleştirmek için forseps kullanın. Kartuş ucunda hava yoluyla geçebileceği bir açıklık olduğunu görsel olarak teyit edin. </li><li> Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, birinci ve ikinci kartuş bölümlerini bir arada tutturun. İkinci kartuş bölümünü ön hazırlığa doğru kare oluşturmak için aşağı doğru eğin ( Şekil 1B ). </li><li> Kartuşu bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş koku iletme tüpüyle bağlayın. NOT: Bu tasarım kartuşun değiştirmeyi kolaylaştırmak için dışa doğru döndürülmesini sağlar ( Şekil 1C ). </li><li> Bir kütle kontrolöründe sabit nemlendirilmiş hava akışını 2 L / dk olarak ayarlayın ve odorant akışı başka bir kütle kontrolöründe 500 mL / dakika&#39;a ayarlayın. </li><li> Yazılımı kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın), 500 ms&#39;lik bir koku püskürtmeyi yönetmek için prosedürü programlayın. </li></ol> 2. Teslimat İçin Palmitoleik Asit Odorant Çözümlerinin Hazırlanması NOT: Or47b ORNs hem cis- hem de trans- palmitoleik aside tepki verir. Palmitoleik asit R&#39;de kararsız olduğu içinT, stoklar -20 ° C&#39;de saklanır ve açıldıktan sonra bir ay içinde kullanılır. Etanol, palmitoleik asit için tercih edilen çözücüdür. <ol><li> 1.7 mL mikro tüplerde on kat seri dilüsyonlar için 10 uL cis- veya trans- palmitoleik asit stoğu veya dilüsyonları 90 uL% 100 etanol ile iyice karıştırmak için bir girdap mikseri kullanın. Deneylerden önce günlük taze palmitoleik asit seyreltileri hazırlayın ve bir gün içinde kullanın. NOT: Etanolde çözünmeyen koku maddeleri için, diğer organik çözücülerle koku giderme hazırlamak için cam şişe kullanılması önerilir. </li><li> Bir P10 mikropipet kullanarak, ilgili her kartuştaki filtre kağıdına istenen dilüsyonların 5 μL cis- palmitoleik asit solüsyonları uygulayın. NOT: En yüksek dozaj miktarı (10 -1 ) bileşikten 450 μg içerir. Trans- palmitoleik asit solüsyonları için bunun yerine en yüksek dozajın (10 -1 ) 450 μg t içermesi için 4.5 μL uygulayınO bileşik. </li><li> Çözücüyü tamamen buharlaştırmak için, palmitoleik asit kartuşlarını bir vakum desikatörde oda sıcaklığında 1 saat ve basınç olarak 7.59 mmHg yerleştirin. NOT: Kartuşlar oda sıcaklığında 4 saate kadar kullanılabilir. </li></ol> 3. İn vivo Elektrofizyolojik Kayıtlar için at4 Sensilla&#39;ya Hazır Erişim için Drosophila&#39;nın Hazırlanması NOT: WT sinekleri (Berlin) standart mısır mezesi ortamında 25 ° C&#39;de 12:12 açık karanlık döngüde yetiştirilir. Ekillenme üzerine, sinekler cinsiyete göre onlu gruplara ayrılırlar; böylece gruplar 7 yaşına kadar gruplandırılırlar. Or47b erkek ve dişi sineklerde ORNs, palmitoleik aside tepki verir. Basitlik amacıyla, yalnızca erkek sinekler mevcut çalışmada incelenmektedir. <ol><li> Bir sinek hazırlama slaydı oluşturun: cam slaytta, cam slaytla ~ 3 ° açı oluşturan küçük bir modelleme kilinin üzerine bir cam lamel yerleştirin (18 x 18 mm 2 ). İç tarafa çift taraflı bant yerleştirinDg lamel ve hemen altındaki slayt alanı. Her kayıt günü için yeni bantla değiştirin ( Şekil 2A ). </li><li> Boru içinde ilgi sinek toplamak için bir sinek aspiratör 15 kullanın ve daha sonra boru sonuna 200 mcL pipet uç takın. Aynı anda pipet ucunun sonuna kadar sinek itmek için tüp içine hava üfleme sırasında tüp ileri hareket. Sinek gövdesinin hemen altında ve sinek üzerinde 2 baş uzunluğunda kesmek için traş bıçağı kullanın. </li><li> Pipet ucunun altını modelleme kili ile sıkıştırın, hem havadaki hem de antenler açık kalana kadar yukarı doğru itin ( Şekil 2B ). Sinek öldürmekten kaçınmak için, sineklerin karnının ezilmesine engel olduğu için, antenleri ve aristeleri ortaya çıkarmak için yalnızca yeterli kil ilave edin. Ayrıca, ani bir daralmayı önlemek için kil yavaş yavaş ve nazikçe ekleyin. Sinekin canlı olup olmadığını antennal&#39;ı kontrol ederek doğrulayın.Veya hortum hareketi. </li><li> Sineği barındıran pipet ucunu manevra yapmak için forseps kullanın. Kafanın gözlemcinin sağında olacağı şekilde başın yönünü ayarlayın. Antenin yan tarafı bantlanmış örtücü yüzeye ( Şekil 2B ) dayanıncaya kadar ince forseps kullanarak lamel boyunca hazırlıkları yapın. </li><li> Hareketi önlemek için antenin çift taraflı banda sabitlenmesi için tutucu çubuğu arista üzerine yerleştirin ( Şekil 2B ). NOT: Tutucu çubuk borosilikat cam kapilerden bir pipet çekici ile çekilir ve modelleme kili ile konumunda tutulur ( Şekil 2A ). </li><li> Hazneyi teçhizatın sahnesine yerleştirin ( Şekil 2C ). Mikroskopu kullanarak, trikoidlerin antenin üçüncü bölümünün distal-yanal kenarı boyunca görünür olduğunu teyit edin. NOT: İdeal olarak, sensilla, arka plana karşı açıkça siluetlenmelidir;<html> Kayıt etmeyi kolaylaştırır ( Şekil 3 ). Bu hazırlıkta erişilebilir trichoid sensürün çoğunluğu at4 tipindedir. </li><li> Hazırlık 2 , 15&#39;te tarif edildiği gibi, hazneden yaklaşık 2 cm uzaktaki ayrı bir hava besleme tüpü aracılığıyla verilen nemlendirilmiş hava akışının (2 L / dak.) Hazırlanmasını sağlayın ( Şekil 4 ). </li></ol> 4. Palmitoleik Asit&#39;e Yanıt Vermek İçin AT4 Trikoidlerde Or47b ORN&#39;lerinden At4 Sensillum Aktivitesinin Kaydedilmesi <ol><li> Referans elektrodu cıvataya sokun ( Şekil 3A ). Doku hasarını önlemek için, elektrotun, kütikül altındaki hemolimfe temas edebileceği yüzeyin hemen altına, hızlı ve düzgün bir hareketle yerleştirildiğinden emin olun. </li><li> Kayıt elektrodunu, hedef sensillum ile aynı görüş alanına girene kadar yavaş yavaş indirin (= &quot;Xfig&quot;&gt; Şekil 3B). 50X objektif lens altında kaydedin. NOT: Sert trikoidal kütikül, kayıt elektrodunun, daha geniş olan alanı, elektrotun dışarıya sapma ihtimalini azaltan daha büyük bir hedef sağlayan sensil tabana yerleştirilmesini gerektirir ( Şekil 3B , yerleştirme). </li><li> Bir duyarlığa koku uyarılarını uygulamadan önce, aşağıdaki seçim kriterlerine uyun; Bu standartları karşılamayan herhangi bir trikoid reddedilmeli ve bunun yerine bir başka sensillum seçilmelidir. <ol><li> Yüksek bir sinyal-gürültü oranına dikkat edin (bir örnek için Şekil 3C&#39;ye bakın). </li><li> At4A ve at4C nöronlarından belirlenebilir sivri gözlemleyin ( Şekil 3C ). Not: at4B başak genliği at4A 10&#39;a çok benzemektedir ve koku uyarımı olmadan kolayca tanımlanamaz. </li><li> At4A nöronlarının bazal ateşleme hızının20 Hz civarında veya altında. NOT: nöron için bazal ateşleme hızı basiconic ORNs 2 daha yüksek olduğu için bu kriter at4A özeldir. Çok daha yüksek bazal bir ateşlenme, elektrot yerleştirilmesi sırasında nöronların hasar görmüş olabileceğini gösterir. </li></ol></li><li> Kartuşu koku giderme borusuna bağlayın. Solvent kontrolü ile başlayın ve daha sonra düşük konsantrasyonlardan yüksek konsantrasyona kadar olan lokantaları kullanın. Kartuşu hazneye doğru manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın ve kartuşu hazırlığın başında kare şeklinde tutun. Kartuşun doğrudan birkaç milimetreden itibaren antene ( Şekil 4 ) işaret ettiğini görsel olarak teyit edin. NOT: Amaç, kartuşun açılmasını direkt olarak antende yönlendirmek ve hedef dokuya çok yakın konumlandırmaktır. </li><li> Odorant kartuşunun kayıt elektrodundan sağa 1 - 2 mm ve sinek önünden ayrıldığından emin olunP aşağıya yaklaşık 1 mm kaydırın. NOT: Burada açıklanan kurulumda, odorant kartuşu kayıt elektrodu, referans elektrotu ve slayt hazırlama slaydı ile yakından sınırlanmıştır ( Şekil 4 ). NOT: Kartuş ile kayıt / referans elektrotları arasındaki mesafeye dikkat edin. Yaklaşık 4 mm&#39;lik bir mesafe önerilir 1 . Kasıtsız temas, sinyali sonlandırabilir ve kayıt elektrotunun ucunu kırabilir, mevcut nörona zarar verebilir ve sonraki kayıtları zorlaştırabilir. NOT: Kartuşu ve hazır önlü slayt arasındaki mesafeyi göz önünde bulundurun. Lamelliğe dokunulduğunda, kaydı kesmek için kayıt elektrodunu yerinden oynatabilir. </li><li> Kaydı başlatmak için veri toplama yazılımındaki &quot;Kaydet&quot; düğmesine basın. NOT: Her 10 saniyelik kayıt için, 1.9. Adımda anlatıldığı gibi tek bir 500 ms koku kaynağı doğrudan antene gönderilir. </li><li> Odorant uygulamasından sonra,Kartuşu bir sonraki en yüksek yoğunluğa sahip bir kartuşla değiştirmeden önce dikkatlice geri çekin. Tüm dozaj aralığı elde edilinceye kadar devam edin. NOT: Uyumun muhtemel etkilerinden kaçınmak için, her sineğin tek bir Or47b ORN kaydettirilmesi önerilir. </li><li> Gün kayıt işlemini tamamladıktan sonra kayıt elektrodunu damıtılmış su ile iyice yıkayın. </li><li> Piyasada bulunan çevrimdışı analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin ve çizin. </li></ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada Or47b ORN&#39;lerin palmitoleik aside verdiği yanıtların sağlam bir şekilde indükte edilebildiği ve kaydedilebildiği bir prosedürü açıkladık. Yetersiz feromon odorant verme sorununu gidermek için 2 , 7 , 10 numaralı geleneksel uzun mesafe koku alma yöntemini değiştirdik. Bileşimi, açılışları hazırlığın milimetre içinde konumlandırılmış olan odorant kartuşları vasıtasıyla dağıtarak düşük odorant volatilite sorununu ele al...

<html> Drosophila ORNs, geniş çapta karbon zinciri uzunlukları ve esterler, alkoller, ketonlar, laktonlar, aldehitler, terpenler, organik asitler, aminler, kükürt bileşikleri, heterosiklikler ve aromatikler dahil olmak üzere çeşitli işlevsel gruplarla çok sayıda kokuya tepki verirler 2 , 3 . Fizikokimyasal özelliklerinde çeşitlilik gösteren koku maddeleri, bileşiğin buhar basıncı ile belirtilen belirgin derecede farklı uçuculuklara sahip olabilirler. Özellikle, Drosophila melanogaster için biyolojik açıdan önemli olan odorantlar, uçuculuklarında muazzam farklılıklar göstermektedir. Örneğin, Ir92a ORNs 20 ° C&#39;de 6.432 mmHg buhar basıncı ile yüksek oranda uçucu olan amonyak 4&#39;e tepki verir. Buna karşılık Or67d ORN&#39;leri 20 ° C&#39;de 43 mmHg buhar basıncı olan bir erkek feromon cis- vekseten asetat ( c VA) 5 , 6&#39;ya cevap verir. Düşük uçuculuktaki odorantlara karşı olfactory yanıtını incelemek, odorantların bir taşıyıcı hava akımı yoluyla nispeten uzun bir mesafe boyunca ( yani, birkaç santimetre) iletildiği klasik koku iletme yöntemleri ile özellikle zordur.Böylece, bildirilen koku yanıtları Koku giderme sisteminin tasarımına bağlı olarak, büyük oranda değişiklik gösterebilir Örneğin Or67d ORN&#39;lerin yüksek bir c VA dozuna karşılık gelen yanıt, ~ 40 7 -&gt; 200 çarpı / s 6 aralığındadır Ayrıca c VA&#39;nın konvansiyonel verme yöntemleri ile etkisiz hale getirilmesi büyük olasılıkla sahte negatif sonuçlara neden olmakta ve bu da c VA&#39;nın Or67d ORN&#39;leri 8 harekete geçirmek için yeterli olmadığını yorumlamasına yol açmaktadır. Yakın menzilli koku iletme yöntemi 9. Bu nedenle imperaDüşük uçuculukta koku veren maddelerin etkin bir şekilde sunumu için sağlam bir koku iletim sistemi geliştirmek. Son zamanlarda, Or47b ORN&#39;ler için ligandlar olarak birkaç uzun zincirli kekiküler yağ asitleri tespit ettik. Tip 4 Antenn Trichoid Sensillum&#39;da (at4) yer alırlar. Uzun zincirli yağlı asit koku arasında, Or47b ORNs 1 etkinleştirerek erkek kur teşvik afrodizyak feromon olarak bu palmitoleik asit fonksiyonları bulundu. Bununla birlikte, geleneksel koku iletim yöntemini kullanan başka bir çalışmada, metil lauratın Or47b ORN&#39;lerinden yanıtlar çıkardığı gösterilirken, palmitoleik asit, aynı mesafeden 10 sunulduğunda tepki vermedi. VA C ile kıyaslandığında, uzun zincirli yağ asitleri, 25 ° C&#39;de 11 dan daha az 0,001 mm Hg buhar basınçları ile, daha az uçucu olan. Uzun zincirli yağlı asit odorantlarının doğal olarak düşük uçuculuğu, antene etkili sunumun önünü engeller;Geleneksel koku giderme sistemleri, muhtemelen sahte negatif sonuçlardan sorumluydu 10 . Bu tutarsızlık, düşük uçuculukta olan odorantları sunarken geleneksel koku iletim sistemlerinin yetersizliğini vurgular. Daha önce sinek cuticular kokuların etkili teslim koku kaynağı ve hedef dokuya 6 arasındaki yakınlığı gerektirdiğini gösterilmiştir. Bu nedenle, 12 , 13 doğadaki meyve sinekleri tarafından muhtemelen karşılaşılan mesafeyi taklit ederek biyolojik olarak aktif feromonların etkilerini tam olarak karakterize etmek için prosedürümüzde minimum mesafeye öncelik verilmesi gerektiği konusunda anlaşmıştık. Metodumuz, standart elektrofizyoloji teçhizatları ve teknikleriyle uyumluluk da dahil olmak üzere diğer avantajları barındırır. Mevcut teçhizat kurulumları, bu protokolü barındırabilmek için minimal modifikasyon gerektirir ve çoğu SSR basamağı küçük ayarlamalar gerektirir. BuTekniğini SSR&#39;de deneyimli araştırmacılar tarafından kolayca erişilebilir kılmaktadır. Ayrıca, tekniğimiz, uyaran iletimini nöronal yanıt ile ilişkilendirerek keskin başlangıçlı ve ofsetli düşük volatiliteli odorantların sunumuna izin verir. Sonunda, donanım yerleşimi, odorant kartuşları arasında hızlı alışveriş yapılmasını kolaylaştırarak, istenen bir doz aralığında veri toplamanın hızlandırılmasını sağlar. Başvuru ve kayıt elektrotlarının, Yetişkin Hemolimf-Benzeri (AHL) çözeltinin, koku iletici kartuşların ve ilgili olfaktometre hazırlığının incelenmesi ile başlayacağız. Ardından, palmitoleik asit odorant solüsyonlarının hazırlanmasını ve ardından kayıt için sineğin hazırlanmasını tartışırız. Bu yöntemi kullanarak elde edilen temsili verileri sunmadan önce, odorant kartuşunun konumunu daha yakından kaydetmek ve daha yakından incelemek için trichoid sensillum seçme kriterlerini dikkate almaya devam ediyoruz. Son olarak, bu tekniğin faydalı uygulamaları keşfederek sonuçlandırıyoruzUe, bazı karşılaşılan sorunlar ve çözümleri.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hazırlık Kurulumu ve Çeşitli Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Çektirme Aleti&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipet Çektirme</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam Kılcal Damarlar</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>tutma çubukları yapmak için</td></tr><tr><td>Alüminosilikat Cam Kılcal Damarlar&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA ABD</td><td>AF100-64-10</td><td>elektrotlar yapmak için</td></tr><tr><td>Superfrost Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific Pittsburgh PA ABD</td><td>12-550-143</td><td>sinek hazırlama istasyonu için</td></tr><tr><td>Kalıcı Çift Taraflı Bant</td><td>Scotch St. Paul MN ABD</td><td>NA</td><td>sinek hazırlama istasyonu için</td></tr><tr><td>Dik mikroskop</td><td>Olympus Shinjuku Tokyo Japonya</td><td>BX51</td><td>kayıt teçhizatı</td></tr><tr><td>için Plastalina modelleme kili</td><td>Van Aken North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>hazırlık istasyonu için ve tutma çubuğunu stabilize etmek için</td></tr><tr><td>SFCA Membranlı Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Ünitesi, 0.45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY ABD</td> <td># 156-4045</td><td>AHL çözeltisini sterilize etmek için</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kartuş Malzemeleri</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; < / Güçlü></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ve mikro; L pipet ucu&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>koku kartuşları yapmak ve sinek hazırlamak için</td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>koku kartuşları yapmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Vakum Kurutucu ve nbsp;</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL ABD</td><td>VX-06514-30</td><td>etanol çözücüyü buharlaştırmak için</td></tr><tr><td><güçlü>Adı</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Odorant Materials</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleik asit</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI ABD</td> <td># 10009871 (CAS # 373-49-9)</td> <td>Or47b kokulu</td></tr><tr><td>trans-palmitoleik asit</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI ABD</td> <td># 9001798 (CAS # 10030-73-6)</td> <td>Or47b kokulu</td></tr><tr><td>Etanol Spektrum Kimyasal</td><td>MFG. &nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>palmitoleik asidi seyreltmek için&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Rig Kurulum Malzemeleri</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kokulu Kartuş Mikromanipülatörü</td><td>Siskiyou </td>, <td>olfaktometre Flow Vision yazılımını konumlandırmak için</td>Pass VEYA USA <td>MX130R</td> verir</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>yazılımı akış hızını kontrol etmek için</td></tr><tr><td>Kütle Kontrol Cihazı</td><td>Alicat Tuscon AZ ABD</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>Nemlendirilmiş hava akış hızını kontrol etmek için</td></tr><tr><td>Kütle Kontrol Cihazı</td><td>Alicat Tuscon AZ ABD</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>Koku stimülasyonu için akış hızını kontrol etmek için</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Moleküler Cihazlar Sunnyvale CA ABD</td><td>Ver. 10.4</td><td>Veri toplama yazılımı</td></tr><tr><td>Hava dağıtım tüpü Ace</td><td>Glass Vineland NJ ABD</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>Nemlendirilmiş hava sağlamak için</td></tr><tr><td>50X objektif lens&nbsp;</td><td>Olympus Shinjuku Tokyo Japonya</td><td>LMPLFL50X</td><td>kayıt donanımı</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA</td><td>USA Ver. 10.4</td><td>spike analizi için yazılım&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego VEYA USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>veri analizi yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Ses Monitörü</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY ABD</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>İşitsel olarak bireysel sivri uçları bildirir</td></tr><tr><td>Hücre Dışı Amplifikatör</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY ABD</td><td>NPIEXT-02F</td><td>elektrik sinyallerinin genliğini artırmak için</td></tr><tr><td>Valf Kontrol Cihazı</td><td>Warner Instruments&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Koku stimülasyonu için valfin açılmasını kontrol etmek için</td> <td>VC-8</td></tr><tr><td>Kayıt Elektrodu Mikromanipülatör</td><td>Sutter Instruments Novato CA ABD</td><td>MP-285</td><td>kayıt elektrodunu konumlandırmak için</td></tr><tr><td>Headstage Amplifikatör</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY ABD</td><td>EQ-16.0008</td><td>elektrik sinyallerinin genliğini artırmak için</td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Tektronix Beaverton VEYA ABD</td><td>TDS2000C</td><td>Bireysel ani artışların görsel raporu</td></tr></tbody></table>

elektrofizyolojik kayıt<em&gt; drosophila</em&gt; düşük volatilite kokularına karşı trikoid sensilla

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Böcekler, yiyecek arayışı, yırtıcılardan kaçınma, yumurta akı sağlığı ve çiftleşme gibi hayatta kalmaları için kritik olan geniş bir davranış yelpazesini yönlendirmek için koku duygularına güvenirler. Değişen uçuculuktaki sayısız kimyasal, böcek Koku Alıcısı Nöronlarını (ORNs) aktive eden doğal odorantlar olarak tanımlandı. Bununla birlikte, düşük uçuculuktan etkilenen odorantlara karşı olfaktör tepkiler üzerinde çalışmak, bu tür uyarıcı maddeleri geleneksel koku giderme yöntemlerini kullanarak etkin bir şekilde sunamamasından dolayı engellenmiştir. Burada, in - vivo Tek-Sensillum Kayıt (SSR) için düşük uçuculukta olan odorantların etkili bir şekilde sunumuna izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Koku kaynağı ile hedef doku arasındaki mesafeyi en aza indirerek, bu yöntem, palmitoleik asit, kur ve çiftleşme davranışı 1 &#39;de yer ORNs üzerinde gösterilen etkisi olan bir uyarıcı feromon içeren biyolojik olarak çıkıntı ama şimdiye kadar ulaşılamayan koku, uygulama için izin verir.Prosedürümüz böcek kokusu ve feromon iletişimi için düşük volatiliteli bir odorantı test etmek için yeni bir yol sağlar.

Tekniği, palmitoleik asidin cis ( Şekil 5B ) izomerlerine karşı trans ( Şekil 5A ) nispi etkinliğini belirlemek için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Temsilcili verilerimiz, trans- palmitoleik asidin, cis izoformuyla karşılaştırıldığında Or47b ORN&#39;ler için daha etkili bir ligandı olduğunu göstermektedir ( Şekil 5C ). Her sinekten, toplam 24 sinek için, doza...

Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Bu tekniğin genel amacı, düşük uçuculuğa sahip koku vericileri, elektrofizyolojik kayıt için koku alma reseptör nöronlarına ve drosophila'ya etkili bir şekilde sunmaktır. Bu nöronlar trikoid sensillada bulunur ve uzun zincirli kütiküler feromonlara yanıt verir. Bu yöntem, gelişmiş bir koku verme tekniği sağlayarak böcek feromon iletişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, düşük uçuculukları nedeniyle daha önce erişilemeyen koku maddelerinin in vivo kayıt sırasında etkili bir şekilde sunulmasına izin vermesidir. Spesifik olarak, feromonlar, kur yapan erkekler ve hedef dişiler arasındaki aralığı simüle eden yakın mesafelerden sunulur. AT4 kayıtları için koku dağıtım kartuşu bileşeninin hazırlanması, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun dar ucundan 0,9 santimetre çıkarılmasıyla başlar.Ardından, ikinci bir pipet ucundan, 1,8 santimetre uzunluk elde etmek için dar uçtan 1,7 santimetre ve geniş uçtan 1,5 santimetre çıkarın. Ardından, 1,8 santimetrelik bölümün ucuna 1/8 inç çapında bir filtre kağıdı diski yerleştirmek için forseps kullanın. Havanın geçebileceği küçük bir açıklık bırakın.Ardından, hazırlığı hedeflemek için pipet bölümlerin

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Koku için koku alma duyu nöronlarının elektrofizyolojik yanıtlar tek sensillum kayıtları kullanarak böcekleri ölçülebilir. Bu video makalede, sirke sineği antenler tek sensillum kayıtları nasıl gerçekleştirileceği gösterecektir...

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

Böcek koku alma sistemleri electroantennograms (EAG) ve anteni bulunan tüm odorant reseptör nöronları (ORNs) ve bireysel ev sahipliği bu yanıtları toplanır tek sensillum kayıtları (SSR), formları kayıt odorant indüklenen yanıtları için eşsiz fırsatlar sunmaya sırasıyla sensilla.

Güve Koku Sistemi Elektrofizyolojik Ölçümler

Biz yaşam antennal lobda koku uyarılmış kalsiyum yanıtları ölçmek ve analiz etmek için kurulmuş bir tekniği...

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Bu videoda, canlı bir Drosophila sineği elektrofizyolojik çalışmalar için bir tüpe monte edilmiştir. Elektrotlar, sineğin koku alma reseptör nöronları ile feromonlara spesifik nöronal tepkileri kaydetmek için sensillumun tabanına yerleştirilir.

Drosophila Sensilla'dan Uçucu Koku Maddelerine Yanıt Olarak Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu protokol Drosophila labellar tat nöronlar tarafından ateş aksiyon potansiyel yanıtları hücre dışı kayıt açıklar.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Sensilla Taste

Drosophila'nın ön ayakları ve hortumu, tat alma duyusal nöronlarının zengin bir repertuarını içerir. Burada, canlı sineklerin ön bacak ve hortumundaki duyusal nöronlardan gelen fizyolojik tepkileri ölçmek için kalsiyum görüntüleme kullanan bir yöntem sunuyoruz.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Otomatik izleme sistemi Flywalk Drosophila melanogaster koku güdümlü davranış yüksek çözünürlüklü ölçümü için kullanılır.

Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Drosophila melanogaster</emKullanma&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

Bu kağıt sensilla basiconica tek sensillum kayıtları için detaylı ve son derece etkili iletişim kuralı böcek ağız dokunacı üzerinde açıklar.

Tek Sensillum kayıtları Locust Palp Sensilla Basiconica için

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

Nadiren kullanılan bir elektrofizyolojik kayıt yöntemi olan temel kayıt, geleneksel kayıt yöntemleriyle incelenemeyen tat kodlama özelliklerinin analizine olanak tanır. Temel kayıt, geleneksel elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenemeyen hidrofobik uyaranlara verilen tat tepkilerinin analizine de izin verir.

Temel Kayıt: Drosophila'da Tat Nöronlarının Tepkilerini Analiz Etmek İçin Bir Teknik

Keşfedin, düşük uçuculukta feromonları Drosophila trikoid sensillasındaki koku alma reseptör nöronlarına elektrofizyolojik kayıt için nasıl sunulur. Bu yöntem, böcek feromon iletişiminin nörofizyolojisini in vivo ortamda araştırmayı mümkün kılar.

Elektrofizyolojik Kayıt

Daha fazla video keşfet