Kırınım Analizi hayatın Caenorhabditis elegans Fourier tabanlı
13 Eylül 2017
Bu makale farklı nematodlar uzakta-tarla kırınım imza kullanma ayırmak nasıl açıklar. Biz hareket 139 vahşi türü ve 108 "Roller" C. elegans frekansları sürekli dalga bir lazer kullanarak tek bir yerde geçici Fraunhofer bükülmesi imzayla ilişkili sayı ortalaması alınarak karşılaştırın.
Bu fourier tabanlı kırınım analizinin genel amacı, türler üç boyutlu bir uzayda serbestçe hareket ederken C elegans'ın hareketini gerçek zamanlı olarak karakterize etmektir. Bu yöntem, farklı yoğunluktaki çözeltilere veya lokomotor mutantlara tür tepkilerini tanımlayarak nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu yöntem, mikroskobik türlerin Fourier analizi için bir temel çizgi görevi görür.
Her mikroskobik türün kendine özgü fourier spektrumuna sahip olması avantajına sahiptir. Bu yöntem C elegans'ın hareketi hakkında fikir verebilse de, diğer mikroorganizmalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü küvette, lazer ışınının altında nematod'u bulmak zor olabilir.
Bu yöntem için ilk olarak, gürültülü bir sinyal olan zamansal kırınım sinyalinden yüzme davranışı hakkında bilgi edinmeye çalışırken aklımıza geldi. Başlamak için, optik tezgahın sol arka köşesine yakın bir helyum neon lazeri sabitleyin ve bir güç kaynağına bağlayın. Lazer ışını numuneye ulaşmadan önce filtreden geçecek şekilde lazer ile numune konumu arasına bir nötr yoğunluk filtresi yerleştirin.
İki ön yüzey alüminyum direksiyon aynası kullanarak, nötr yoğunluk filtresinden sonraki ilk aynayı sabitleyerek bir periskop oluşturun. Ardından, lazer ışınını yönlendirmek için yer açmak için ikinci aynayı birinci aynanın yaklaşık 10 santimetre altına sabitleyin. Aynalar arasına bir küvet yerleştirin ve lazer ışını ile küveti, lazer ışını küvet boyunca dikey olarak hareket edecek şekilde hizalayın.
Ardından, sensörü aynaya bakacak şekilde foto diyotu doğrudan ikinci aynanın karşısına sabitleyin. Ardından, bir standın üzerine su dolu bir küvet yerleştirin. Standın yüksekliğini ve birinci ve ikinci aynaların açılarını, lazer ışını küvetten geçecek ve doğrudan foto diyota değil, yakınına yönlendirilecek şekilde ayarlayın.
Standın küvet için düz bir yüzey oluşturduğundan emin olmak için bir kol kullanın. Stand düz değilse, hizalanana kadar uygun ayarlamaları yapın. Son olarak, verilen USB kablosunu kullanarak foto diyotu dijital osiloskopa bağlayın ve bilgisayara bağlayın.
Osiloskop yazılımını yükleyin ve solucanın çöpe atma döngüsünü yeterince çözmek için örnekleme hızını en az sekiz hertz'e ayarlayın. Dört yetişkin nematodunu taze bir NGM agar dolu petri plakasına aktarmak için ince, düzleştirilmiş bir platin tel kıracağı kullanın. Ardından, tek kullanımlık bir plastik küveti paketinden çıkarın ve küvete yalnızca çıkıntılı taraflarından dokunmaya dikkat edin.
Ardından, damıtılmış suyu yaklaşık %80'i damıtılmış suyla dolana kadar bir küvete pipetlemek için bir mikropipet kullanın. C elegans içeren petri kabını bir diseksiyon dürbünü altına yerleştirin. Ardından, petri kabından bir olgun C elegans'ı çıkarmak için platin penayı kullanın ve penayı küvete daldırın.
Gerekirse nematodu yerinden çıkarmak için kazmayı daireler halinde hareket ettirin. Nematodları nazikçe tutun ve küveti sallamayın. Küveti sallamak solucanların tepkisiz kalmasına neden olabilir.
Küvette kabarcık oluşmasını önlemek için, küveti küvetin üst kısmı üzerinde hafifçe kımıldayana kadar damıtılmış suyla doldurun. Ardından kapağı suyla doldurun ve kapağı hızlıca küvetin üzerine koyun. Lens kağıdı kullanarak, küvetin üzerine dökülmüş olabilecek su damlacıklarını temizleyin.
Ek olarak, kalan küçük damlacıkları temizlemek için lens kağıdı kullanın. Helyum neon lazeri açın ve frekans ayarını kırmızı bir ışın üretecek şekilde ayarlayın. Ardından sensörü açın.
Küveti çıkıntılı kenarlarından tutun ve nematod yaklaşık olarak küvetin ortasına gelene kadar hafifçe eğin. Ardından, küveti optik sistemdeki standın üzerine yerleştirin ve solucanı ayna bir'den ayna iki'ye hareket eden lazer ışını içinde ortalayın. Ardından, foto diyotu kırınım düzenine yerleştirin, böylece fotoğraf diyotunun konumu ve kırınım modelinin merkezi maksimumu çakışmaz.
Ardından, nötr yoğunluk filtrelerini, foto diyottan kayda değer bir voltaj çıkışı olacak şekilde döndürün. Foto diyotun doygunluğunu önlemek için nötr yoğunluk filtresini kullanarak ışığı sınırladığınızdan emin olun. Düz bir çizgi, aşırı doygunluğu veya yoğunluk eksikliğini gösterir.
Hareketli kırınım modeli göründüğünde, solucanın hareketini izlerken osiloskopu kontrol ederek yazılımdaki başlat düğmesine tıklayarak foto diyot ile veri toplayın. Solucan lazer ışınından çıkana ve kırınım deseni kaybolana kadar ölçüm yapmaya devam edin. Küvet çizilirse, onu ve solucanı atın ve tekrar başlayın.
Yaklaşık 20 saniye sonra, osiloskop yazılımı üzerindeki durdur düğmesine tıklayarak veri toplama işlemini durdurun. Her denemenin verilerini virgülle ayrılmış değer veya metin biçiminde kaydedin. Her fenotip için en az 50 veri seti toplayın ve deneme başına sekiz ila 10 hayvan kullanın.
Modellenmiş sıralı solucan hareketi örnekleri ve karşılık gelen kırınım modelleri burada gösterilmiştir. Modellenen kırınım desenleri niteliksel olarak deneysel modellere benzer ve simülasyonun nematodu başarılı bir şekilde modellediğini gösterir. Ek olarak, silindirin ve vahşi tip c elegansın zamansal kırınım imzası kantitatif olarak gösterilebilir.
Burada görüldüğü gibi, her nematod farklı oranlarda ve genliklerde çarpar. Ortalama dijital fourier dönüşümleri, nematodun kırınım frekans spektrumlarının genliği ile tanımlanmasına izin verir. Yabani tip solucan spektrumuna, silindir hareket spektrumundan daha düşük frekanslar hakimdir.
İşte iki karşıt deniz hareketi olarak düşünülebilecek bir w salınımı örneği. Buna karşılık, silindir çoğunlukla bir tarafa bir c oluşturacak ve bu şekilde görünecektir. Frekansları incelerken, w hareketi daha karmaşıktır ve c hareketinden daha fazla ikincil düşük frekansı ortaya çıkarır.
Bir kez ustalaştıktan sonra, teknik düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık iki dakika içinde bir veri seti toplanabilir. Bir dizi veri seti için optiği ayarlamak yaklaşık 20 ila 30 dakika sürer. Bu prosedürü denerken, hareketlerinin bütünlüğünü korumak için C eleganları dikkatli bir şekilde kullanmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, C elegans hareketi hakkında daha fazla bilgi edinmek için traktör rekonstrüksiyonu ve doğrusal olmayan analiz gibi diğer yöntemleri uygulayabiliriz. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nörobiyoloji araştırmacılarının C elegans'taki lokomotor mutantları daha derinlemesine incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı nematodlar için kırınım desenlerinin nasıl oluşturulacağı ve bunların nasıl analiz edileceği konusunda oldukça iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve işlem yapılırken lazerlerin göz hizasında hareket etmemesi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu çalışma, C. elegans'ın lokomosyonunu gerçek zamanlı olarak karakterize etmek için Fourier tabanlı bir difraksiyon analiz yöntemi sunmaktadır. Zamansal Fraunhofer difraksiyon imzalarını analiz ederek, araştırmacılar lokomosyon modellerine dayanarak vahşi tip ile "Roller" fenotiplerini birbirinden ayırt edebilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobiyoloji
- Biyofizik
- Mikroskopi
Arka Plan
- C. elegans, lokomosyon ve nörobiyoloji çalışmalarında model organizma olarak kullanılır.
- Her mikroskobik türün, davranışları hakkında bilgi sağlayabilecek kendine özgü bir Fourier spektrumu vardır.
- Lokomosyon analizi, türlerin çevresel değişimlere verdiği yanıtların anlaşılmasına yardımcı olabilir.
- Nematodların deneysel düzenek içindeki konumlarının belirlenmesinde zorluklar yaşanabilmektedir.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans lokomosyonunun gerçek zamanlı analizi için bir yöntem geliştirmek.
- Lokomosyon modellerine dayanarak farklı fenotipleri birbirinden ayırt etmek.
- Çeşitli mikroskobik türlere uygulanabilecek Fourier analizi için bir temel oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kırınım analizi için bir helyum neon lazer ve optik sistemin kurulumu.
- Nematod hareketine ilişkin veri toplamak için bir fotodiyot ve dijital osiloskop kullanımı.
- Kontrollü bir ortamda C. elegans örneklerinin hazırlanması.
- Lokomosyon özelliklerini belirlemek için kırınım desenlerinin veri toplama ve analizi.
Ana Sonuçlar
- Yaban tipi ve Roller C. elegans için farklı kırınım desenleri gözlemlendi.
- Ortalama dijital Fourier dönüşümleri, lokomosyon frekanslarındaki farkları ortaya çıkardı.
- Yöntem, nematod hareketini başarıyla modelledi ve nicel bilgiler sağladı.
- Veri toplama işlemi verimliydi ve kısa bir zaman diliminde birden fazla denemenin yapılmasına olanak tanıdı.
Sonuçlar
- Fourier tabanlı difraksiyon analizi, C. elegans lokomosyonunun incelenmesinde etkilidir.
- Bu yöntem, diğer mikroskobik organizmalara da uyarlanabilir.
- Lokomosyon modellerinin anlaşılması, nörobiyolojik araştırmalara katkı sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu yöntem, kırınım imzalarının Fourier analizi aracılığıyla mikroorganizma hareketliliğinin gerçek zamanlı ve etiketsiz karakterizasyonuna olanak tanıyarak, nörobiyoloji ve biyofizik uygulamaları için kantitatif bir fenotipik okuma sağlar. Genetik mutasyonları ölçülebilir davranışsal çıktılarla ilişkilendirerek hedef doğrulamayı destekler ve erken keşif aşamasında mekanistik risk azaltma sürecini kolaylaştırır. Bu yaklaşım, mikroskobik türler genelinde lokomotor fenotiplerin taranması için ölçeklenebilir ve yeniden kullanılabilir bir platform sunarak model sistemlerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik pertürbasyonları belirgin lokomosyon frekans spektrumları ile ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Floresan etiketlere veya genetik raporlayıcılara ihtiyaç duymadan, etiketsiz ve gerçek zamanlı fenotipik tarama imkanı sunar.
- Öngörücü Değer: Fourier dönüşümlü difraksiyon paternleri aracılığıyla vahşi tip ve mutant fenotipleri ayırt ederek, lokomotor hedeflerin biyolojik risk azaltma süreçlerini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek içerikli fenotipik tarama için uygun, kantitatif ve tekrarlanabilir frekans alanı çıktıları üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Deneme başına 8–10 hayvan kullanarak fenotip başına 50'den fazla veri setinin toplanmasına izin vererek istatistiksel sağlamlık sağlar.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Kendine özgü spektral imzaları olan herhangi bir mikroskobik türe uygulanabilir Fourier analizi için temel teşkil eder.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: C. elegans'taki nörodavranışsal fenotipleri, daha yüksek modellerdeki potansiyel hastalıkla ilgili lokomotor eksikliklerle ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Solucan şekil dinamiklerinin hesaplamalı modellerini doğrulamak için ortalama Fourier spektrumlarını kullanarak fenotipten genotipe eşlemelerdeki güveni artırır.
- Karar Desteği: Suşlar arasındaki spektral farklılıklara dayalı olarak devam/dur kararlarına olanak tanıyarak fonksiyonel doğrulamadaki belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, yolak doğrulama için nicelendirilebilir lokomotor son noktalar sağlayarak, fenotipik karakterizasyonu genetik manipülasyondan sonra ve öncü bileşik belirlemeden önce konumlandırarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Karmaşık yüzme davranışlarını Fourier dönüşümü aracılığıyla analiz edilebilir frekans modellerine dönüştürerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Genetik altyapılar veya bileşik tedavileri genelinde lokomotor aktivitenin karşılaştırılmasına olanak tanıyan, difraksiyon tabanlı standart okumalar sağlar.
- Analitik: Baskın osilasyon modlarına dayalı olarak fenotipik suşların ayırt edilmesini sağlayan frekans-genlik spektrumları üretir.
- Translasyonel Araştırma: Mikroskobik lokomosyon metriklerini nörobiyolojik fonksiyonla ilişkilendirerek, hareket bozukluklarının preklinik modellerine ekstrapolasyonu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli mikroorganizma modelleri genelinde Fourier tabanlı fenotipik tarama için aktarılabilir bir optik platform kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Lokomosyonun objektif, frekans alanı fenotiplemesi yoluyla hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş optik düzenek ve sinyal normalizasyonu (maksimum yoğunluğa bölme) ile tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: İlk 20–30 dakikalık kurulumdan sonra hızlı fenotiplemeye (veri seti başına 2 dakika) olanak tanıyarak sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Yabanı tip ve mutant suşlar arasındaki fenotipik farklılığı nicelleştirerek riskle uyumlu önceliklendirmeyi kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Doygunluğu önlemek ve düzgün kırınım deseni oluşumunu sağlamak için optik hizalama ve lazer güvenliği konusunda uzmanlık gerektirir.
- Lokomosyon frekanslarını çözümlemek için kararlı bir helyum neon lazerine, fotodiyoda ve ≥8 Hz örnekleme hızına sahip dijital osiloskoba ihtiyaç duyar.
- Zamansal imzaları bozabilecek kabarcık oluşumunu veya nematod stresini önlemek için dikkatli örnekleme gerektirir.
- Platin tel uç kullanılarak yapılan manuel nematod transferini içerir, bu da yüksek kapasiteli adaptasyon için bir darboğaz oluşturur.
- Ölçüm sırasında çökelme veya duvar etkileri olmadan lazer yolunda asılı kalabilecek kadar küçük organizmalarla sınırlıdır.
