Name: Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Keşfedin farelerde Enterohemorajik Escherichia coli kolonizasyonunu biyolüminesans görüntüleme ile canlı hayvanlarda invaziv olmayan şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem EHEC patojenitesi araştırmalarında sürekli izleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chi-Chung Chen üzerinden Bakanlığı tıbbi araştırma, Chi Mei Tıp Merkezi (Tainan, Tayvan) fare yardım için enfeksiyon ve ulusal Cheng Kung Üniversitesi laboratuvar hayvan merkezinden destek anıyoruz. Bu eser bilim Bakanı tarafından desteklenir ve Teknoloji (en) CC için (en 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) verir.

Dikkat: EHEC O157: H7 Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) olan patojen merkezleri hastalık kontrol ve Önleme (CDC) Biyogüvenlik talimat (https://www.cdc.gov/) göre. Bu nedenle, tüm deneysel prosedürler EHEC içeren BSL-2 tesisinde gerçekleştirilmelidir. Laboratuvar mont ve eldiven giymek deney yaparken. Bir Sertifikalı Biyogüvenlik içinde dolap (BSC) çalışır. Deneysel kürsüye önce ve deneysel bir işlem ile % 70 etanol sonra dezenfekte. Bütün aletleri veya ekipman kişi (veya potansiyel kişi) EHEC % 70 etanol veya çamaşır suyu ile dezenfekte. Kirlenmiş (veya potansiyel olarak kontamine) atıkların dikkatle mühürlü ve autoclaved olmalıdır. Bir maske, göz koruması, çift eldiven veya tulum, gerekirse giymek. 6-hafta-yaşlı C57BL/6 dişi fareler satın ve laboratuvar hayvan Merkezi, ulusal Cheng Kung Üniversitesi (NCKU) yapılmaktadır. Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım NCKU Komitesi (onay numarası 104-039) tarafından kabul edildi.
1. Bioluciferase etiketli EHEC bakteri üretimi
<ol><li>Mix 50 ng deoksiribonükleik asit (DNA), 1 μL her 10 mikron ileriye ve geriye doğru astar, 2 μL 2.5 mM deoxynucleotides (dNTPs), 2 μL 10 x arabellek, 0.2 μL DNA polimeraz ve steril çift distile su (GKD2O) yükseltmek için 20 μL son hacmiyle Anti-sefaloridin kaset, nptII gen24. PBSL18024Ulusal BioResource Projesi (NBRP) üzerinden satın alınan, DNA şablonudur. PCR koşulları Tablo 1 ' de listelenen ve astar sıra Tablo 2' de kullanılabilir.</li>
	<li>PCR ürünleri ticari bir klonlama vektör seti takip için ligate ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.</li>
	<li>NptII gen parçası NsiI ve SmaI klonlama vektöründen tüketim ve sefaloridin dayanıklı plazmid oluşturmak için pAKlux29 NsiI ve ScaI tarafından sindirilmiş pBBR1MCS4 içine clone, pWF27813.</li>
	<li>Plazmid9, pAKlux2, SpeI-HF ve ScaI ve klon tarafından ifade luciferase üzerinden luxCDABE operon tüketim SpeI-HF ve SmaI sefaloridin oluşturmak için pWF278 sindirmek dayanıklı ve plazmid, pWF27913ifade luciferase. Not: plazmid çekimi ve eksize parçası purifications, ticari plazmid çıkarma ve jel ekstraksiyon kiti, sırasıyla kullanın. Enzim sindirim için 100 ng DNA, 1 μL 10 x tampon, her seçili restriksiyon enzimi ve steril GKD2O 10 μL, toplam hacmiyle 1 μL mix ve 2.5-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>PWF279 plazmid elektroporasyon ile 2500 V 4 ms için tarafından E. coli O157: H7 EDL933 yetkili hücrelere dönüşümü.</li>
	<li>1 mL Luria-Bertani (LB) orta 1 h için 37 ° C'de dönüştürülmüş bakteri hücrelerinde kuluçkaya.</li>
	<li>16-18 h için 37 ° C'de sefaloridin 50 µg/mL ile desteklenmiş bir LB agar plaka üzerinde bakteri plaka.</li>
	<li>Plaka kollarındaki sinyal makine ertesi gün Imaging bir vivo içinde tarafından kontrol edin. Bir koloni plaka almak ve 3 ml 50 µg/mL sefaloridin 16-18 h için 37 ° C'de ile takıma LB kültür.</li>
	<li>Bakteriyel hisse senedi orta sulandrarak hazırlamak % 100 gliserol % 30 gliserol çözüm yapmak için steril GKD2O.</li>
	<li>Sefaloridin dayanıklı Don E. coli O157: H7 EDL933 bakteri olarak bakteri kültürü ve % 30 gliserol çözüm-80 ° C'de 1:1 oranında bir vidalı kapak cryovial bakteriyel bir hisse senedi olarak luciferase plazmid yataklık Gliserol son konsantrasyonu % 15 olduğunu.</li>
</ol>2. kollarındaki EHEC bakteri hazırlık Oral aşılama için
Not: Zaman çizelgesi akış çizelgesi EHEC hazırlık ve fare oral gavaj deneysel prosedürleri deneysel hazırlanmasında yardımcı olmak için şekil 1 ' deki sunulur.
<ol><li>Çizgi E. coli O157: H7 EDL933 bakteri luciferase plazmid 50 µg/mL sefaloridin-80 ° C stoktan bir LB agar plaka üzerine yataklık. 16-18 h 37 ° C'de için bakteri büyümesi</li>
	<li>Bir koloni gecede plaka ve kültür 3 mL LB orta 50 µg/mL sefaloridin 16-18 h 37 ° C kuluçka 220 RPM ile seç.</li>
	<li>Alt kültür için 2,5-3 h 37 ° C kuluçka 200 devirde LB suyu içeren bakteri (1: 100 seyreltme) sefaloridin (50 µg/mL). (Örneğin, 2 mL gecede takıma 200 mL LB orta sefaloridin (50 µg/mL) ile bakteri kültürlü ekleyin).</li>
	<li>Bakteri 2.5-3 h için kuluçkaya ve 600 optik yoğunluk değerini ölçmek nm (OD600) değeri olduğunu 0,9-1 arasında. Yaklaşık 108 koloni oluşturan birim (CFU) yoğunluğudur: bakteri hücre numarası / mL.</li>
	<li>8000 x g 30 dk, 4 ° c'de yeniden kültürlü bakteri santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant bakteri Pelet Tantanacı olmadan atmak ve 100 mL % 0,9 steril normal salin ile pelet tarafından nazik ajitasyon yıkayın.</li>
	<li>2.5 ve 2.6 bir kez adımları yineleyin.</li>
	<li>Wash sonra santrifüj kapasitesi 8000 x g 30 dk, 4 ° C de bakteri kültürü ve süpernatant yavaşça atın.</li>
	<li>Yoğuşma Pelet, 100-fold %0,9 steril normal salin ile. 200 mL bakteri centrifuged, örneğin, pelet askıya almak için 2 mL normal tuz ekleyin.</li>
	<li>(Yaklaşık 109 CFU/100 μL yoğunlaşma sonra normal salin olması gereken) CFU bakteri ile 10 kat seri seyreltme25konsantre bakteri kaplama tarafından onaylayın.</li>
</ol>3. fare sözlü sonda ile besleme, EHEC
<ol><li>6-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 fareler streptomisin su (5 g/L) için 24 h ile tedavi.</li>
	<li>24 saat sonra normal içme suyu başka bir 24 saat daha önce sonda ile besleme için geçiş yapın. 24 h için düzenli su ile tedavi sonra fareler EHEC oral gavaj için hazırsınız demektir.</li>
	<li>Şırınga ile 100 μL EHEC bakteri üzerinde pistonu geri çekerek doldurun. Şırıngada hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Baloncuklar şırınga ile parmaklarını şaklatarak kaldırın.</li>
	<li>Hayvan yavaşça kaldırın ve bakım ile kafes üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Fareyi kuyruğundan dikkatle tutun ve hayvan kafes üst kavrama ve uzaklaşmaya girişimi.</li>
	<li>Yavaşça fare derisi boyun ve arka başparmak ve işaret parmağı fare başkanı taşınmasını engelleme hayvanla açgözlü tarafından dizginlemek.</li>
	<li>Fare sonda ile besleme iğne yerleştirin ve fare immobilize ve dikey başıdır emin olmak için bir dikey konumda tutun.</li>
	<li>Sonda ile besleme iğneyi ağız çatı takip fare ağzına yerleştirin ve yemek borusu ve mide doğru aşağı taşı.</li>
	<li>Eklenen iğne yarısı veya üçte iki uzunluğu fare olduğunda yaklaşık 109 CFU hücreleri içeren 100 μL EHEC bakteri enjekte et.</li>
</ol>4. görsel öğe
<ol><li>Oral gavaj sonra 1-2 gün kollarındaki sinyalleri algılayabilir.</li>
	<li>Hayvanların kollarındaki sinyalleri inceleyerek önce onları % 2.5 isoflurane 1, 5 L/dk oksijen ile TMMOB içine koyarak onları anestezi.</li>
	<li>Olana kadar tüm fareler bilinçsiz ve hareket durdurmak için 2-5 dk bekle. Hayvanlar bioluminescence vivo içinde tespiti için hazırsınız demektir.</li>
	<li>Algılamak ve hayvanların kollarındaki sinyalleri görüntüleme sistemi bir vivo içinde tarafından görüntü. Bölüm 5 "Veri toplama" yazılım işlem için bakınız. Görüntüleme işlemi sırasında tüm % 2.5 isoflurane 1, 5 L/dk oksijen ile sürekli bir tedarik altında hayvanlardır.<ol>
<li>Tıkırtı eğe > canlı ve el ile fare üzerinde odaklanmak.</li>
		<li>Pozlama zaman ve lazer yoğunluğunu seçin.</li>
		<li>Tıklama elde etmek > yakalamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ex vivo görüntüleme için fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi ve virüslü fareleri tüm bağırsak kaldırın. Bağırsak bir 9-cm Petri kabına ve resim görüntüleme sistemi içinde vivo tarafından yerleştirin. Aynı görüş alanı A/b olarak ayarlanır dışında vivo içinde görüntüleme ayardır Lütfen ayrıntılar için Bölüm 5 "Veri toplama" bakın. Not: Yöntem servikal yerinden çıkması için: kafes üstünde fare böylece hayvanları kafes kavrama tek elle kuyruk açgözlü dizginlemek. Pen marker veya başparmak ve ilk parmak boyun arkası karşı diğer el kafatası tabanında yer. Hızlı bir şekilde el veya nesne ile baş frenleyici push ileri ve kuyruğunu tutan el ile geri çekin. Yakından solunum durması ve kalp atışı yoktu onaylamak için kontrol edin.</li>
</ol>5. veri toplama
Not: yazılım veri toplama için kullanılan Malzemeler tablolistelenir.
<ol><li>Resim alma için satın alma kontrol panelinin yazılımı (Şekil 2) açın.</li>
	<li>Seç "ışıklı," "Fotoğraf" ve "Overlay"</li>
	<li>Pozlama süresi "Otomatik" olarak ayarlayın "Orta" Binning ayarla</li>
	<li>Işıksaçan ve 8 için ƒ/1 durağı ayarlamak fotoğraf için. Ƒ/durdur denetimleri ışık miktarını CCD algılayıcısı tarafından aldı.</li>
	<li>Görüntüleri elde etmek için ilgi alanına göre görüş alanı ayarlayın. Seçenek "D" beş 6-hafta-yaşlı fareler uygun ve onları teker teker görüntü. "C" üç 6-hafta-yaşlı fare bir alandaki görüntü.</li>
	<li>Fare/örnekleri görüntüleme için hazır olduğunuzda, resim alma için "Al" düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Satın alınan görüntü verilerini açın.</li>
	<li>Araç paleti paneli (şekil 3) açın.</li>
	<li>ROI araçlarını seçin. Daire (en soldaki bir) (şekil 4) görüntülerde kollarındaki alan aralığı için tavsiye ediyoruz.</li>
	<li>"Ölçü yüzey kollarındaki yoğunluğu (şekil 3) ölçmek için ROIs" (kalem simgesi) tıklatın. Yatırım Getirisi ölçümleri panelinde ve miktar değerleri (şekil 5) görünür.</li>
	<li>Yapılandırmak ölçü ROI ölçüm panelinin sol köşesinde değerleri/gerekli bilgileri (şekil 6) seçin, aksi takdirde "Bu veri tablosunu verin ve .csv dosyası (şekil 5) olarak kaydetmek için Dışa Aktar" düğmesini tıklatın için kullanın.</li>
	<li>Kollarındaki yoğunluğu miktar .csv dosyasındaki değerleri sütun "Toplam akı (p/s)" kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Pennington, H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(10)60963-4/abstract">Escherichia coli O157.</a> Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).</li>
<li>Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxins+and+the+pathophysiology+of+hemolytic+uremic+syndrome+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals.</a> Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).</li>
<li>Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-toxin-producing+Escherichia+coli+and+haemolytic+uraemic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome.</a> Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Shiga+Toxin+Mechanisms+of+Action+in+Renal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease.</a> Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).</li>
<li>Nguyen, Y., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+%28EHEC%29+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li>
<li>Rhee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+spatial+and+temporal+colonization+of+enteropathogenic+E.+coli+and+enterohemorrhagic+E.+coli+in+mice+using+bioluminescent+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging.</a> Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).</li>
<li>Roxas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+alters+murine+intestinal+epithelial+tight+junction+protein+expression+and+barrier+function+in+a+Shiga+toxin+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner.</a> Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).</li>
<li>Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiragusa%2C+GR+%22Real-Time+Monitoring+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+Adherence+to+Beef+Carcass+Surface+Tissues+with+a+Bioluminescent+Reporter%22">Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter</a>. , (1999).</li>
<li>Kuo, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Core+LPS+Biosynthesis+Enzyme+RfaD+Confers+Hypersusceptibility+to+Host+Intestinal+Innate+Immunity+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo.</a> Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).</li>
<li>Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303 (5659), 851-853 (2004).</li>
<li>Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Yersinia+enterocolitica+in+Murine+and+Bovine+Feces+on+the+Basis+of+the+Chromosomally+Integrated+luxAB+Marker+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene.</a> Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).</li>
<li>Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Yersinia+enterocolitica+invasin+expression+in+vitro+and+in+vivo+using+a+novel+luxCDABE+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system.</a> Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).</li>
<li>Morin, C. E., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stabilized+luciferase-expressing+plasmids+to+examine+in+vivo-induced+promoters+in+the+Vibrio+cholerae+vaccine+strain+CVD+103-HgR%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).</li>
<li>Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+model+systems+for+studying+enteropathogenic+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).</li>
<li>Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection.</a> Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7628717">Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Long-Wavelength+Optical+and+NIR+Imaging+Materials%3A+Contrast+Agents%2C+Fluorophores+and+Multifunctional+Nano+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers.</a> Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).</li>
<li>Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+green+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Improved green fluorescence.</a> Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Frangioni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium%3A+infection%2C+inflammation+and+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).</li>
<li>Mallick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+murine+infection+model+for+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli.</a> J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).</li>
<li>Petty, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Citrobacter+rodentium+genome+sequence+reveals+convergent+evolution+with+human+pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).</li>
<li>Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS%2C+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li>
<li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li>
<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li>
<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu luciferase plazmid ile dönüştürülmüş EHEC onun Yerelleştirme Ana bilgisayarlar veya gen ifade vivo içinde8,11,12incelemek için kullanılan bildirilmiştir. Aşağıda gösterildiği fare modeli ayrıca fare ana bilgisayar8' bulmak belgili tanımlık kolonize EHEC zamanlama ve yerelleştirme bildirilmiştir. Yine de, biz, farelere EHEC aşılama intragastrically yönetmek ve kollarındaki bakteri oral gavaj iç...

EHEC O157: H7 nedenleri ishal1, HS2, HUS3ve hatta Akut böbrek yetmezliği4 kontamine su veya gıda ile bir patojen var. EHEC patojenik bir enterobacterium olduğunu ve insanların1gastrointestinal sistem colonizes. EHEC ilk uygun zaman ana bağırsak epiteli, kolonizasyon faktörler bir bağlama inducing ve daha sonra zorlamak için (A/E) lezyon effacing moleküler bir şırınga işlev gören tür III salgı sistemi (T3SS) ile ana hücreleri içine enjekte yapışma (kolonizasyon)5. Bu genlerin A/E lezyon oluşumunda yer alan Enterocytes efasman (LEE) patojenitesi ada5locus tarafından kodlanır.
Bioluminescence olduğunu ışık üreten kimyasal reaksiyon, görünür ışık6oluşturmak için onun substrat biyoluminesans hangi luciferase tromboksan. Enzimatik bu işlem genellikle oksijen veya adenozin trifosfat (ATP)6varlığını gerektirir. (BLI) görüntüleme bioluminescence araştırmacılar canlı hayvan7görselleştirme ve ana bilgisayar-patojen etkileşimlerin niceleme sağlar. Saçınıza canlı hayvan bakteriyel enfeksiyon döngüsünde onlar göç ve farklı dokular7istila kollarındaki bakteri izleyerek karakterize olabilir; Bu enfeksiyon dinamik bir ilerleme ortaya koymaktadır. Ayrıca, hayvanlarda bakteri yükü kollarındaki sinyal8' e ilişkilidir; Böylece, deneysel hayvan patolojik şartları basit ve doğrudan bir şekilde tahmin etmek için uygun bir göstergedir.
Burada kullanılan plazmid luciferase operon, bakteri, kendi luciferase substrat7,9kodlar Photorhabdus luminescens olan luxCDABE, yer. Bu luciferase ifade plazmid bakteri dönüştürerek, canlı hayvan kollarındaki bu bakteri gözlemleyerek kolonizasyon ve enfeksiyon işlemleri izlenebilir. Genel olarak, alma ve bioluminescence etiketli bakteri araştırmacılar bakteri numaraları ve konumu, bakteriyel canlılığı antibiyotikler/tedavi ve bakteri gen ekspresyonu enfeksiyon/kolonizasyon6, ile izlemek izin 7. çok sayıda patojen bakteri enfeksiyonu onların enfeksiyon döngüsü ve/veya gen ifade incelemek için luxCDABE operon express bildirilmiştir. Bu bakterilerin uropathogenic E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic de dahil olmak üzere, E. coli (EPEC)8, Sitrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria Monositogenez17, Yersinia enterocolitica18,19, ve Vibrio cholerae20, dokümante edilmiştir.
EHEC kolonizasyon vitro ve in vivo21,22,23çalışma kolaylaştırmak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Ancak, EHEC kolonizasyon vivo içindeçalışmaya uygun hayvan modellerin eksikliği ve böylece ayrıntılar ortaya çıkan bir yetersizliği olduğunu. EHEC kolonizasyon mekanizması vivo içindeçalışma kolaylaştırmak için gözlemlemek ve non-invaziv bir yöntem canlı hayvan EHEC kolonizasyon ölçmek için hayvan modelleri oluşturmak için değerlidir.
Bu el yazması kollarındaki ifade sisteminin EHEC kolonizasyon zaman içinde yaşayan ana bilgisayarları izlemek için kullandığı bir fare-EHEC kolonizasyon modeli açıklar. Fareler intragastrically bioluminescence etiketli EHEC ile aşılanmış ve kollarındaki sinyal farelerde sistem13Imaging bir non-invaziv vivo içinde ile algılanır. Sonra 2 gün sonra 2 gün enfeksiyon sonrası bu bakteri konak bağırsaklarda kolonize önerilen enfeksiyon sonrası önemli kollarındaki sinyalleri onların bağırsaklarda gösterdi EHEC bioluminescence etiketli fareler bulaşmış. Ex vivo görüntü verilerini bu kolonizasyon özellikle çekum ve kolon farelerin olduğunu gösterdi. Bu fare-EHEC modelini kullanarak, kollarındaki EHEC kolonizasyon yaşam ana bilgisayarında bir görüntüleme sistemi daha fazla anlayış teşvik edebilir enterik bakteri kolonizasyonu detaylı mekanizmaları incelemek için in vivo tarafından tespit edilebilir EHEC kaynaklı fizyolojik ve patolojik değişiklikler.

<table><tbody><tr><td>Çalkalayıcı kuluçka makinesi</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>bakteri inkübasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Orbital çalkalama inkübatörü</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>bakteri inkübasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>nptII geninin kaynağı</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>luxCDABE operon</td></tr><tr><td>T& TA klonlama için bir Klonlama Kiti</td><td>Yeast Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>kullanımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>plazmid klonlama için kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca NEB</td><td></td><td>R0122S</td><td>plazmid klonlama için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>plazmid klonlama için kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Sma I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>plazmid klonlama için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr>Plazmid klonlama için <td>T4 ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>kullanımı&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR amplifikasyonu için</td> <td>Ex</td><td>Taq TaKaRa</td><td>RR001A</td> kullanımı</tr><tr><td>10X Ex Taq Tamponu</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>PCR amplifikasyonu için kullanım</td></tr><tr><td>dNTP Karışımı&nbsp;</td><td>PCR amplifikasyonu için</td> <td>TaKaRa</td><td>RR001A</td> kullanımı</tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>uygulanan Biyosistem&nbsp;</td><td>2720 Termal Döngüleyici ve nbsp;</td><td>&nbsp; PCR amplifikasyonu için</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>bakteri stoklama çözeltisi için kullanın</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>kimyasalı LB ortamı yapmak için, 10 g/L</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>LB ortamı yapmak için kimyasal, 10 g/L</td></tr><tr><td>Maya Özü tozu</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>LB ortamı yapmak için kimyasal, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>LB agar</td></tr><tr><td>kanamisin yapmak için kimyasal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>antibiyotikler, selekiton</td></tr><tr><td>streptomisin</td> için kullanılır.<td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>antibiyotikler, farelerde mikrobiyotayı ortadan kaldırır</td></tr><tr><td>EDL933 yetkin hücre</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>yöntem ek belgededir&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporasyon için</td><td></td> <td>elektroporatör MicroPulser</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon</td><td>Küvetleri Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>Elektroporasyon için</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>bakterileri santrifüjlemek için kullanın&nbsp;</td></tr><tr>Bakterileri santrifüjlemek için <td>Sabit Açılı Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>kullanımı&nbsp;</td></tr><tr>Bakterileri santrifüjlemek için <td>Sabit Açılı Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>kullanımı&nbsp;</td></tr><tr><td>santrifüj şişeleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>bakterileri santrifüjlemek için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>santrifüj şişeleri</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>bakterileri santrifüjlemek için kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Biyofotometre Plus&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td> bakteri C57BL/6 <td>farelerinin OD600 değerini ölçmek için</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>NCKU <td></td><td></td>laboratuvar <td>önlüğü Laboratuvar Hayvanları Merkezi</td></tr><tr><td>,</td><td>personel koruması için</td> eldivenler <td></td><td></td> ve nbsp;</tr><tr><td>İzofluran&nbsp;</td><td>Panyon & BF Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>Fare anestezisi için</td> <td>G-8669</td>, farmasötik sınıf</tr><tr><td>1ml şırınga ve nbsp;</td><td></td><td></td><td>farelerin oral gavajı için kullanın</td></tr><tr><td>Yeniden kullanılabilir 22 G bilye uçlu besleme iğnesi</td><td></td> <td>ve phi; 0,9 mm X L 50 mm</td><td>farelerin oral gavajı için kullanım</td></tr><tr><td>cerrahi ve nbsp; makas & nbsp;</td><td></td><td></td><td>fare deneyi için kullanın</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200 görüntüleme sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS spektrumu</td><td>biyolüminesan görüntü yakalama için kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image Yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>sürüm 4.1</td>, <td>görüntü verilerini ölçmek için kullanılır</td></tr></tbody></table>

non-invaziv vivo içinde bioluminescence sistemi tarafından fare konak enterohemorrhagic escherichia coli kolonizasyon algılama

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157: H7, hangi o causesdiarrhea, Hemorajik kolit (HS), gıda kaynaklı patojen olduğunu ve hemolitik üremik Sendromu (HUS), kolonize insanlar bağırsak için. EHEC kolonizasyon içinde vivo detaylı mekanizması çalışmaya EHEC kolonizasyon ölçmek ve izlemek için hayvan modelleri olması esastır. Burada bir fare-EHEC kolonizasyon modeli kollarındaki ifade plazmid EHEC izlemek ve yaşam ana EHEC kolonizasyon ölçmek için dönüşüm tarafından göstermektedir. Bioluminescence etiketli EHEC ile aşılanmış hayvanlar yoğun kollarındaki sinyalleri farelerde algılama tarafından görüntüleme sistemi bir non-invaziv vivo içinde ile göstermek. Sonra 1-2 gün enfeksiyon sonrası, kollarındaki sinyalleri hala enfekte hayvanlarda da EHEC konaklarda en az 2 gün için kolonize gösterir tespit edilemedi. Biz de bu kollarındaki EHEC bulun ki fare Bağırsaklarda, özellikle çekum ve iki nokta üst üste, için ex vivo imge--dan göstermek. Bu fare-EHEC kolonizasyon model EHEC kolonizasyon mekanizma mevcut bilgi ilerlemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Bioluminescence etiketli EHEC yönetilen (~ 109 bakteri hücreleri) 6 - hafta eski kadın C57BL/6 farelere oral gavaj tarafından. EHEC farelere 1s içinde sözlü aşı sonra hayvanlar kollarındaki sinyali VIVO içinde görüntüleme sistemi Şekil 7gösterildiği gibi tarafından incelenmiş. Sonuçlar sonda ile besleme farelerde bioluminescence etiketli EHEC ile güçlü bir kollarındaki sinyal gösterdi. Biz 2 gün sonrası enfeksiyon sinyalleri inceledi. <str...

Bir fare modeli enterohemorrhagic bioluminescence etiketli bakteri kullanarak E. coli (EHEC) kolonizasyon için detaylı bir protokol sunulmuştur. Kollarındaki bu bakteriler tarafından bir non-invaziv görüntüleme sistemi içinde canlı hayvan vivo içinde tespiti geçerli anlayışımız EHEC kolonizasyon ilerletebilirsiniz.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Bu deneyin genel amacı, invaziv olmayan bir in vivo görüntüleme sistemi kullanarak farelerde enterohemorajik E.coli kolonizasyonunu tespit etmektir. Bu yöntem, kolonizasyon gibi enterohemorajik E.coli patojenite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, EHEC kolonizasyonunun hayvanı feda etmeye gerek kalmadan canlı hayvan üzerinde tespit edilebilmesidir.Başlamak için, lüsiferaz plazmidi taşıyan E.coli O157:H7 EDL933 bakterilerinin -80 °C stokundan, mililitrede 50 µg kanamisin içeren bir LB agar plak üzerine ekim yapın. Bakterileri 37 °C'de 16 ila 18 saat boyunca büyütün. Gece boyunca inkübe edilen plaktan tek bir koloni seçin ve mililitrede 50 µg kanamisin içeren 3 mL LB besiyerine inoküle edin.Ardından, kültürü 37 °C ve 220 rpm'de 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyunca inkübe edilen kültürden 2 mL'lik 1:100 oranında bir dilüsyon hazırlayın ve bunu kanamisin içeren 200 mL LB'ye inoküle edin. Kültürü 37 °C ve 200 rpm'de 2,5 ila 3 saat boyunca veya 600 nm'deki optik yoğunluk 0,9 ile 1 arasına ulaşana kadar inkübe edin.Ardından, yeniden kültüre edilen bakterileri 8000 ×g'de ve 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Pelete zarar vermeden süpernatantı atın ve bakterileri 100 mL %0,9 steril normal salin ile nazikçe çalkalayarak yıkayın. Yıkama işleminin ardından, bakteri kültürünü tekrar santrifüjleyin ve süpernatantı nazikçe uzaklaştırın.Ardından, peleti 100 kat yoğunlaştırmak için %0,9 steril normal salin kullanın. Metin protokolüne uygun olarak fareler 24 saat boyunca streptomisinli su ile tedavi edildikten sonra, bir şırıngayı 100 mikrolitre EHEC bakterisi ile doldurun. Hayvanı nazikçe kaldırın ve dikkatle kafesin üst kısmına yerleştirin.Ardından, hayvan kafesin üst kısmına tutunup kaçmaya çalışacak şekilde fareyi kuyruğundan dikkatlice kavrayın. Başın hareket etmesini önlemek için başparmak ve işaret parmağını kullanarak hayvanın boyun ve sırt bölgesindeki gevşek deriyi tutarak fareyi nazikçe sabitleyin. Daha sonra, fareyi dikey bir pozisyonda tutun ve farenin başının bu pozisyonda hareketsiz kaldığından emin olun.Gavage iğnesini, ağız çatısını takip ederek hayvanın ağzından yerleştirin ve mideye doğru yemek borusuna indirin. İğne farenin içine yarıya veya üçte iki oranında girdiğinde, yaklaşık 10⁹ CFU hücre içeren 100 µL EHEC bakterisini enjekte edin. Biyolüminesans hücreleri metot protokolüne göre görüntüledikten sonra, yazılımın Edinme Kontrol Panelini (Acquisition Control Panel) açın.Lüminesans, fotoğraf ve üst üste bindirme seçeneklerini seçin. Pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. Ardından binning ayarını orta seviyeye getirin.Lüminesans için F/stop değerini bir, fotoğraf için ise sekiz olarak ayarlayın. F/stop, CCD detektörü tarafından alınan ışık miktarını kontrol eder. Fare örnekleri görüntüleme için hazır olduğunda, görüntü alımı için acquire seçeneğine tıklayın.Edinilen görüntü verilerini açın ve ardından araç paleti panelini açın. Görüntülerdeki biyolüminesans alanını tanımlamak için daire gibi ROI araçlarını seçin. Ardından, kalem simgesini kullanarak yüzey biyolüminesans yoğunluğunu ölçmek için ROI'leri ölç seçeneğine tıklayın.ROI ölçüm paneli ve nicelleştirme değerleri görünecektir. Ardından, ROI ölçüm panelinin sol köşesinde, gerekli değerleri/bilgileri seçmek için ölçümü yapılandır seçeneğini kullanın. Diğer yandan, bu veri tablosunu dışa aktarmak ve bir csv dosyası olarak kaydetmek için Dışa Aktar'a tıklayın.Son olarak, csv dosyasındaki toplam akı p/s sütun değerlerini biyolüminesans yoğunluk nicelendirmesi olarak kullanın. Bu görüntüde gösterildiği gibi, biyolüminesans işaretli EHEC inokülasyonu ile oral gavaj uygulanan farelerde güçlü bir biyolüminesans sinyali görülmüştür. Bu şekilde, biyolüminesans işaretli vahşi tip EHEC EDL933 inoküle edilen fareler, enfeksiyondan iki gün sonra bile yoğun biyolüminesans sinyalleri göstermiş olup, bu durum EHEC'in konakçıları iki gün içinde kolonize ettiğini göstermektedir.Buna karşın, lipopolisakkarit defekti olan mutant E.coli ile enfekte edilen farelerde biyolüminesans gözlenmemiştir; bu durum, bu farelerin az sayıda bakteri tarafından kolonize edildiğini veya hiç edilmediğini göstermektedir. Biyolüminesans ile işaretlenmiş bakterilerin konumunu belirlemek için, sakrifiye edilen hayvanların bağırsakları ex vivo olarak görüntülenmiştir. Biyolüminesans ile işaretlenmiş EHEC ile enfekte edilen farelerden alınan organlar, sekum ve kolonda belirgin bir biyolüminesans sinyali vermiş ve bu organlarda kolonizasyon olduğunu göstermiştir.Buna karşılık, LPS mutantı ile enfekte edilen farelerin bağırsak dokusunda, in vivo görüntüleme ile tutarlı olarak azalmış biyolüminesans gözlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde EHEC kolonizasyonunu izlemek için IV sistemini kullanarak deneyin nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Kaynak: Valentine, M. E., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silme Mutantlarının Üretilmesi ve Basit Bir Fare Enfeksiyon Modelinde Virülans Zayıflaması Testi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, farelerde öldürücü ve zayıflatılmış bakteri suşlarının in vivo davranışını görselleştirmek ve karşılaştırmak için biyolüminesans kullanımını göstermektedir. Biyolüminesans bakteri süspansiyonlarının hazırlanmasını ve bunların farelere intraperitoneal enjeksiyonunu özetlemektedir. Öldürücü...

Biyolüminesans Kullanarak Farede Bakteriyel Enfeksiyon Dinamiklerini İzleme

Kaynak: Kuo, C., ve diğerleri. Murin Konakçıda Enterohemorajik Escherichia Coli Kolonizasyonunun Non-invaziv İn Vivo Biyolüminesans Sistemi ile Tespiti. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, hayvan modellerinde oral inokulum olarak kullanılmak üzere donmuş stoktan lusiferaz eksprese eden enterohemorajik Escherichia coli süspansiyonunun hazırlanmasını göstermektedir. Bu, in vivo enfeksiyon çalışmaları sırasında bağırsak kolonizasyonunun gerçek zamanlı, biyolüminesans takibini sağlar.

Biyolüminesans Enterohemorajik Escherichia coli İnokulumunun Hazırlanması

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini...

Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Kaynak: Seman, B. G. ve diğerleri. Gram-negatif bakteriyel sepsisin neonatal görüntüleme modeli. J. Vis. Exp. (2020)Video, kapsüllü biyolüminesans bakteriler kullanılarak sistemik enfeksiyonu incelemek için yeni doğumlu fare modelini gösteriyor. Yenidoğan yavrulara yüksek veya düşük dozlu bakteriyel askı enjeksiyonu yapılır ve doğum sonrası bakım için annelerine geri verilir. Kapsüllü bakteriler erken bağışıklık tespitinden kaçınır, sistematik olarak yayılır ve zamanla lüminesans görüntüleme...

Kapsüllenmiş Biyolüminesans Bakterilerle Yenidoğan Farelerde Enfeksiyonun Modellenmesi

Kaynak: Valentine, M. E. ve diğerleri, Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silinme Mutantlarının Üretimi ve Basit Fare Enfeksiyon Modelinde Virulans Zayıflamasının Testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyonu izlemek için biyolüminesans tabanlı görüntüleme yaklaşımının kullanıldığını göstermektedir. Ardışık biyolüminesans ve X-ışını görüntüleme, konak genelinde yayılan enfeksiyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi ve anatomik lokalizasyonu mümkün...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde bakteriyel enfeksiyonun gerçek zamanlı görüntülemesi

Kaynak: Luyts, N. ve diğerleri. Biyolüminesans görüntüleme ile farelerde idrar yolu enfeksiyonlarının uzunlamasına takibi ve tedavisi. J. Vis. Exp. (2021).Bu video, bakteriyel yapışma, invaziya ve hücre içi çoğaltmanın gerçekleştiği mesane içine enjekte edilen biyolüminesan E. coli kullanılarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun indüksiyonu ve izini göstermektedir. Biyolüminesans operondan yayılan ışık, enfeksiyon ilerlemesi sırasında bakteri yükünün gerçek zamanlı göstergesi olarak...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun görselleştirilmesi

Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu...

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.

Biyolüminesans Görüntüleme Kullanan Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonlarının Boyuna Takibi ve Tedavileri

Erken doğum (37 haftadan &lt; doğum), optimal olmayan önleme ve tedavi seçenekleriyle acil bir küresel sağlık sorunudur. Artan vajinal bakteriyel enfeksiyon kaynaklı erken doğumun bir fare modelini sunuyoruz ve ortaya çıkan yenidoğan morbidite ve mortalitesinin nasıl analiz edileceğini özetliyoruz.

Farelerde Yükselen Vajinal Enfeksiyon, Erken Doğum ve Yenidoğan Morbiditesinin Modellenmesi

Keşfedin farelerde Enterohemorajik Escherichia coli kolonizasyonunu biyolüminesans görüntüleme ile canlı hayvanlarda invaziv olmayan şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem EHEC patojenitesi araştırmalarında sürekli izleme sağlar.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Daha fazla video keşfet