Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Bu deneyin genel amacı, non-invaziv bir in vivo görüntüleme sistemi kullanarak farelerde enterohemorajik E.coli kolonizasyonunu tespit etmektir. Bu yöntem, kolonizasyon gibi enterohemorajik E.coli patojenite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, EHEC kolonizasyonunun hayvanı kurban etmeden canlı hayvanlarda tespit edilebilmesidir.

Başlamak için, mililitre başına 50 mikrogram kanamisin içeren bir LB agar plakasına bir lusiferaz plazmidi içeren negatif 80 santigrat derece E.coli O157: H7 EDL933 bakteri stoğunu çizin. Bakterileri 37 santigrat derecede 16 ila 18 saat büyütün. Gece boyunca plakadan tek bir koloni seçin ve üç mililitre LB ortamını mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ile aşılayın.

Daha sonra kültürü 37 derece ve 220 rpm'de 16 ila 18 saat inkübe edin. Ertesi gün, gece boyunca bir ila 100 seyreltme için iki mililitre hazırlayın ve kanamisin ile 200 mililitre LB'ye aşılayın. Kültürü 37 santigrat derece ve 200 rpm'de 2,5 ila üç saat veya 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,9 ila bir arasına ulaşana kadar inkübe edin.

Daha sonra, yeniden kültürlenmiş bakterileri 8000 kez yerçekiminde ve dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı atın ve bakterileri hafif çalkalama ile 100 mililitre% 0.9 steril normal tuzlu su ile yıkayın. Yıkamanın ardından bakteri kültürünü tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı nazikçe atın.

Ardından, peleti 100 kat konsantre etmek için %0,9 steril normal salin kullanın. Fareleri metin protokolüne göre 24 saat boyunca streptomisin suyu ile tedavi ettikten sonra, bir şırıngayı 100 mikrolitre EHEC bakterisi ile doldurun. Hayvanı nazikçe kaldırın ve dikkatli bir şekilde kafesin üstüne yerleştirin.

Ardından, fareyi kuyruğundan dikkatlice kavrayın, böylece hayvan kafesin tepesine tutunur ve kaçmaya çalışır. Başın hareket etmesini önlemek için hayvanın boynunun ve sırtının gevşek derisini kavramak için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak fareyi nazikçe tutun. Ardından, fareyi dikey konumda tutun ve farenin başının bu konumda hareketsiz olduğundan emin olun.

Gavaj iğnesini, ağzın çatısını takip ederek hayvanın ağzına sokun ve yemek borusuna mideye doğru hareket ettirin. Yerleştirilen iğne farenin yarısı veya üçte ikisi olduğunda, yaklaşık 10 ila dokuzuncu CFU hücre içeren 100 mikrolitre EHEC bakterisini enjekte edin. Biyolüminesan hücreleri metin protokolüne göre görselleştirdikten sonra, yazılımın Edinme Kontrol Panelini açın.

Işıklayan, fotoğraf ve kaplamayı seçin. Pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. Ardından gruplamayı orta olarak ayarlayın.

F/stop'u lüminesans için bir, fotoğraf için sekiz olarak ayarlayın. F/stop, CCD dedektörü tarafından alınan ışık miktarını kontrol eder. Fare örnekleri görüntüleme için hazır olduğunda, görüntü almak için al'a tıklayın.

Alınan görüntü verilerini açın ve ardından araç paleti panelini açın. Görüntülerdeki biyolüminesan alanı tanımlamak için daire gibi ROI araçlarını seçin. Ardından, kalem simgesini kullanarak, yüzey biyolüminesans yoğunluğunu ölçmek için ROI'leri ölç'e tıklayın.

ROI ölçüm paneli ve nicelik değerleri görünecektir. Ardından, ROI ölçümleri panelinin sol köşesinde, gereken değerleri/bilgileri seçmek için ölçümü yapılandır'ı kullanın. Aksi takdirde, bu veri tablosunu dışa aktarmak ve csv dosyası olarak kaydetmek için Dışa Aktar'ı tıklayın.

Son olarak, csv dosyasında biyolüminesans yoğunluğu nicelemesi olarak toplam akı p/s sütununun değerlerini kullanın. Bu görüntüde gösterildiği gibi, EHEC aşılaması olarak adlandırılan biyolüminesans ile oral gavaja maruz kalan farelerde güçlü bir biyolüminesans sinyali görülmüştür. Bu şekilde, vahşi tip EHEC EDL933 olarak adlandırılan biyolüminesans ile aşılanan fareler, enfeksiyondan iki gün sonra bile yoğun biyolüminesan sinyaller gösterdi, bu da EHEC'in iki gün içinde konakçıları kolonize ettiğini düşündürdü.

Bununla birlikte, lipopolisakkaritlerde kusurları olan mutant bir E.coli ile enfekte olmuş fareler, bu farelerde daha az sayıda bakteri kolonize olduğunu veya hiç bakteri kolonize etmediğini düşündüren biyolüminesans göstermez. Biyolüminesans işaretli bakterileri lokalize etmek için, kurban edilen hayvanların bağırsakları ex vivo olarak görüntülendi. Biyolüminesans etiketli EHEC ile enfekte olmuş farelerden alınan organlar, çekum ve kolonda bu organlarda kolonizasyonu gösteren önemli bir biyolüminesans sinyali gösterdi.

Buna karşılık, bir LPS mutantı ile enfekte olmuş fareler, in vivo görüntü ile tutarlı olan bağırsak dokusunda azalmış biyolüminesans gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde EHEC kolonizasyonunu izlemek için IV sistemini kullanarak deneyin nasıl yürütüleceğini iyi anlamış olmalısınız.