Name: Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Keşfedin fare preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarını türetme protokolünü. Bu yöntem blastosist aşamasında yüksek verimlilikle çoğaltılabilir kök hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Jonatan Lucas besleyici hücre kültürü, Servei Estabulari de la UAB hayvan bakımı için ve Domènec video kayıt için Martín ile onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser "gayri resmi" de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R ve Generalitat de tarafından desteklenen Catalunya 2014 SGR-524. MVC PIF-UAB bursu yararlanıcı olduğunu.

Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hayvanlar kullanımı etik Komite, hayvan ve insan araştırma Universitat Autònoma de Barcelona ve Departament d tarafından onaylanıp &#39; tarımsal, Ramaderia, Pesco ben Alimentació Generalitat de Catalunya (iletişim kuralı #8741).
 1. Besleyici hücre Inactivation ve depolama Not: insan sünnet derisi fibroblastlar (HFF-1) daha önce dondurulmuş dondurma çözüm oluşan % 90'ı Fetal sığır Serum (FBS) ve % 10 Dimetil sülfoksit (1 mL DMSO) ve sıvı azot kadar kullanmak saklı.
<ol><li>37 ° C su banyosu şişede çeker tarafından HFF-1 (1 mL) kriyojenik bir şişe çözülme.</li>
	<li>Kriyojenik şişeyi çözdürülen içeriğini eklemek için Önceden ısıtılmış Dulbecco &#39; s modifiye kartal &#39; s orta (DMEM) % 10 ile desteklenmiş bir 1:10 yapmak FBS seyreltme.</li>
	<li>Bir T75 şişesi seyreltilmiş hücreleri (10 mL) tohum ve 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de kültür.</li>
	<li>Ertesi gün DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için orta değiştirin. Orta kaldırmak ve 10 mL % 10 ile desteklenmiş Önceden ısıtılmış DMEM ekleyin FBS.</li>
	<li>HFFs kültür ve kültür Konfluent sahne ulaşıncaya kadar her 48 h orta değiştirin. Bu yaklaşık 7-10 gün sürebilir.</li>
	<li>İnactivation çözüm hazırlamak, mitomycin C DMEM % 10 ile desteklenmiş sulandırmak için 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon, FBS. 37 ° C ve % 5 CO 2 3 h için inactivation çözüm hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>İnactivation çözümü kaldırmak ve 2 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (mitomycin C kalıntıları ortadan kaldırmak için HBSS) üç kez hücrelerle durulayın.</li>
	<li>Inaktif hücreleri ayırmak için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO 2 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Gözlemlemek müstakil olduklarından emin olmak için ters bir mikroskop altında hücreler (0.3 sayısal diyafram veya NA ile 10 x amaç). Eğer değillerse, onları birkaç dakika 37 ° C ve % 5 CO 2 için kuluçkaya. Yine ters mikroskop altında hücreleri denetleyin.</li>
	<li>Hücre kümeleri ayırmak için bir Pasteur pipet ile çözüm pipette.</li>
	<li>%10 FBS ve resuspend ile DMEM 4 mL ekleyerek enzimatik solüsyona nötralize.</li>
	<li>Bir aliquot hücre süspansiyon take ve HBSS içinde 1: 100 seyreltme. Hücre sayısını belirlemek için bir Neubauer seyreltme 10 µL yük &#39; s odası. Bir büyük kareler Odası (20 x amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında yer alan hücreleri saymak.
	<ol><li>Tekrar dört büyük kareler toplamda sayma. N (N) hücrelerinin sayısı toplam hesaplamak hücreleri ortalama sayısı = toplam hacim seyreltme x 10 4 x x sayılan.</li>
	</ol></li> <li>200 x g. atma, 5 min için örnek kalan süpernatant santrifüj kapasitesi ve çözüm mL başına 10 6 hücre bir konsantrasyon, dondurma ile Pelet resuspend.</li>
	<li>Aliquot 10 6 hücre (1 mL) ile kriyojenik şişeleri süspansiyon. Kriyojenik şişeleri bir dondurucu kapsayıcısına getirin ve-80 dondurma ° C.</li>
	<li>Ertesi gün, kriyojenik şişeleri sıvı azot depolamak.</li>
</ol> 2. Besleyici hücre kültür <ol><li>1-4 gün türetme işlemine başlamadan önce tezcan 1 x 10 6 içeren bir kriyojenik şişe su banyosu 37 hücrelerde HFF-1 inaktive olur ° C.</li>
	<li>1:6 seyreltme çözdürülen HFF-1'in önceden %10 FBS ve tutmak sıcaklığı 37 ile takıma DMEM sıcak yapmak ° C.</li>
	<li>Her şey bir 4-şey plaka 500 µL Önceden ısıtılmış % 0,2 jelatin domuz deri ile doldurmak ve 10 dakika süreyle 37 ° C'de plaka tutmak</li>
	<li>Jelatin 500 µL kuyulardan kaldırın ve HFFs seyreltme 500 µL ekleyin. Yavaşça HFFs kuyu dibinde bir tekdüze dağılım sağlamak için plaka rock. Dairesel hareketleri önlemek, aksi takdirde hücreleri iyi merkezinde odaklanacaktır.</li>
	<li>En az 24 saat her iyi Inaktif HFFs monolayer elde etmek için 37 ° C ve % 5 CO 2 s plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün (10 X amacı ile 0.3 NA) ters bir mikroskop altında hücreler gözlemlemek ve bağlı ve homojen dağıtılmış kontrol edin. Orta DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için değiştirin. Orta kaldırın ve Önceden ısıtılmış DMEM % 10 ile desteklenmiş 500 µL ekleyin FBS.</li>
</ol> 3. Embriyo toplama ve kültür <ol><li>dört gün öncesine embriyo koleksiyonu, yönetmek hamile kısrak 5 IU &#39; s serum gonadotropin 6-12 hafta yaşlı kadın farelere mayi enjeksiyonla. 
	Not: diğer fare suşları kadın-ebilmek var olmak kullanılmış olsa biz 129S2 veya B6CFAF1 suşları, kadın kullandık. Yine de, ne zaman sigara keyfi suşları (örneğin CBA), kadın ile orta çalışma takıma 2i ile adım 4.2 belirtildiği gibi.</li>
	<li>Sonra 48 h, insan Korionik gonadotropin 5 IU mayi enjeksiyonu ile yönetmek ve kadın erkek, en az 8 haftalık bir 1:1 oranında, dostum. Dişiler erkeklerin ertesi gün ayırın.</li>
	<li>Embriyo koleksiyonu, önceki gün 35-mm hücre kültürü Petri kabına KSOMaag orta sığır Serum Albumin (BSA) 4 mg/mL ile desteklenmiş çeşitli 40 µL damlaları ile hazırlamak ve plaka tamamen damla kapsayacak şekilde mineral yağ ile doldurun. Orta equilibrate için 37 ° C ve % 5 CO 2 çanak kuluçkaya.</li>
	<li>Embriyo manipülasyon Pipetler, hazırlamak için ısı uzun uçlu cam Pasteur pipet Bunsen burner kullanarak ince parçası. Yumuşak bir kez alev geri çekilin ve iki ucu ayır. İstenilen uzunlukta kesin. İç çapı uç-meli var olmak 100-150 µm.</li>
	<li>Servikal çıkığı 45-48 h mesaj coitum tarafından (PC) kadın fareler ötenazi.</li>
	<li>Eğri pürüzsüz keskin makas ile cilt ve karın zarını düz keskin makas ile kesme ile karın boşluğu ortaya çıkarmak için fareler incelemek. Bir rahim Forseps ile kapmak, düz keskin makas kullanarak ovidukt keser ve CZB Hepes tampon orta (HCZB) 13 37 yerleştirir ° C. diğer ovidukt kaldırmak için yineleme işleminin.</li>
	<li>Oviducts 1 mL şırınga ile yüklenen HCZB ile flush 2 hücreli embriyo toplamak için saatçi forseps tarafından yerinde düzenlenen. 
	Not: 30 G Hipodermik İğne reçeteye göre sarf iğne almak hazırlamak için sonunda kesti ve zemin bir Zımpara taşı künt bir ipucu için.</li>
	<li>Embriyo çekme ağzını pipet aparatı kullanıyorsanız, içinde HCZB yıkama onları ve onları önceden hazırlanmış embriyo kültür tabağına 37 ° C ve % 5 CO 2 blastosist aşaması kadar kültür. En fazla 50 embriyolar her 40 µL düşüş kültürlü olabilir. İzlemek embriyo gelişimi her 24 saat bir stereomicroscope altında. 
	Not: Alternatif olarak, embriyoların blastosist aşamada vitro embriyo kültürü kısaltmak için toplanabilir. Bu durumda, dişiler gün 3.5-4.5 p.c. ötenazi, rahim incelemek. ve HCZB ile flush.</li>
</ol> 4. Kök hücre elde edilmesini <ol><li>hazırlık türetme plakaların <ol><li>embriyo tohum, gün hazırlamak türetme orta DMEM orta 100 µM 2-β mercaptoethanol, 1 ile ilave tarafından x sigara-esansiyel Amino asitler , serum değiştirme ve 10 %20 3 U/mL LIF.</li>
		<li>İsterseniz, ayrıca MEK inhibitörü PD0325901 1 µM ve 3 öneki GSK3 inhibitörü CHIR99021 2i orta elde etmek için µM.</li>
		<li>4-şey plaka Inaktif HFFs (Adım 2.6) monolayer ile al kuluçka makinesi. Orta kaldırın ve her şey için Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL ekleyin. Plaka da kuluçka için iade.</li>
	</ol></li> <li>Zona pelusida kaldırma ve tohum embriyo <ol><li>bir 35 mm hücre kültürü Petri kabına asit Tyrode üç 30 µL damla ile hazırlamak &#39; s çözüm 14 ve türetme orta üç 30 µL damla. Damla mineral yağ ile kapak ve 37, çanak tutmak ° C.</li>
		<li>Embriyo kültürü bulaşık kuluçka makinesi alın. Birer birer, bir asit Tyrode kültür damla blastokistlerin transfer &#39; s çözüm açılan bir embriyo manipülasyon pipet kullanarak. Mümkünse, yalnızca genişletilmiş blastokistlerin türetme işlemini başlatmak için seçin.</li>
		<li>Monitör zona pelusida sindirim stereomicroscope altında. En kısa zamanda zona pelusida kaybolur, blastosist asit Tyrode yıkamak için bir türetme orta damla transfer &#39; s çözüm.</li>
		<li>Kuluçka ve tohum bir zona ücretsiz blastosist Besleyici üzerinde 4-şey türetme plaka hücreleri her kuyuya atın.</li>
		<li>Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür 37 ° C ve % 5 CO 2 4-şey türetme plaka dönmek.</li>
	</ol></li> <li>İzleme kök hücre büyüme ve orta değiştirmek <ol><li>kültürler her 24 h (20 X amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında izlemek. Kök hücre farklılaşması, akıbet çevreleyen veya bile besleyici hücreler bir kenara iterek şişmiş refraktif hücreleri gibi belirtileri olup olmadığını unutmamak gerekir.</li>
		<li>Her gün, kültür ortamı değiştirin. 4-şey plaka kuluçka, orta her kuyudan çıkarmak alıp LIF ve 2i, Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL kullandıysanız ekleyin. Outgrowths (6-8 gün) gözlenir kadar kültürü korumak.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kök hücre kültür ve bakım <ol><li>hazırla Kolle benzeri kolları ve kök hücre manipülasyon Pipetler. Takip adım kök hücre manipülasyon Pipetler ucundaki 250-300 µm. bir iç çapı ile hazırlamak için 3,4 Kolle benzeri tanıtıcı hazırlamak için çekti Pasteur pipet diğer parçası kullanın. Isı ve bir kanca almak kadar şekil.</li>
	<li>4-şey kültür plaka kuluçka makinesi dışarı almak ve bir stereomicroscope altında çıkıntı bulun. Farklılaşmış hücreler ve akıbet çevreleyen besleyiciler uzaklaştırmak için tutamacını kullanın. 
	Not: nihai sonucu farklılaşma önlemek için akıbet kenarından farklılaştırılmış hücrelerin tümünü kaldırmak öenmlidir.</li>
	<li>Yapılan bir kök hücre manipülasyon pipet ile Aspire edin ve yeni bir tabak içinde 50 µL tripsin-EDTA damla yerleştirebilirsiniz.</li>
	<li>Mekanik ve enzimatik disaggregate için çeşitli yerlerinde yapılan kesmek için bir neşter kullanın.</li>
	<li>Hemen, akıbet parçaları türetme orta tripsin eylem nötralize etmek için taze bir damla transfer.</li>
	<li>Çıkıntı parçaları besleyiciler monolayer ile yeni bir 4-şey plaka aktarın. İyi başına en çok 10 parça aktarmak ve onları türetme orta 37 ° C ve % 5 CO 2 ile kültür.</li>
	<li>Kurulan mESC satırı düşünmeden önce en az altı hafta için kök hücre benzeri kültürleri korumak. Her gün ve alt kültür orta değiştirmek onları haftada bir kez.</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

MESC satır türetme rutin olarak birçok laboratuvarlarda kullanılan iyi bilinen bir işlem olmakla birlikte, verimlilik her zaman pluripotency bakım rahatsız edemez Multipl faktörler nedeniyle beklendiği gibi yüksek değil. Mevcut makalede biz, adım adım, basit ve güvenilir bir iletişim kuralı kullanılarak yüksek verimliliği ile mESC satırları oluşturmak nasıl gösterir. Bu verimliliği literatürde bildirilen benzer.
Maksimum verimliliği sağlamak için hücreleri her gün kontrol etmek önemli ya da he...

Embriyonik kök hücreleri (ESC) yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar1altında ayırt etmek için korumak Preimplantasyon embriyo elde pluripotent hücreler vardır. Bu özelliklere dayalı, ESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları2için yararlı bir araç olmuştur.
ESC den türemiş olan ilk kez fare ESC (mESC) hatları düşük başarı3,4ile kaynaklanan Preimplantasyon fare embriyo. Yıllardır, türetme verimliliği pluripotency içinde vitromuhafaza zorluğu nedeniyle düşük kaldı. Ayrıca türetme verimliliği artırmak, besleyici hücreler5' varlığı koloni eki tanıtmak ve karyotip istikrar6, birçok değişikliği bir iyileşme pluripotency bakım iletişim kuralı müşteri adayının geliştirmek. MESC kültür orta7,8, embriyo 129S2 keyfi arka plan9 kullanımı için en önemli yanı sıra, lösemi inhibitör faktörü (LIF) vardı ve mESC ile takıma orta ile Kültür tanımlanan serum, potansiyel farklılaşma ücretsiz10faktörler. Daha yakın zamanlarda, kanıt zorlayıcı bir kokteyl mESC kültür (2i da bilinir) orta sinyal yollar iki küçük molekül modülatörler ilavesi pluripotency korumak en iyi olduğunu göstermiştir. MEK inhibitörü farklılaşma sinyalleri mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) yolu engelleyerek azaltır, PD0325901 ve GSK3β inhibitörü hücre sağkalım, düşük yoğunluklu geliştirir CHIR99021 2i kokteyl oluşur Wnt yolu11etkinleştirerek.
Bugünkü yazıda, verimli bir şekilde mESC satırları fare blastokistlerin türetmek için basit bir protokol açıklar. Standart prosedürler, keyfi suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan türetme orta LIF ve serum yerine12ile gelen embriyo kültürü takip ediyoruz. Bu iletişim kuralı, mESC çizgileri takip verimliliği 2i ortamda elde edilen eşdeğer ile elde edilebilir. Buna rağmen 2i sigara keyfi suşları ile çalışırken pluripotency bakım veya olası sorunlardan kaçınmak için eklenebilir.

<table><tbody><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu plaka</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Asidik Tiroz çözeltisi&nbsp;</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Nagy ve ark., 2003'te tarifine bakın. Kısa süreli depolama için (1 aya kadar) 4 ° C'de tutun. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için -20 ° C'de tutun. Çözeltinin etkinliği azalırsa, küçük bir damla HCl 1M ilavesiyle asitleştirilmelidir.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-Fare IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 seyreltme. Oct4, Tuj1, &alpha;SMA ve AFP fare antikorları için ikincil antikor.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Akson Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>1 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için her mg toz için 2.15 ml DMSO ile sulandırın. İstenilen hacimde alikotlayın ve -20 ° C'de saklayın. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının.</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Kullanmadan önce 56 ° C'de 30 dakika ısıtarak etkisiz hale getirin ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Yıkama iğnesi</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>İğnenin ucunu kesin ve aşındırıcı bir taş üzerinde künt bir uca kadar öğütün</td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Somuklu suda %0,2 oranında seyreltin ve otoklavlayın. Her seyreltme bir ay boyunca kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Moleküler Problar - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 seyreltme. Sox2 tavşan antikoru için ikincil antikor.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes tamponlu CZB&nbsp;</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>Chatot ve ark., 1989'daki bileşime bakın</td></tr><tr><td>İnsan koryonik gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>50 IU / ml'de% 0.9 NaCl içinde seyreltin. 1 ml'de aliquot ve -20&ordm'de saklayın; İki aya kadar C. Çözüldükten sonra tekrar donmayın.</td></tr><tr><td>İnsan sünnet derisi fibroblastları</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Uzun süreli depolama için sıvı azot içinde saklanması tavsiye edilir.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasman Ömrü</td><td>Teknolojileri</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>Işığa duyarlı. 10 ml gibi küçük hacimlerde alikot edilmesi ve -20 ° C'de saklanması tavsiye edilir; C (son kullanma tarihini kontrol edin). Donma ve çözülme döngülerinden kaçının. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Takviye Edici Gıda, 4 mg/ml BSA. 37&ordm'de dengeleyin; Kullanmadan önce C ve günde %5 CO2.</td></tr><tr><td>Lösemi İnhibitör Faktör</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Fareler&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>mESC türevi açısından izin verilen bir suştan (129S2 veya C57BL gibi) farelerin kullanılması önerilir. Bununla birlikte, akrabalı yetiştirme suşları, embriyo üreten daha az verimlidir. Bu nedenle, hibrit güçten yararlanmak için 129S2 x C57BL veya B6CBAF1 gibi hibrit bir suş kullanılması önerilir.</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embriyo test edilmiştir. Işığa duyarlı.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Tozu MilliQ su ile 0.5 mg / ml'de sulandırın. 4 &gtm'de saklayın; C ışıktan korunmuştur. Dikkat, zararlıdır ve kansere neden olduğundan şüphelenilir.</td></tr><tr><td>Fare anti-tubulin ve beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-&alfa;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-AFP</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB1368</td><td>1:50 seyreltme</td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti Oct3 / 4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 seyreltme</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>1 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için her mg toz için 2.08 ml DMSO ile sulandırın. İstenilen hacimde alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının.</td></tr><tr><td>Petri kabı (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Gebe kısrak serumu gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>50 IU / ml'de% 0.9 NaCl içinde seyreltin. 1 ml'de aliquot'layın ve -20 ° C'de saklayın; İki aya kadar C. Çözüldükten sonra tekrar donmayın.</td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>T75 şahin</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>1x çözelti elde etmek için HBSS'de 1:10 oranında seyreltin</td></tr></tbody></table>

fare preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Fare embriyonik kök hücre (mESC) türetme tarafından hangi pluripotent Preimplantasyon embriyoların hücre hatları kurulur işlemidir. Bu satırları yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar altında ayırt etmek için korur. Bu özellikleri nedeniyle, mESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları yararlı bir araç vardır. Bu makalede mESC hatları yüksek türetme verimliliği (% 60-80) ile elde etmek için basit bir protokol blastokistlerin keyfi fare suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan tanımlanmış orta lösemi inhibitör faktörü ile takıma gelen Kültür tarafından açıklanır. Protokol Ayrıca verimli bir şekilde mESC satırları keyfi fare suşları türetmek için iki küçük molekül inhibitörleri türetme orta (2i orta) bir kokteyl basit eklenmesiyle uygulanabilir. Hazırlık ve besleyici hücreler, toplama ve fare embriyolar ve türetme kültür ve kültür mESC satırlarının kültür üzerinde ayrıntılı yordamlar sağlanmaktadır. Bu iletişim kuralı özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir laboratuvar temel memeli hücre kültür uzmanlığı ile yapılabilir.

Bu iletişim kuralı üzerinde kültür (şekil 1A) ilk hafta sonra sonucu oluşumu % 95'i elde edilmelidir. Altı pasajlar sonra mESC satırlarının kurulması arasında deneysel çoğaltır, % 60-80 ortalama bir başarı ile değişkendir. 2i eklenmesi önemli ölçüde sonuçları 129S2 arka plan olanlar gibi keyfi fare suşları ile çalışırken yükseltmek değil ama sigara keyfi suşları ile çalışırken gereklidir.
Fare ESC k...

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Kök hücreler, uzun süreli kendilerini yenileme özellikleri ve belirli koşullar altında üç germ katmanından farklılaşmış hücreler oluşturma yetenekleriyle karakterize edilen pluripotent ve özelleşmiş hücrelerdir. Bu özellikleri nedeniyle kök hücreler; rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve hayvan mühendisliği alanlarında büyük bir potansiyele sahiptir. Yıllardır, araştırma amaçlı embriyonik kök hücre hatları temel olarak fare embriyolarından türetilmiştir, ancak genel olarak elde edilen türetme verimlilikleri düşük seyretmiştir.Bu videoda, 2i gibi sinyal yolu modülatörleri kullanıldığında elde edilen verimliliklerle karşılaştırılabilir düzeyde, makul derecede yüksek türetme verimlilikleri sağlayan standart koşullar kullanarak fare embriyonik kök hücre hatlarının türetilmesi için basit bir protokol gösteriyoruz. Bu protokolde, ESC türetimi ve kültürü için besleyici hücreler olarak insan sünnet derisi fibroblastlarını kullanacağız. ESC türetme işlemine başlamadan önce besleyici hücrelerin inaktive edilmesi gerekmektedir.İlk olarak, sıvı azot içerisinde saklanan insan sünnet derisi fibroblastlarının bulunduğu kriyojenik bir tüp alın ve tüpü 37 °C'deki bir su banyosuna daldırarak çözdür

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Erişkin farelerin spermatogoniumların ve progenitör hücre hatları türetmek ve korumak için basit bir yöntem sunulmuştur. Yöntemi yetişkin fare testis somatik hücre bölmesi kaynaklanan besleyici hücreler kullanır. Bu teknik transgenik, knock-out dahil, ortak fare suşları, uygulanabilir ve knock-fareler.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

Son yıllarda, in vitro kültür yöntemler kullanılarak germ hücre oluşumunu somatik kök hücrelerin birkaç farklı türde kullanılarak gösterilmiştir. Bu makale, görsel erken oosit benzeri hücrelere yeni doğan fare edilen kök hücrelerin farklılaşma sunacak.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Keşfedin fare preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarını türetme protokolünü. Bu yöntem blastosist aşamasında yüksek verimlilikle çoğaltılabilir kök hücre elde edilmesini sağlar.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Daha fazla video keşfet