Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Bu Drosophila beyin diseksiyon protokolünün genel amacı, immünofloresan, GFP etiketli protein lokalizasyonu ve ex-vivo kültür deneyleri gibi çok çeşitli uygulamalarda kullanılabilen yetişkin sineklerden sağlam beyinler elde etmektir. Bu yöntem, belirli proteinlerin ve sinyal yollarının rolleri ve beyin gelişimi sırasında nöronal bağlantı kalıpları oluşturma gibi gelişimsel biyoloji ve sinirbilim alanlarındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir kez ustalaştıktan sonra, yetişkin beyninin belirli bölgelerindeki morfolojik kusurları immünolojik olarak tanımlamak için hızlı ve etkili bir yöntem sağlamasıdır.

Bu prosedürün öğrenilmesi zor olabilir, çünkü dış iskeleti sinek kafasından çıkarmak çok fazla özen ve pratik gerektirebilir. Hareketleriniz yavaş ve kasıtlı olmalı ve sabit kalabilmek için dissektörün kolları iyi desteklenmelidir. Gerçek deneyler için ilgilenilen genotipleri gerçekten incelemeden önce kırmızı gözlü sinekler ve ardından beyaz gözlü sinekler üzerinde pratik yapmak iyi bir fikirdir.

Diseksiyonu ayarlamak için, anestezi uygulanmış ilgili sinekleri soğuk bir metal ped üzerine veya buz üzerinde oturan bir Petri kabına yerleştirin. Alternatif olarak, karbondioksit yayan bir sineklik kullanın. Daha sonra, bir PTN balonu oluşturmak için diseksiyon kabının ortasına az miktarda PTN yerleştirin.

Ardından, bir stereo mikroskop altında, görüş alanını düzgün aydınlatma altında PTN kabarcığı ile doldurun. Şimdi, sinekleri göbek atacak şekilde manipüle edin ve birini karından PTN'ye aktarın. Hayvanı tamamen PTN'ye batırın ve tüm diseksiyonu PTN'ye batırılmış olarak gerçekleştirin.

İkinci bir forseps çifti ile hortumu kavrayın ve kafayı vücuttan çekin. Bazen, hortum çıkarılacak, ancak kafa vücuda bağlı kalacaktır. Bu meydana gelirse, bir retinanın medial kenarını tutun ve başı çıkarmak için yanal kuvvet uygulayın.

Karın ve göğüs kafesi atın. Bu adım sırasında başın PTN'de tutulması çok önemlidir. Merkezi beyinden VNC'ye olan bağlantılar bu yöntem kullanılarak açıkça analiz edilemez.

Daha sonra, kütiküldeki merkezi deliğin kenarında sol retinanın medial kenarını kavrayın ve beyaz, lifli trakea ile kaplı opak yapı olan optik lobun yırtılmasını önlemek için forsepsleri doğrudan birbirinden yavaşça çekin. Retina ayrıştıkça, gerginlikte hafif bir azalma olacaktır. Beynin yırtılmasını önlemek için, her bir gözün medial kenarını kavramak ve forsepsleri çok yavaş bir şekilde ayırmak kritik derecede önemlidir.

Çok hızlı hareket etmek, beyin morfolojisinin değişmesine veya beyin dokusunun hasar görmesine neden olabilir. Burada gösterildiği gibi, kütikülü her bir forseps çifti ile kavrayın ve çok yavaş bir şekilde zıt yönlerde çekin. Doğru yapılırsa, kütikül beyin dokusundan ayrılmalı ve beyni sağlam bırakmalıdır.

Bu adım için çok keskin forsepslere ihtiyaç vardır. Ardından, çevredeki kütikülü parça parça dikkatlice çıkarın. İnatla takılan kütikülü çıkarırken, beynin ezilmesini önlemek için kalan VNC'yi kavrayarak beynin güvenliğini sağlamaya yardımcı olabilir.

Son olarak, disseke edilmiş beyinleri fiksasyon ve immün boyama için PTN ile doldurulmuş bir plakanın kuyusuna aktarmak için bir P200 pipeti kullanın. Mikroskop altında, aynı genotipin 10 ila 15 disseke edilmiş beyni, PTN içinde seyreltilmiş %4 paraformaldehit ile doldurulmuş 0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir P200 pipeti kullanın. Ardından, beyinleri oda sıcaklığında yavaşça sallayarak 20 dakika kuluçkaya yatırın.

Fiksasyonun ardından, beynin tüpün dibine yerleşmesine izin verin, ardından fiksatifi çıkarın. Ardından, yıkama başına 500 mikrolitre PTN ile iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Beyinler tüpe yerleşir yerleşmez PTN'yi değiştirin.

Daha sonra, oda sıcaklığında hafif çalkalama kullanarak PTN ile üç uzun yıkama yapın. Bu yıkamaları takiben, beyinler PTN'de gece boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Son PTN yıkamasını çıkardıktan sonra, beyinleri oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca 0,5 mililitre bloke edici solüsyonda ve hafif çalkalama ile inkübe edin.

Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikorları ekleyin ve beyinleri hafif çalkalama ile iki gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Beş yıkama PTN yıkama alayını kullanarak birincil antikoru çıkarın. Ve sonra, ikincil antikorları uygulayın.

Bu antikorların, sallanma ile ışıktan korunurken oda sıcaklığında üç saat boyunca dokularla inkübe etmesine izin verin. Beyinleri ikincil antikor çözeltisinde inkübe ettikten sonra, PTN yıkama alayını uygulayın. Her yıkamadan sonra numuneleri folyo ile kaplayın ve mümkün olduğunca fazla tampon çıkararak bitirin.

Ardından, 75 mikrolitre floresan solmaya karşı önleyici montaj ortamı ekleyin ve beyinleri ve ortamı pipet ucunun içine ve dışına yalnızca bir kez akıtın. Tüp daha sonra folyoya sarılabilir ve birkaç gün boyunca dört santigrat derecede saklanabilir, ancak ideal olarak doğrudan montaja devam edin. Beyinleri monte etmek için bir köprü kaydırağı oluşturun.

Pozitif yüklü bir kızak üzerine yaklaşık 1 santimetre aralıklarla iki taban kapağı kızağı yerleştirin. Pozitif yüklü tarafın yukarı baktığından emin olun. Ardından, kapak fişlerini tırnak cilası ile slayta yapıştırın ve devam etmeden önce cilanın tamamen kurumasını bekleyin.

Ardından, slaytı bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve beyinleri ve ortamı kapak fişleri arasındaki boşluğa pipetleyin. Beynin görselleştirilmesini iyileştirmek için aydınlatmayı ayarladığınızdan emin olun. Ardından, beyinlerden kaçınmaya dikkat ederek ekstra montaj ortamını slayttan aspire edin.

Ardından, kalan fazla montaj ortamını fitilleyin. Bu, beyinlerin daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır. Şimdi, forseps kullanarak, beyinleri anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzenine yönlendirin.

Ardından, beyinlerin üzerine bir kapak astarı yerleştirin ve alt kapak fişlerine takılan üst kapak fişinin kenarlarını kapatmak için tırnak cilası kullanın. Şimdi, orta boşluğu yeni montaj ortamıyla damla damla doldurun ve ortamın kılcal hareket ile kapak kaymasının altına çekilmesine izin verin. Boşluk dolduğunda, şeffaf tırnak cilası kullanarak tamamen kapatın.

Açıklanan yöntem, mantar gövdeleri de dahil olmak üzere yetişkin beynindeki hemen hemen her yapıyı görselleştirmek için kullanılabilir. Beynin bu bölgesi öğrenme ve hafıza için gereklidir. Mantar gövdeleri, fasikülin 2 proteinini tanıyan antikorlar kullanılarak kolayca görüntülenebilir.

Bu protein, alfa ve beta loblarında ve ayrıca merkezi olarak bulunan elipsoid gövdede yüksek oranda eksprese edilir. Bu teknik, mantar cisimciği nöronlarının uygun akson rehberliği için gerekli olan çoklu hücresel süreçlerin tanımlanmasına izin vermiştir. Bu süreçlerin bozulması, beynin orta hat bölgesi boyunca uygunsuz akson projeksiyonu ve eksik alfa lobları gibi çok çeşitli mutant fenotiplere neden olur.

Bu mutant fenotipler genellikle tam olarak nüfuz edemez ve bu nedenle birden fazla beynin incelenmesini gerektirir. Bir proteinin akson yol bulmadaki özerk rolünü incelemek için, Markham tekniği, floresan olmayan vahşi tip bir arka planda bireysel GFP pozitif mutant veya vahşi tip nöronların akson rehberlik kararlarını görselleştirmek için de kullanılabilir. Burada açıklanan yöntem, yetişkin Drosophila beyninin sanal bölgesinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

Burada mantar vücut nöronlarına odaklandık. Bu protokolün metin versiyonunda, optik lobların görselleştirilmesini de gösterdik. Diğer çalışmalar, diğerlerinin yanı sıra pars intercerebralis, saat nöronları ve anten lob projeksiyon nöronlarını görselleştirmek için benzer teknikler kullanmıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa her beyin 3 ila 5 dakika içinde diseke edilebilir. Bu prosedürü denerken, kollarınızı mikroskobun yanında sabitlemeyi unutmamak önemlidir. Yavaş hareket etmek ve küçük kütikül parçalarını teker teker çıkarmak da önemlidir.

Çok hızlı hareket etmek, altta yatan beyin dokusunda istenmeyen hasara neden olabilir. İmmünofloresan bazlı mikroskopi deneyleri için disseke edilmiş beyinlerin kullanılmasına ek olarak, beyin dokusu ek deneyler için de kullanılabilir.