Name: Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin yetişkin Drosophila melanogaster beyin diseksiyonu ve immünfloresan boyama yöntemlerini. Bu teknik, nöronal gelişim ve bağlantı kalıplarını incelemek için hızlı ve güvenilir bir kaynak sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Changhui Pak ve Alysia Vrailas Mortimer başlangıçta beyin diseksiyonu tekniği SMK verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Ken Moberg'ın laboratuar grubunun üyeleri, özellikle Chris mermi, eleştirel yazının okumak için teşekkür ederiz. Fas2 tanıma antikorlar (1 d 4) ve chaoptin (24B10) gelişim çalışmaları Hibridoma bankadan elde. Antikor 24B10 Seymour Benzer ve Nansi Colley24tarafından,60,61DSHB için yatırılır, antikor 1 d 4 için DSHB Corey Goodman 22,23,56tarafından yatırılır. Sinek stokları Bloomington hisse senedi merkezden elde edilmiştir. Ayrıca Ohio tarımsal araştırma ve Geliştirme Merkezi (OARDC) MCIC görüntüleme Merkezi confocal mikroskop kullanımı için şekil 4A beyinlerinde görüntü için teşekkür etmek istiyorum ve B. SMK NICHD hibe tarafından desteklenmektedir (1 R15 HD084241-01A1).

1. drosophila melanogaster genetik ve isteğe bağlı ısı şok yordamlar
<ol><li>Bir kez sinekler geçti ve F1 döl yumurtadan, kadın ve/veya uygun genotip erkek elde edilir. Soruşturma altında beyin bölgesi bağlı olarak sinekler her gün toplanması ve böylece beyin bağlantısı yaş bağımlı ve/veya cinsel şekilli desen daha kolay ayırt edilebilir seks tarafından ayrılmış. 
	Not: İsteğe bağlı: sinekler bir Repressible hücre işaretçisi (MARCM) analizi 12 , 47, embriyo, larvaları ile mozaik analiz için kullanılmaktadır, ya da pupa ısı 30-45 dk 37 ° C'de şok olmalı Mitotik rekombinasyon neden. MARCM analiz için mantar organlarının belirli bölgeleri hedeflemek için şekil 5 ' te B ana hatlarıyla ve 12 tarafından belirlenen zamanlamaya göre ısı şok zaman. MARCM beyin bölgeleri mantar organları dışında araştırmak için kullanılıyorsa, pilot deneyler ısı şok olmak en iyi sahne belirlemek için yapılmalıdır. Belgili tanımlık merdiven aşağı konuda yazılmış olsa da eclosed uçar, pharate yetişkin de disseke pupa durum kaldırıldıktan sonra aşağıdaki adımları kullanarak.</li>
</ol> 2. Diseksiyon istasyonu hazırlık <ol><li>stereomicroscope ve ışık kaynağı ile konum bağlı fiber optik goosenecks üzerinde büyük bir benchtop. Sürekli el hareketleri teşvik etmek ve azaltmak el &#34; sallamak &#34; diseksiyon sırasında yeterli el ve kol dinlenme alanı mevcuttur mikroskop için önemlidir. Mikroskop ve 4-6 inç mikroskop Bankası tezgah kenarı arasındaki iki tarafında yaklaşık 8-10 inç olduğundan emin olun.</li>
	Bir cam <li>dolgu 2 veya 3 Kuyu PTN arabelleği 1.0 mL ile 9-şey veya 3-iyi yemek (0.1 M sodyum fosfat tampon pH 7.2, % 0,1 Nonyonik yüzey aktif, tam arabellek bileşenleri için malzemeler tabloya bakınız) ve yer yanında bulunuyor parçalanmış buz üzerinde. Yeni disseke beyin bu yemek için transfer ve fiksasyon adım kadar saklı.
	<ol><li>Not: canlı görüntüleme gerekiyorsa, diseksiyon arabellek fosfat tamponlu tuz (PBS) veya HL3 arabellek 48 x 1 olmalıdır. İntraselüler protein yerelleştirme gerekiyorsa, PBS de alternatif bir tampon olarak diseksiyon ve fiksasyon için kullanılabilir. Fiksasyon, hücre zarları permeabilization sonra gerçekleştirilmesi PTN yıkar %0,1 veya % 0,3 Noniyonik deterjan içeren kullanarak.</li>
		<li>PBS diseksiyonu ve fiksasyon için kullandıysanız, pipet ipuçları deterjan içeren bir arabellek (örneğin PTN) ile durulanır en az bir kez beyin microcentrifuge tüpler transfer sırasında plastik pipet ipuçları yapışmasını önlemek için olmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Bir boş 35 mm cam veya plastik petri dish, kullanarak oluşturmak bir silikon elastomer içeren bir diseksiyon yemek. Kısaca, üretici göre elastomer bileşenleri karıştırmak &#39; s yön, 35 mm yemeklerin dökün ve bir gecede düz bir yüzeye polimerize sağlar. Diseksiyon yemekleri içeren elastomer forseps forseps ve bir cam tabak gibi sert bir yüzeye arasında iletişim yapılırsa hangi kolayca hasar görebilir, anatomi iyi ipuçları korumak için kullanılır. Biz de düzenli olarak online perakendecilerin ticari olarak mevcut silikon kaplı yemekleri satın alma. Inaktif kömür (ve böylece renkli siyah) içeren silikon elastomer diseksiyon yemekleri kontrast diseksiyonu sırasında artırmak için özellikle yararlı.</li>
</ol> 3. Yetişkin beyin diseksiyon yordam <ol><li>Anesthetize 3-5 gün eski yetişkin D. melanogaster CO 2 ile veya kullanarak buz. Buz kullanılıyorsa, sinekler baş aşağı içeren flakon (Tak son aşağı) içine buz kovası ~ 5 dk. şişe buz baş aşağı koyarak engeller yer gıda teslim olma uçar. Bir kez sinekler anestezi, sinekler üzerinde bir soğuk metal yüzey veya petri kabına oturan buz veya sinek pad yayan bir CO 2 yerleştirin. Eğer ateş analiz etmek için beyni anatomi, büyük sinekler de kullanılabilir.</li>
	<li>PTN oluşturmak için bir transfer pipet veya p200 pipet kullanarak diseksiyon çanak merkezinde, küçük bir miktar (150-200 µL) yer bir &#34; kabarcık &#34; PTN in. Stereomicroscope altında diseksiyon tabak yerleştirin ve aydınlatma ayarlayın ve böylece PTN balonu görüş alanı doldurur ve düzgün aydınlatılmış odaklanmak.</li>
	<li>Böylece onlar işlemek sinekler &#34; kadar göbek &#34; (Yani, ventral tarafı yukarı) metal veya CO 2 yastık üzerinde yatarken.</li>
	<li>Kullanarak bir çift #5 forseps, kavramak disseke ve anında tutun tutmak tamamen bu PTN diseksiyon çanak üzerinde daldırın için bir sinek karın. 
	Not: baş PTN içinde sular altında iken protokol geri kalanı için tüm adımlar gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>#5 forseps ikinci bir çifti kullanarak, sinek hortum Bankası kavrayın ve forseps ayrı vücuttan sinek kafa ayırmak için iki çift çekin. Karın ve göğüs atmak. Bu adım sırasında bu kafa değil serbest bırakmak ve PTN yüzeyinde gezmek için izin önemlidir. Bir kez başından yüzen, yine beyin ezme olmadan kavramak zor olabilir. 
	Not: Bu yöntemi kullanarak, beyin ve ventral sinir kablosu arasındaki bağlantıları kopmuş. MSS bu bölgeler arasındaki sağlam bağlantıları gerekliyse, 49 , 50 gibi bir alternatif diseksiyon protokolü takip edilmelidir. Baş kaldırılmadan önce hortum sinek baştan çıkarır, hortum neredeydi bir delik olacak. Bu durumda, bir eye yakınındaki deliğin kenarında sinek kafa kavramak. Sonra başından forseps dışında bir başka iki çift kablolarıylaberaber orta miktarda güç kullanarak kaldırın. Bazen, kafa vücuttan çıkarıldığı zaman, gut ve/veya ventral sinir kordonu kalır kafasına bağlı ve diseksiyon devam etmeden önce kaldırılması gerektiğini.</li>
	Forseps bir çift hortum kavrıyor ise <li>, ikinci çift şu sinek göz medial kenarı kavramak gerekir. Yavaş yavaş, bir başka dışında forseps çek. Bu adımı sabit yanal kuvvet küçük bir miktar ile yapılmalıdır. Forseps yavaş yavaş dışında bir başka hareket ettirdiğinizde, hortum uzak kafanı çıkar ve merkezi bir delik kafa kütikül oluşturmanız gerekir. İkinci Çift sağ gözünden medial kısmı bırakmadan forseps ilk çifti ile hortum atın. 
	Not: Yetişkin D. melanogaster beynidir Kaudal (Yani, arka/arka) bölgesinin sinek. Böylece, o bölgesinin açgözlü kaçınılmalıdır. İdeal olarak, yalnızca rostral (Yani, açık) medial retina yakınındaki baş kısmını doğrudan kavradı tarafından forseps. Beyin ve ilişkili Trakea artık manikür orta delikten görünür olmalıdır. Şu anda, delikten nefes borusu çıkıntılı herhangi bir beyaz kılçıklı konu kaldırıldı ve atılan.</li>
	<li>(Baş kütikül Merkez delik kenarındaki) sol retina medial kenarı forseps ikinci çifti ile kavramak. Retina ve ilişkili kütikül kaldırmak için yavaş yavaş birbirlerine uzak forseps 180 ° açıyla çekin. Retina temel optik LOB ayrışıp gibi gerilim hafif bir düşüş hissetmeniz gerekir. Yavaş yavaş optik LOB yırtılma önlemek için devam. 
	Not: forseps, çok hızlı bir şekilde bu adımı sırasında ayıran th yırtılma sonuçlanabilire optik LOB veya kesintileri mantar vücut yapıları. Zaman zaman, manikür kaldırılacak ancak retina adet optik LOB bağlı kalır. Mantar cesetleri Imaging, tüm retina kaldırmak gerekli değildir. Ancak, diğer beyin bölgeleri (gibi retina nöron innervasyon optik beyin LOB) analizini 48 , 51 tarafından açıklandığı gibi tamamen kaldırılacak retina gerektirebilir. 
	Not: retina yavaş yavaş beynin temel optik LOB ayrılır, optik LOB observable beyaz, kılçıklı trake ile kaplı bir opak beyaz yapısı olarak olmalıdır. Bir retina kaldırıldıktan sonra göz ardı. Kılavuz retina nöronların analiz ederken, belirli bu adımı sırasında optik lobe hasarı önlemek için özen gösterilmelidir. Ek bir protokol diseksiyon üzerinde duruldu ve canlı görüntüleme photoreceptor nöron da kullanılabilir 48.</li>
	<li>Şimdi, dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca görünür Trakea daha fazla çıkarın. Trakea zaten içeriyor veya daha sonra hava, float ve büyük olasılıkla, daha sonra immunostaining adımları sırasında kayıp beyin neden ile doldurun. Trakea kaldırmak için #5 forseps çok keskin bir çift kullanarak beyin off al.</li>
	<li>Kalan retina ve çevresindeki kütikül sol sinek retina medial bölge kavramak için her iki çift forseps kullanarak kaldırın. Dikkatle retina retina ve kütikül parçalarını kaldırmak için ikiye gözyaşı. Bazı durumlarda, özellikle zorlu beyin ezme olmadan kalan kütikül kaldırma kanıtlıyor. Bu gibi durumlarda, forseps diğer çifti dikkatle manikür sonunu kaldırmak için kullanıldığı gibi ventral sinir kordonu kalan ipliklerini yerine forseps bir çift tarafından anlaşılacak bulduk.</li>
	<li>P200 pipet hareket ettirmek istimal disseke beyin PTN içeren 9 - veya 3-da yemek bir şey için. Aynı genotip beyinlerinin de aynı birlikte havuza alınmış ve buz tuttu. Beyin dokusu diseksiyon bir saat içinde sabit olmalıdır. Beyni küçük gruplar halinde sabit ve beyin daha çok sayıda gerekliyse havuza alınmış. Birçok durumda, deneyimli bir araştırmacı genellikle bir beynini incelememize ve cam koleksiyonu çanak yaklaşık 3-5 dak transfer</li>
</ol> 4. Fiksasyon ve immünfloresan boyama prosedürü <ol><li>p200 pipet kullanarak, disseke beyin PTN içinde seyreltilmiş %4 paraformaldehyde 0.5 mL ile dolu bir 0.5 mL microcentrifuge Tube 9-iyi yemek transfer. Aynı genotip beyinlerinin en az 10-15 bir microcentrifuge tüp içine birleştirilebilir. 0.5 ml microcentrifuge tüplerde (kadar beyin slaytlar üzerine montajı) tüm kalan adımları tamamlanır. 
	Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) bir duman mahallede ele alınmalıdır. İngiltere'de yılın atık kaydedilir ve düzgün pislikleri atmak için kullanmamıştım. cam ampul içinde satın alınan % 20 paraformaldehyde microcentrifuge tüpler içine bölünmemeli ve saklı-20 ° c kadar gerekli olabilir.</li>
	<li>Bir duman başlık içinde oda sıcaklığında sallanan yavaş hızı ile %4 paraformaldehyde 20 dk için beyinlerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Fiksasyon beyin yerçekimi tarafından microcentrifuge tüp altına yerleşmek izin. 
	Not: Bazen, beyin microcentrifuge tüp tarafına yapışabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, yanal başparmak ve işaret parmağı arasında tüp döndürmek veya tüp beyni batan tanıtmak için tezgah üzerinde hafifçe dokunun genellikle yardımcı olur.</li>
	<li>Kaldır sabitleştirici bir p1000 kullanarak pipet ve iki gerçekleştirmek &#34; hızlı &#34; yıkar 500 µL PTN, beyin yıkama arasında microcentrifuge tüp altına yerleşmek izin ile. Tüm beyin tarafından yerçekimi microcentrifuge tüp altına yerleşmiş bir kez bu hızlı yıkama sırasında PTN hemen taze arabelleği için değiştirilebilir; hiçbir ek yıkama zamanı gereklidir. 
	Not: Genellikle, tüpe ilave arabellek bırakarak beyin kaldırma riske için tercih edilir. Pipet ucu dikkatli muayene genellikle beyinsiz tüp sizden yanlışlıkla kaldırılmıştır emin olmak için gereklidir. Beyin belgili tanımlık uç pipetted kaza olması gerekir, onları geri microcentrifuge tüpüne dağıtmak, yerleşmeye beynim bekleyin ve kalır herhangi bir ilave PTN kaldırmaya devam.</li>
	<li>Son hızlı yıkama sonra üç gerçekleştirmek için p1000 pipet kullanın &#34; uzun &#34; yıkar: bir rock'çı / nutator üzerinde oda sıcaklığında PTN ve yıkama 20 dk için 500 µL ekleyin. Gelecekteki tüm &#34; uzun &#34; yıkar 20 dakika için olmalıdır. 
	Not: Bu yıkar, beyin sabit takip gecede PTN 4 ° C'de depolanmış olabilir.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak son yıkama kaldırmak ve kuluçkaya beyin bir rocker veya nutator, oda sıcaklığında en az 30 dakika oda sıcaklığında için çözüm [PTN + % 5 normal keçi serum (NGS)] engelleme 0.5 ml.
	<ol><li>Keçi ikincil antikorlar sonraki Protokolü adımda kullanılacak. Başka bir tür ikincil antikorlar kullanılacaksa bu tür (yerine NGS) normal serum engelleme ve antikor çözümlerinde kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>P1000 pipet kullanarak, engelleme çözüm kaldırın ve PTN (PTN + %5 NGS + seyreltilmiş birincil antikor) seyreltilmiş birincil antikor ekleyin. Birincil bir antikor ilk kez kullanırken, bu antikor en uygun seyreltme ampirik olarak tespit edilmelidir. 
	Not: mantar vücut nöronlar görüntülenmesi için Fas2 tanıma antikorlar genellikle kullanılır. Bu antikorlar antikor 1 d 4 gelişim çalışmaları Hibridoma banka (DSHB) üzerinden kullanılabilir ve sulandırılmış 1:20 PTN + % 5 olmalıdır NGS. 
	Not: photoreceptor nöronlar görüntülenmesi için chaoptin tanıma antikorlar genellikle kullanılır. Chaoptin antikor DSHB antikor 24B10 olarak kullanılabilir ve sulandırılmış 1:20 PTN + % 5 olmalıdır NGS. 
	Not: Fiksasyon işlemi genellikle floresan yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan protein üzerinden ortadan kaldırır. Bu nedenle, MARCM aksonal rehberlik bireysel MB nöronların analiz etmek için kullanırken, GFP tanıma bir antikor kullanın.</li>
	<li>2-3 gece 4 birincil antikor çözüm üzerinde bir rocker/nutator beyinlerinde kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Beyin microcentrifuge tüp altına yerleşmek ve birincil antikor çözümü kaldırmak birincil antikorlar ile kuluçka izin.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak yerine 2 &#34; hızlı &#34; yıkama ve 3 &#34; uzun &#34; 20 dk adımları 4.4 ve 4.5 yukarıda açıklandığı gibi PTN 0.5 mL ile yıkar, dikkatli bir şekilde izin microcentrifuge tüp her yıkama arasında altına yerçekimi tarafından yerleşmek beyin</li>
	<li>Incubate beyin fluorescently etiketli uygun ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında 3 h için. İkincil antikorlar genellikle seyreltilmiş 0.5 mL PTN + % 5, 1: 200 bir konsantrasyon NGS. 
	Not: floresan ikincil antikorlar ekledikten sonra beyin deneme geri kalanı için karanlıkta tutulmalıdır. 
	Not: benzer uyarma/emisyon dalga boylarında GFP sahip bir fluorophore ile etiketli bir ikincil antikor kullanmak için tavsiye MARCM çözümleme işlemi sırasında büyük kalıntı GFP Floresans kalır içinde (örneğin, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) veya Alexa488).</li>
	<li>İkincil antikor kuluçka, takip izin microcentrifuge tüp altına yerleşmek ve ikincil antikor çözümü kaldırmak beyin.</li>
	<li>Gerçekleştirmek 2 &#34; hızlı &#34; yıkama ve 3 &#34; uzun &#34; 20 dk adımları 4.4 ve 4.5 yukarıda açıklandığı gibi PTN 0.5 mL ile yıkar, dikkatli bir şekilde izin microcentrifuge tüp her yıkama arasında alt yerleşmek beyin</li>
	<li>Üçüncü takip &#34; uzun &#34; 20 dk yıkama, kullanım mümkün olduğunca fazla arabellek kaldırmak için p200 pipet.</li>
	<li>Ekleyin 75 µL floresan Anti-fade in montaj orta beyin ve. Pipet beyin ve montaj orta içine karıştırmak için bir kez pipet ucu. Beyin kap veya microcentrifuge tüp kısımlarına sıkışmış beri tüp ters değil. 
	Not: süspansiyon montaj orta beyin, tüpler olabilir fluorophore Şoklama yavaşlatmak için alüminyum folyo sarılı ve gecede 4 ° C'de depolanan. Gerekli, beyin birkaç gün 4 ° C'de depolanan Eğer, ama ideal olarak en kısa zamanda slaytlar monte edilmelidir.</li>
</ol> 5. Yetişkin D. melanogaster beyin mikroskop slaytlar ve görüntüleme üzerine montaj <ol><li>Yapı bir &#34; Köprüsü &#34; slayt. İki pozisyon &#34; temel &#34; coverslips yaklaşık 1 cm pozitif yüklü bir slayt üzerinde ayrı. Slaydın pozitif yüklü yan bakan emin olun. Coverslips tırnak Lehçe içeren şekil 3 ' te A gösterilen uygun. Ortam takma altında bu temel kapak paket fişi fitil değil emin olmak için tırnak Lehçe ile temel her kapak notu üç dış kenarlarını mühür genellikle yararlıdır. Tırnak Lehçe tamamen kuru izin (10-15 dk) devam etmeden önce.</li>
	<li>Stereomicroscope altında slayt yerleştirin ve iki coverslips arasındaki boşluğa disseke beyin içeren montaj medya çözüm pipette. Daha fazla karşıtlık sağlamak için böylece tezgah üstü paralel boynu ışıklar manevra yararlıdır.</li>
	<li>Beyin slaydın dışına pipette değil dikkatli ekstra bir pipet kullanarak slayttan ortam takma kaldır.</li>
	<li>Fitil uzakta ilave montaj medya. Bu beyin daha doğrusu sonraki adımı sırasında konumlandırılmış olması izin verir.</li>
	<li>Forseps ve stereomicroscope bir çift kullanarak beyin antennal loblar yukarıya bakan ile ızgara desen slaytta getirin</li>
	<li>Yer bir kapak kayma (&#34; Köprüsü &#34;) beyin ( şekil 3 A) bitti. Nerede onlar iletişim köprüsü kapak notu kenarlarında imzalamaya tırnak Lehçe kullanmak &#34; temel &#34; kapak notları.</li>
	<li>P200 pipet kullanarak yavaş yavaş taze montaj medya ( şekil 3 B) ile köprü altında Merkezi boşluğu doldurmak. Merkezi coverslip açık kenarında bir seferde bir damla yerleştirin ve montaj medya merkezi Köprüsü coverslip altında fitil sağlar. Ortam, takma ile tüm boşluğu doldurulana kadar devam sonra mühür üst ve alt açık tırnak boyasıyla.</li>
	<li>Kez tırnak Lehçe kuru, slaytları hemen görüntü veya mağaza lightproof sıkı slayt kutusunda, -20 ° c</li>
	<li>Bir hafta içinde beyni uyarma lazerler ile lazer tarama confocal mikroskop kullanarak görüntü ve filtre küpleri için seçilen ikincil floresan antikor uygun. Z-yığın görüntüleri mantar vücut nöronların genellikle 20 X veya 40 X hedefleri kullanarak elde edilir. Görüntüleme retina photoreceptor nöron daha yüksek büyütme gerektirebilir.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Yukarıda açıklanan diseksiyon ve görselleştirme yöntemi immunostaining çok çeşitli olarak kullanılabilir ve düşsel kullanma yaşamak. Biz bir genel immunostaining protokol belirttiğimiz ve MARCM içinde bireysel mantar vücut nöronların aksonal Morfoloji görselleştirmek için kullanılabilir bir yol çizer. Ayrıca, bu genel yordamları da diğer beyin bölgeleri sabit içinde görüntüleme için kullanılabilir veya taze disseke yetişkin48,65beyin. Canlı görüntüleme ifade desenleri artırıcı tuzakları, muhabir gen veya mimik çizgileri66, örneğin analiz ederken daha verimli bir yaklaşım sağlar. Önlemek için hücre ölümü GFP sabitlenmemiş dokusunda canlı görüntüleme sırasında yapılardan yakalama, beyin gereken 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) veya HL3 medya48x disseke, köprü slaytlar 1 x PBS (veya HL3) üzerine monte ve daha az 15-20 dk. bakım görüntüsü Ayrıca GFP Floresans görselleştirme ile etkileyebilir beri--dan disseke beyin görüntüleme önce mümkün olduğu kadar Trakea kaldırmak için alınmalıdır.
Mantar beden ve photoreceptor nöronlar morfolojisi değerlendirmek için boyama koşulları nispeten iyi kurulmuş24,61,67, bu hücredeki ilgi belirli bir protein lokalizasyonu iken türleri kapsamlı sorun giderme ve en iyi duruma getirme gerektirebilir. Özellikle, antikor seyreltme, engelleme arabelleği bileşeni konsantrasyon ve fiksasyon, dahil olmak üzere birkaç önemli adımlar en tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar üretmek için optimize edilmelidir. İlk olarak, birincil antikor en yüksek konsantrasyonu tespit edilmelidir. Piyasada bulunan antikorlar genellikle önerilen bir seyreltme (ve genellikle başlangıçta bu konsantrasyon kullanarak başlatın rağmen), bu değerler nadiren Drosophila dokular üzerinde ampirik olarak belirlenir. Bu nedenle, aralığın üstündeki ve altındaki üreticinin başlangıç öneri kez daha özel boyama sonuçları birincil antikor dilutions bir dizi test. Birincil antikor seyreltme doğruluk boyama üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir ve tam olarak belirlenir, birincil antikor içeren zaman beyin inkübe çözümler genel sonuç küçük etkisi ile önemli ölçüde değişebilir. Kuluçka beyin Fas2 antikor birincil antikor ile iki, üç, hatta dört gün 4 ° C'de disseke zaman örneğin, benzer sonuçlar gözlemledim Her ne kadar en az iki gece tavsiye, ayrıca tek bir geceliğine birincil antikor çözüm beyinlerinde inkübe ve tekrarlanabilir boyama elde. Önemlisi, beyin içinde oda sıcaklığında (ya da bir gece 4 ° C'de) 3 h ikincil antikor inkübe saat miktarını sınırlayarak sınırı non-spesifik bağlama ikincil antikorların beyin dokusu ile yardımcı olur.
İkinci olarak, istenmeyen arka plan sinyal ortadan kaldırmak için ek "engelleme" reaktifler kullanmak gerekli olabilir. NGS konsantrasyon ~ %10 1-%10 sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ve birincil/ikincil antikor çözümleri veya gecede 4 ° C'de Drosophila embriyo (bkz: ile birincil antikorların öncesi adsorpsiyon ekleme, artan seçenekler şunlardır: referans68, Bölüm 2.9, adım 3).
Biz PTN önerilen tampon olarak tüm fiksasyon için yukarıdaki iletişim kuralı'nı yazılı iken, yıkama ve antikor kuluçka adımları, doku fiksasyon (PIP ve Malzemeler tabloPEM gibi) diğer arabelleklerindeki derin farklılıklar neden olabilir sinyal gücü. Örneğin, önceki çalışmalarda siklin E dokuları da PBS içinde seyreltilmiş geleneksel %4 paraformaldehyde sabit olan zaman içinde larva Imaginal yuvarlak yüzey mümkün değildir ama doku PLP arabellekte (Ken Moberg, kişisel tamir ederken açıkça görülmeye başlıyor göstermiştir iletişim ve başvuru69). Arabellekteki değişikliklere ek bileşenleri, doku fiksasyon de önemli ölçüde immünfloresan etkileyebilir için zaman ve sıcaklık değiştirme boyama ve gerekirse ampirik olarak belirlenebilir. Genel olarak, fiksasyon zaman hücresel bileşenleri yeterli polietilenin için izin vermek yeterince uzun olmalıdır ve uzun vadeli olurken genel olarak hücresel Morfoloji bakımından yeterli bitti-çapraz ve "protein epitopları gömme" önlemek için sınırlı. Bu nedenle, başlangıçta yeni alınan bir birincil antikor boyama koşullarını iyileştirirken, genellikle yaklaşık 20 dk fiksasyon zaman sınırı ve genelde doku soğuk sıcaklıklarda ortadan kaldırır.
Birden çok denetimi birincil ve ikincil antikorları özgüllük yanı sıra transgenes/genetik arka plan gözlenen fenotip üzerindeki etkisini araştırmak için herhangi bir ayirt denemede dahil edilmelidir. Özellikle kullanılan birincil antikor protein ilgi tanır olup olmadığını tespit etmek için bu protein ve/veya protein overexpressing doku eksik sinekler dokudan denetimleri dahil edilmelidir. Aşırı saf antijen protein ek birincil antikor sinek beyindeki diğer epitopları tanır olup olmadığını belirlemek için de kullanılabilir. Son olarak, herhangi bir floresan sinyal zaman birincil antikorlar atlanırsa mevcut seçili ikincil antikorlar tarafından non-spesifik bağlama düzeyini temsil eder.
Birkaç önemli denetimleri de genetik arka plan katkısını veya transgenes boyama yoğunluğu veya nöronal Morfoloji varlığı değerlendirmek için dahil edilmelidir. Örneğin, birden çok transgenes şekil 5 MARCM deneyde kullanılan sinekler içerir (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, küvet &#62; GAL80 ve OK107-GAL4), her biri ayrı ayrı mantar vücut Morfoloji üzerindeki etkileri için analiz edilmelidir. Sinekler bir çok az, mantar vücut Morfoloji OK107-GAL4 ve UAS-CD8-GFP içeren analiz edilmelidir. Ayrıca ısı şok etkisini değerlendirmek için gerekli olabilir ve hsFLP ve FRT82B içeren Flp recombinase üretim mantar vücut geliştirme analiz tarafından üzerinde uçar. MARCM olup olmadığını denetler verilen bir protein özerk aksonal rehberlik hakkında önemli fikir sağlamasına karşın, bu sonuç doğru bir şekilde yapmak için gerekli denetimlerin sayısını bu tekniğin küçük bir sınırlama olabilir. Daha az karmaşık deneylerde benzer denetimler de geçerlidir. Örneğin, nerede GAL4/UAS sistemi bütün nöronlar ilgi bir protein devirme ifade için bir RNAi transgene ile birlikte kullanılan bir deneyi ele alalım. Bu deneyde, en az iki transgenes mevcut olacaktır: Elav-GAL4 ve UAS RNAi transgene gibi bir pan-nöronal GAL4 sürücüsü. Her biri bu transgenes yalnız içeren sinekler nöronlarda mantar vücut morfolojisi ek olarak her iki transgenes aynı sinek içinde sinekler nerede liman deneysel durumu araştırılmalıdır.
Son olarak, protein ilgi mantar vücut nöronlarda ifade olup olmadığını belirlemek için bu ortak leke beyin için genellikle Fas2 antikorlar ile gereklidir. Alternatif olarak, floresan proteinler gibi GFP, RFP veya membran CD8-GFP bağlı aynı zamanda GAL4/UAS sistemi kullanılarak ve faiz protein tanıma antikorlar ile birlikte kullanılan ifade edilebilir. Fas2 sadece mantar vücut α ve β loblar formu fasciculated akson tanır, GAL4 dayalı, membran bağlı CD8-GFP kullanımı mantar vücut nöronlar işaretlemek için özellikle yararlı beri.
Kusurları aksonal rehberlikte genellikle % 100 penetrant değildir ve hatta aynı genotip beyinlerinin bazı değişkenlik gösterebilir. Ne zaman yeni analiz mutant gen kusurları için mantar vücut veya photoreceptor bunun içinde oluşturulan, bu nedenle, farklı gen ve yaklaşımların bir arada kullanılan. Literatürde en çalışmaları bir protein aksonal rehberlik kontrol hücre özerk bir rol oynar olup olmadığını araştırmak için birkaç farklı yaklaşım kullanın: Ben) bunun analizini kusurları (tercihen farklı nu kullanarak homozigoz null sineklill allelleri), II) bunun analizini kusurları nöronlar (genellikle üzerinden RNAi), sadece ilgi protein eksik sinek içinde III) kılavuz kusurları ve IV MARCM analizi) kurtarma gene nerede homozigoz null nöronlarda yeniden ifade deneyler uçar. İdeal olarak, genotip başına birkaç düzine beyin nöronal Morfoloji kusurları için analiz edilebilir.
İletişim kuralı öncelikle odaklanır sabit doku içinde proteinlerin immünfloresan yerelleştirme burada açıklanan rağmen bu tekniğin bazı gelecekteki uygulamalar görüntü canlı beyin dokusu ile geliştirilmektedir. Bir kez beyin (genellikle hücre kültür medyada) disseke, onlar sonra birkaç gün 25 ° C'de kültürlü olabilir Bu ex vivo kodlamayla yöntemleri çok çeşitli yaralanma70,71, hücre içi takip axon rejenerasyon teşvik protein aktivite gibi biyolojik süreçleri araştırmak amacıyla geliştirilmekte olan sinyal dynamics72ve nöronal gelişim73.

Drosophila sinir sistemi insanlar ve kemirgenler, karmaşıklığı daha iyi anlamak, omurgalı karşıtları için güçlü ve ulaşılabilir bir modelini sağlayan daha küçük olmasına rağmen. Birçok durumda, omurgalı ve sinekler genleri sinir sistemi gelişimi mekanizmaları dikte çok benzer protein kodlamak. Aslında, birçok gen omurgalılarda nöronal gelişim için de dahil olmak üzere, sinekler orthologs sinyal yollar bu denetim desenlendirme, neurogenesis ve aksonal rehberlik1,2,3 bu işe gerekli ,4,5. Örneğin, netrin bir ligand memeliler ve D. melanogaster6,7,8' aksonal rehberlik için gerekli olur. Netrin ilk olarak embriyonik piliç beyin doku6izole iken, sonraki çalışmalar bu netrin korunmuş bir rol oynar embriyonik merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirilmesi sırasında Drosophila8' ortaya çıkardı. Diğer çalışmalar genetik ekranlar embriyonik Drosophila içinde CNS korunmuş ligandlar ve reseptörleri Drosophila ve omurgalıların9bunun için gerekli belirlemek için kullandık.
Embriyonik anında CNS kapsamlı bir şekilde geçmişte ligandlar, reseptörleri ve hücre içi sinyal proteinleri aksonal rehberlik8,9için gerekli belirlemek için kullanılmıştır iken, son iş hangi birçok şekillerde araştırmış Bu proteinler de geliştirme daha sonraki aşamalarında bunun kararları denetler. Özellikle, soruşturma mantar vücut (MB) ve retina photoreceptor nöron geliştirme (şekil 1) mekanizmaları içgörü bu denetimi kılavuz, sinaps oluşumu, akson budama ve çeşitli diğer yönleri nöronal sağlamıştır geliştirme10,11,12,13,14,15,16,17. Photoreceptor nöronlar sinek retina lamina denilen yetişkin beyin bölgelerine bağlanmak ve medulla ve mantar vücut nöronlar ise beyin, (18,19tarafından gözden) görsel bilgi geçişi için kritik vardır Merkezi olarak sinek beyinde bulunan ve öğrenme ve hafıza20,21için gereklidir. Photoreceptor nöronlar ve içsel nöronlar Kenyon hücreleri denilen mantar organlarının Post sinaptik hedefleri bulmak için evrimsel korunmuş diffusible ve ilgili kişi-bağımlı aksonal rehberlik mekanizmaları kullanmaktadır. Yetişkin sinekli görünür olmasının yanı sıra, photoreceptor ve MB nöronlar da doğrudan larva ve pupa antikorlar veya muhabir gen22,23,24,25ile görüntülenmeyecektir. Yetenek kolayca farklı gelişim zaman noktalarda nöronlar bu iki kümesi görselleştirmek için nöronal gelişim birçok yönleri için süper model olarak bunların kullanımı teşvik etmiştir.
Bir model olarak normal sinir sistemi gelişimi mekanizmaları anlamak için kullanılan ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda sinekler de insan hastalıkları, kırılgan X Sendromu (FXS)26 da dahil olmak üzere çok çeşitli doğru modelleri hizmet verebilir göstermiştir , Fikri Engellilik (ID)27,28,29,30,31ve diğerleri32. Örneğin, ZC3H14 moleküler işlevinin çalışması için son zamanlarda insan Fikri Engellilik için bağlantılı bir gen biz sinek manken Nab230denilen anında ZC3H14 ortholog, bir null alleli kullanarak kimliği oluşturdu. Nab2 eksik sinekler ciddi hafıza bozuklukları ve Poli(a) kuyruğu genişletilmiş, ne recapitulating insan hastalarda gözlenen veya hasta hücre hatları33,34türetilmiş. Önemlisi, sinekler Nab2 de eksik onların yetişkin mantar organları34, FXS Sendromu gen FMR135eksik sinekli gözlenen için benzer şiddetli beyin Morfoloji hataları görüntüler. Böylece, sinekler normal beyin gelişimi ve bunu bozmaya hastalıkları eğitim için önemli model organizma hizmet verebilir.
Son olarak, davranışı, genetik araçlar, geniş dizi ile birlikte izlemek için yüksek aktarım yöntemleri erişilebilirlik olun Drosophila bir model organizma gibi karmaşık davranışlar, kontrol beyin bölgeleri tanımlamak için tercih öğrenme ve bellek, uyku, Kur yapma, susuzluk ve diğerleri36,37,38,39. Bir sinek genetikçi'nın "araç kutusu" merkezinde bir özellikle yararlı bir araç (Şekil 2) GAL4/UAS sistemidir. Bu sistem40,41 Gal4 transkripsiyon harekete geçirmek doku belirli ifade genleri veya transgenes aşağı, bir yukarı etkinleştirme sıra (UAS) ifade artırmak için kullanılır. Bu sistemin değişiklikler, örneğin, tam olarak kontrol uyarılabilirlik belirli nöronlar42,43, overexpress veya knock-down belirli genler faiz44, , araştırmacılar izin 45, gerçek zamanlı kalsiyum dynamics in vivo46çözümlemek ve hızlı reporter genler nöronal soy41işaretlemek için. Mitotik rekombinasyon de mozaik analizi ile bir Repressible hücre işaretçisi (MARCM) sistem12,47yaratılması için izin GAL4/UAS sistemiyle birleşimi. MARCM kapsamlı tek nöron izleme aksonal rehberlik12,47için gereken hücresel sinyal bileşenlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bunlar ve diğer teknikleri değerli bakış açısı çok sayıda sinir sistemi işlevi için gerekli hücresel mekanizmaları üzerinde sağlanan rağmen çoğu Drosophila beyin ilk disseke gerekir; dikkatli kaldırma beyin beyin bölgeleri arasında doğru beyin morfoloji ve bağlantı desenleri korumak için gereklidir. Aşağıdaki iletişim kuralı olarak mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanırörnek olarak nöron popülasyonları diseksiyon ile yol gösterir ve immünfloresan yetişkin boyama Drosophila beyin.

<table><tbody><tr><td>Mikrodiseksiyon forseps/cımbız</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard yemekleri</td><td>Canlı Sistemler Enstrümantasyon</td><td>DD-50-S-BLK amazon.com</td> Fas2'den <td>temin edilebilir</td></tr><tr><td>Antikor</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin Antikoru</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antikor</td><td>Aves Lab</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 keçi anti-fare ikincil antikoru</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 keçi anti-tavuk ikincil antikoru</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 keçi anti-fare ikincil antikoru</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>%20 paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slaytlar</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Fosfat Tampon monobazik</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na fosfat Tamponu dibazik</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>tırnak cilası</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Leica S6D, KL300 LED ışık kaynağı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ile 9 kuyulu çanak (spot plaka)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 veya 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35mm çanak</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Potansiyel Fiksasyon Tamponları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Tamponu</td><td></td><td></td><td>0.1M NaFosfat, pH 7.2, %0.1 Triton-X-100, Tipik olarak 0.5 L 0.1M NaFosfat tamponu oluşturur ve gerektiğinde bir seferde 50 ml aliquote</td></tr><tr><td>PLP tamponu</td><td></td><td></td><td>%2 paraformaldehit, 0.01M NaI04, 0.075M Lizin, 0.037M NaPO4, pH 7.2, 0.36 g lizini 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 buz üzerinde çözün. Kullanmadan hemen önce, bu tamponlu lizin çözeltisinin 15 ml'sini 50 mg NaIO4 (sodyum periyotat) + 2 ml %20 yüksek dereceli paraformaldehit (EMS) + 3ml H2O</td></tr><tr><td>PEM tamponu</td><td></td><td></td><td>0.1M BORULAR pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA ile karıştırın, Bu tampon uygun bir şekilde 2x stok olarak yapılabilir ve %4'lük bir nihai konsantrasyon vermek için %8 paraformaldehit (PFA) ile seyreltilebilir</td></tr><tr><td><Güçlü >Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly Hisse Senetleri Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-nöronal GAL4 sürücüsü</td></tr><tr><td>w*;;; Tüm mantar vücut nöronları için OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 sürücüsü (OK107-GAL4 yerleştirme 4. kromozom üzerindedir</td></tr><tr><td>) y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>alfa ve beta loblar için GAL4 sürücüsü (2. kromozom üzerinde)</td></tr> <tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>alfa ve beta loblar için GAL4 sürücüsü, ayrıca UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w* içerir; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>Öncelikle mantar gövdesinin gama lobları için GAL4 sürücüsü (2. kromozom üzerinde)</td></tr> <tr><td>Y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>Mantar gövdesi gama lobları için GAL4 sürücüsü, ayrıca UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP içerir; FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM stoğu, 2. kromozom</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM stoğunda FRT bölgesi ve GAL80 içerir, X kromozomu</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Küvet>GAL80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td> 3. kromozom y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP'yi <td>çevirmek için MARCM stoğu</td></tr><tr><td>; FRT40A, Küvet>GAL80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td> 2. kromozom w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A'yı <td>çevirmek için MARCM stoğu</td></tr><tr><td>; UAS-CD8-GFP/CyO;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>X kromozomu y</td></tr><tr><td>(1), w*'yi çevirmek için MARCM stoğu; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP, hücre yüzeyini etiketler (CD8 bir transmembran proteindir)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td> MARCM stoğu, 2. kromozom y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP <td>üzerinde FRT bölgesi ve CD8-GFP içerir</td></tr><tr><td>; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM stoğu, X kromozomu w* üzerinde hsFLP ve CD8-GFP içerir</td></tr><tr><td>; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM stoğu, 2. kromozom y(1) üzerinde FRT bölgesi ve GAL80 içerir</td></tr><tr><td>, w*;; FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM stoğu, 3. kromozom üzerinde FRT bölgesi ve GAL80 içerir</td></tr></tbody></table>

diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin drosophila melanogaster beynindeki nöronlar photoreceptor

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Sinir sistemi gelişimi çeşitli sinyal yolları ve düzenleyici ağları tarafından koordine olayları sıralı bir dizi içerir. Birçok bu yollar dahil proteinlerin örümceklerle memeliler ve meyve sineği Drosophila melanogasterbenzer organizasyon ilkeleri bunlar geliştirilmesi sırasında bulunduğunu düşündüren, gibi diğer Ökaryotlar arasında korunmuş organizmalar. Önemlisi, Drosophila neurogenesis, farklılaşma, aksonlar rehberlik ve synaptogenesis de dahil olmak üzere memelilerde gereken işlemlerini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Sinekler de başarılı bir şekilde insan nörogelişimsel hastalıkları çeşitli modellemek için kullanılmaktadır. Burada adım adım mikrodiseksiyon, fiksasyon ve yetişkin Drosophila beyin içinde proteinlerin immünfloresan yerelleştirme için bir protokolü açıklar. Bu protokol iki örnek nöron popülasyonları, mantar vücut nöronlar ve retina photoreceptors odaklanır ve bireysel mantar vücut nöronlar Repressible hücre işaretçisi (MARCM) tekniği ile mozaik analizi kullanarak izlemek için isteğe bağlı adımları içerir. Hem vahşi tipi ve mutant beyin örnek verilerden bir puanlama ölçütünü aksonal rehberlik kusurları için kısa bir açıklama ile birlikte gösterilir. Bu iletişim kuralı mantar vücut morfolojisi soruşturma için iki köklü antikorlar vurgular ve photoreceptor nöronlar, diğer Drosophila beyin bölgeleri ve diğer beyin bölgeleri içinde proteinlerin yerelleştirme da olabilir Bu iletişim kuralını kullanan araştırıldı.

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Bu Drosophila beyin diseksiyon protokolünün genel amacı; immünofloresans, GFP etiketli protein lokalizasyonu ve ex-vivo kültür deneyleri gibi geniş bir uygulama alanında kullanılabilecek, yetişkin sineklerden sağlam beyinler elde etmektir. Bu yöntem; belirli proteinlerin ve sinyal yolaklarının rolleri ile beyin gelişimi sırasında nöronal bağlantı modellerinin belirlenmesi gibi gelişimsel biyoloji ve nörobilim alanlarındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, uzmanlaşıldığında, yetişkin beyninin belirli bölgelerindeki morfolojik kusurların immünolojik olarak tanımlanması için hızlı ve etkili bir yöntem sunmasıdır.Sinek başındaki ekzoskeletin çıkarılması büyük bir dikkat ve pratik gerektirdiğinden, bu prosedürü öğrenmek zor olabilir. Hareketleriniz yavaş ve bilinçli olmalı ve sabit kalabilmek için dissektör kolları iyi desteklenmelidir. Gerçek deneyler için ilgilenilen genotipleri dissekt etmeden önce, önce kırmızı gözlü sinekler ve ardından beyaz gözlü sinekler üzerinde pratik yapmak faydalı olacaktır.Diseksiyon hazırlığı için, anestezi uygulanmış ilgili sinekleri soğuk bir metal pedin üzerine veya buz üzerinde duran bir Petri kabına yerleştirin. Alternatif olarak, karbondioksit yayan bir sinek pedi kullanın. Ardından, bir PTN kabarcığı oluşturmak için diseksiyon kabının merkezine küçük bir miktar PTN yerleştirin.Ardından, bir stereo mikroskop altında, alanı homojen aydınlatma ile PTN kabarcığıyla doldurun. Şimdi, sinekleri karınları yukarı gelecek şekilde manipüle edin ve her birini abdomeninden tutarak PTN'ye aktarın. Hayvanı tamamen PTN içine batırın ve tüm disseksiyon işlemini PTN içinde batık halde gerçekleştirin.İkinci bir pens setiyle probosisle tutun ve başı gövdeden koparın. Bazen probosis kopabilir ancak baş gövdeyeye bağlı kalabilir. Böyle bir durum oluşursa, bir retinanın medial kenarını tutun ve başı çıkarmak için lateral kuvvet uygulayın.Abdomen ve toraksı atın. Bu adımda başın PTN içinde tutulması kritik önem taşımaktadır. Merkezi beyinden VNC'ye olan bağlantıların bu yöntemle analiz edilemeyeceği açıktır.Ardından, kütiküldeki merkezi deliğin kenarından sol retinanın medial kenarını kavrayın ve beyaz, ipliksi trakealarla kaplı opak yapı olan optik lobun yırtılmasını önlemek için pensleri yavaşça birbirlerinden uzaklaştırın. Retina ayrıldıkça gerginlikte hafif bir azalma olacaktır. Beynin yırtılmasını önlemek için, her bir gözün medial kenarını kavramak ve pensleri çok yavaşça ayırmak kritik öneme sahiptir.Çok hızlı hareket etmek, beyin morfolojisinin bozulmasına veya beyin dokusunun hasar görmesine neden olabilir. Burada gösterildiği gibi, her bir pensle kütikülü kavrayın ve çok yavaşça zıt yönlere doğru çekin. Doğru yapıldığında, kütikül beyin dokusundan ayrılmalı ve beyin sağlam kalmalıdır.Bu adım için çok keskin pensetlere ihtiyaç vardır. Ardından, etraftaki kütikül parçalarını dikkatlice tek tek temizleyin. İnatçı şekilde yapışmış kütikülleri temizlerken, beyni ezilmekten korumak için kalan VNC'yi kavrayarak beyni sabitlemek yardımcı olabilir.Son olarak, diseke edilmiş beyinleri fiksasyon ve immün boyama için PTN ile doldurulmuş bir plaka kuyucuğuna aktarmak üzere P200 pipet kullanın. Mikroskop altında, aynı genotipte olan 10 ila 15 diseke edilmiş beyni, PTN ile seyreltilmiş %4 paraformaldehit ile doldurulmuş 0,5 mililitrelik bir mikro-santrifüj tüpüne P200 pipet kullanarak aktarın. Ardından, beyinleri oda sıcaklığında yavaşça sallayarak 20 dakika boyunca inkübe edin.Fiksasyonun ardından, beyinlerin tüpün dibine çökmesini bekleyin ve ardından fiksatif maddesini uzaklaştırın. Sonrasında, her yıkama için 500 µL PTN kullanarak iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Beyinler tüpün dibine çöker çökmez PTN'yi yenileyin.Ardından, oda sıcaklığında hafif ajitasyon uygulayarak PTN ile üç kez uzun yıkama yapın. Bu yıkamaların ardından beyinler, dört derece santigrat sıcaklıkta PTN içinde gece boyunca saklanabilir. Son PTN yıkamasını gerçekleştirdikten sonra, beyinleri oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla, 0,5 mililitre bloklama solüsyonu içerisinde en az 30 dakika inkübe edin.Bloklama çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra, bloklama çözeltisi ile seyreltilmiş primer antikorlar ekleyin ve beyinleri dört derece Celsius'ta, hafif ajitasyon eşliğinde iki gün boyunca inkübe edin. Primer antikoru beşli PTN yıkama rejimi ile uzaklaştırın. Ardından, sekonder antikorları uygulayın.Bu antikorların, ışıktan korunarak sallama işlemi eşliğinde oda sıcaklığında üç saat boyunca dokularla inkübe edilmesini sağlayın. Beyinleri sekonder antikor solüsyonunda inkübe ettikten sonra PTN yıkama rejimini uygulayın. Her yıkamadan sonra örnekleri folyo ile kapatın ve mümkün olduğunca fazla tamponu uzaklaştırarak işlemi tamamlayın.Ardından, 75 µL floresan anti-fade montaj ortamı ekleyin ve beyinleri ile ortamı pipet ucunun içinde ve dışında sadece bir kez hareket ettirin. Tüp daha sonra folyoya sarılıp dört derece Celsius'ta birkaç gün boyunca saklanabilir, ancak ideal olan doğrudan montaj işlemine geçmektir. Beyinleri monte etmek için bir köprü lam hazırlayın.Pozitif yüklü bir lam üzerine iki adet kapatma camını yaklaşık 1 santimetre arayla yerleştirin. Pozitif yüklü tarafın yukarı baktığından emin olun. Ardından, kapatma camlarını tırnak cilası ile lama sabitleyin ve işleme devam etmeden önce cilanın tamamen kurumasını bekleyin.Ardından, lamı bir stereo mikroskobun altına yerleştirin ve beyinleri ve medyumu lamel arasındaki boşluğa pipetleyin. Beyinlerin daha iyi görüntülenmesi için aydınlatmayı ayarladığınızdan emin olun. Sonra, beyinlere zarar vermemeye dikkat ederek lam üzerindeki fazla montaj medyumunu aspire edin.Ardından, kalan fazla montaj medyumunu emdirerek temizleyin. Bu, beyinlerin daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır. Şimdi, forseps kullanarak beyinleri, antenal lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzeninde yerleştirin.Ardından, beyinlerin üzerine bir lam ya da örtü camı yerleştirin ve üst örtü camının alt örtü camlarına temas eden kenarlarını oje kullanarak mühürleyin. Şimdi, merkez boşluğunu taze montaj medyumu ile damla damla doldurun ve medyumun kılcal hareketle örtü camının altına çekilmesine izin verin. Boşluk dolduğunda, şeffaf oje kullanarak tamamen mühürleyin.Tanımlanan yöntem, mantar cisimcikleri de dahil olmak üzere yetişkin beynindeki hemen hemen her yapıyı görselleştirmek için kullanılabilir. Beynin bu bölgesi, öğrenme ve hafıza için gereklidir. Mantar cisimcikleri, fasciculin 2 proteinini tanıyan antikorlar kullanılarak kolayca görselleştirilebilir.Bu protein, alfa ve beta loblarının yanı sıra merkezi konumdaki elipsoid gövdede yüksek düzeyde eksprese edilir. Bu teknik, mantar gövde nöronlarının uygun akson yönlendirmesi için gerekli olan çok sayıda hücresel sürecin tanımlanmasını sağlamıştır. Bu süreçlerin bozulması, beyin orta hat bölgesi boyunca uygunsuz akson projeksiyonu ve eksik alfa lobları gibi çeşitli mutant fenotiplere neden olur.Bu mutant fenotipleri genellikle eksik penetrans gösterir ve bu nedenle birden fazla beynin incelenmesini gerektirir. Bir proteinin akson yol bulmadaki otonom rolünü incelemek için, Markham tekniği ayrıca floresan yaymayan yabani tip bir arka planda, tekil GFP pozitif mutant veya yabani tip nöronların akson yönlendirme kararlarını görselleştirmek için de kullanılabilir. Burada açıklanan yöntem, yetişkin Drosophila beyninin hemen hemen her bölgesinin güvenilir ve tekrarlanabilir şekilde görselleştirilmesine olanak tanır.Burada, mantar cismi nöronlarına odaklandık. Bu protokolün metin versiyonunda, optik lobların görüntülenmesini de gösterdik. Diğer çalışmalarda pars intercerebralis, saat nöronları ve anten lobu projeksiyon nöronları ile beraber pek çok farklı yapıyı görüntülemek için benzer teknikler kullanılmıştır.Doğru şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra her beyin 3 ila 5 dakika içinde diseke edilebilir. Bu prosedürü uygularken, kollarınızı mikroskobun yanında sabitlemeyi hatırlamanız önemlidir. Ayrıca yavaş hareket etmek ve kutikül parçalarını tek tek çıkarmak da önem taşımaktadır.Çok hızlı hareket etmek, alttaki beyin dokusunda istenmeyen hasarlara yol açabilir. Diseke edilmiş beyinler, immunofloresan tabanlı mikroskopi deneylerinde kullanılmasının yanı sıra, ek deneyler için de kullanılabilir.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu yazıda, merkezi sinir sistemi incelemek için nasıl üçüncü instar Drosophila larvaları göstermektedir.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

Bu video, yetişkin sineklerden alınan sağlam beyinleri bir köprü lamı altına monte etme yöntemini açıklar ve floresan mikroskobu için bağışıklığı lekelenmiş beyinler üzerinde gerçekleştirilen protokolü gösterir.

Yetişkin Drosophila Beyinlerinin Montajı: Konfokal Görüntüleme için Slaytlar Hazırlama Yöntemi

Bu video, yetişkin Drosophila beyninin nasıl inceleneceğini ve izole edileceğini açıklar – aksi takdirde kütikül, göz ve trakeal doku tarafından gizlenen organı görselleştirmek için gerekli bir prosedür. Örnek protokol, Drosophila nörobiyolojisinde immün boyama ve görüntüleme yöntemleri için kullanılabilecek yüksek kaliteli preparatları veren ayrıntılı bir gösterimi göstermektedir.

Drosophila Erişkin Beyin Diseksiyonu: Sinek Nörobiyolojisinde Bir Yöntem

Bu video, mutant Drosophila beyinlerinin mantar cisimciklerindeki fenotipik kusurları görselleştirmek için ayrıntılı bir immün boyama protokolünü göstermektedir. Protokol, mantar gövdesinin uygun morfolojik ve fonksiyonel gelişimini kolaylaştıran aksonal rehberlikte yer alan bir protein olan Fas2'ye karşı antikorların kullanılmasını içerir.

Drosophila Beyinlerindeki Mantar Vücut Nöronlarının İmmün Boyama ile Görüntülenmesi

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Yetişkin Drosophila beyin nöronal devreleri, yüksek beyin fonksiyonları ve karmaşık bozuklukları çalışmak için değerli bir sistemdir. Etkin bir yöntem, beyin temelli çalışmalar kolaylaştıracak küçük sinek kafasından tüm beyin dokusu incelemek için. Burada iyi korunmuş morfolojisi ile yetişkin beyinlerinde basit, tek adımlı diseksiyon protokol açıklar.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

Burada, Drosophila melanogaster'de üç basit yaralanmaya bağlı akson dejenerasyonu (akson ölüm) tahlilleri yaparak kopmuş aksonların ve sinapslarının morfolojik ve fonksiyonel korunmasını değerlendirmek için protokoller salıyoruz.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Bu protokol, larva ve yetişkin Drosophila optik loblarını görüntüleme için hazırlamak için üç adımı tanımlar: 1) beyin diseksiyonları, 2) immünohistokimya ve 3) montaj. Belirli optik lob yapılarını görselleştirmek için farklı montaj yönleri gerektiğinden, adım 3'e vurgu yapılır.

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

Bu çalışma, dekapitasyon, fiksasyon, kriyoseksiyon, floresan boyama, immün boyama ve görüntülemeyi içeren, konfokal ve multifoton görüntülemeye genişletilebilen basitleştirilmiş bir doku işleme protokolü sunmaktadır. Yöntem, gelişmiş motor becerilere olan ihtiyacı atlayarak karmaşık diseksiyonlarla karşılaştırılabilir etkinliği korur. Kantitatif görüntü analizi, kapsamlı bir araştırma potansiyeli sağlar.

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Öğrenin yetişkin Drosophila melanogaster beyin diseksiyonu ve immünfloresan boyama yöntemlerini. Bu teknik, nöronal gelişim ve bağlantı kalıplarını incelemek için hızlı ve güvenilir bir kaynak sunar.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Daha fazla video keşfet