Name: Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Keşfedin Drosophila yetişkinlerinde optik kesitsel kas alanı belirleme yöntemini. Miyotonik distrofi modelinde kas kitlesini dolaylı ölçmek için dorsal longitudinal kasları analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu protokol üzerinde translasyonel genomik grubunun üyeleri ve Kathryn J Hanson geri besleme ve gelişmeler için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje araştırma hibe SAF2015-64500-ambulans için "gayri resmi" de Economia y Competitividad tarafından verilen Avrupa Bölgesel Kalkınma fonları içerir R ile gerçekleştirilmiştir.

1. fiksasyon ve reçine katıştırma
<ol><li>Sinekler karbondioksit (CO2) ile veya bir buz Bloğu kullanarak hipotermi ile anestezi. Bir diseksiyon mikroskop (ile bütün anında görmek için düşük büyütme) ve makas bacaklar, kanatlar, baş ve karın sabitleştirici penetrasyon kolaylaştırmak için terminal kısmındaki kaldırmak için kullanın. İskelet dikkatli işleme Toraks ve deformasyon önlemek için bu adıma gerek yoktur. Not: düzgün işlenmiş bireyler yordamının sonunda yeterli sayıda sağlamak için genotip başına en az 12 sinekler başlayalım.</li>
	<li>Mürekkep bir 1,5 mL tüp buz (en fazla 6 kişi tüp başına yerleştirerek) içeren 200 µL çözüm 1 aktarın. Not: Mürekkep çözüm 1 den fazla 20 dakika içinde kalamazsınız.<ol>
<li>Bu birim oranlarda bileşenleri için çözüm 1, mix: ¼ %4 paraformaldehyde, ¼ % 8 oxazolidin, ¼ 0.2 M Na2HPO4 ve ¼ 0.2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözüm 2 200 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.<ol>
<li>Çözüm 2: Mix çözüm 1 ve 1:1 (v/v) orantılı OsO4 . Dikkat: OsO4 son derece zehirlidir. Bir duman başlıklı uygun güvenlik ve elden çıkarma tedbirler ile işleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm sıvı kaldırın. Çözüm 2 200 µL ekleyin ve 1-2 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm çıkarın ve aşağıdaki gibi bir kademeli etanol dizi örnekleri kurutmak: bir kez içinde % 30, % 50, % 70, % 90'ı ve iki kez içinde mutlak etanol; 5 dak. 1 mL etanol örnekleri kapsayacak şekilde ekleyin. Not: doku % 90 etanol yerleştirilir sonra sonraki adım oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Propilen oksit 10 min için iki kez örneklerinde her kuluçka kuluçkaya. Dikkat: Propilen oksit zehirli, duman mahallede kullanın.</li>
	<li>Propilen oksit epoksi reçine ve propilen oksit 1:1 (v/v) karışımı ile değiştirin ve oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. Dikkat: Reçine bir sıvı son derece toksik bir durumdadır. Reçine dört bileşeni (A, B, C ve D) kümesi olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Epoksi reçine için tek kullanımlık bir ölçek, reçine (A), 44.5 gram sertleştirici 54 g (B), 2.5 g Hızlandırıcı (C) ve Plastifiyan 10 g (D) ekleyin. Bir duman başlıklı reçine parçaları birleştirmek. Reçine aliquots-20 ° c (için 6 aya kadar) veya-80 ° c (birkaç yıl için) saklayın.</li>
		<li>Katı reçine toksik olmadığı için reçine atmak için bu 24 h için 70 ° C'de pişirin. Çözümler OsO izleri içerebileceği için ağır metaller grubuna göre uygun uluslararası prosedürleri, tüm önceki çözümlerinde atmak4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceki karışım % 100 reçine ile değiştirin ve örnekleri 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Mürekkep plastik kalıpları yeni reçine (kalıp her iyi bir karkas) içeren aktarın. Bilenmiş tahta sopa veya iğne transfer ve leşleri Wells yönlendirmek ve reçine gecede 70 ° C'de Pasteur fırında polimerize bırakmak için kullanın Not: arka süsleme ve kesit için iskelet uygun yönlendirme sağlamak için mürekkep onların uzun kenarından, karkas kuyu kenarına çok yakın ön kısmı ile yalan.</li>
</ol>2. kırparak ve kütük parçası-in kesit
<ol><li>Polimerli reçine blok kalıpları kaldırın. Jilet uzağa reçine trim, karkas çevreleyen bir yamuk şekli oluşturmak ve uygun yönelim içinde microtome vermek için kullanın. Tüm leşleri benzer sonuçları elde etmek için çapraz dikiş sonra kesit başlatın. Not: Bölüm doğru örnek kırpmaya DLMs hastanın eksenine dik olması gerekir ( şekil 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Şekil 3 . Yetişkin thoraces reçine gömülü miyotonik Distrofi, dorsoventral bölümlerini model sinekler. (A), örnek kırpma görüntü dorsal sağ bölümünde bölümünde kasları için tamamen enine değildi olarak doğru değildi. Sonuç olarak, üç kas demetleri üst sağ tarafında sol tarafında olanlardan daha büyük görünüyor. Bu hata bir tahmindi kas alanı içinde sonuçlanır. (B) düzgün kesilmiş reçine blok bölümünden. Ölçek çubuğu: 200 µm.
<ol><li>Kalın bir ultramicrotome bölümlerle 1,5 µm kesim ve bölümleri su damlaları gelatinized slaytlar aktarın.<ol>
<li>Bölümlere benzer sonuçları elde etmek tüm örnekleri için mesothorax kesiminden elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O buharlaşır kadar 70-80 ° C'de bir Isıtma blokta bölüm içeren slaytlar yerleştirin. Bu noktada, örnekleri ile OsO4 kontrast (şekil 4A) görülebilir.</li>
</ol>3. IFM bölümleri boyama
<ol><li>Bölümleri ile yeterli toluidin yaklaşık 30 için mavi kapak s Isıtma blokta.<ol>
<li>Toluidin blue % 1'i ve boraks H2O. ' % 1'i toluidin blue çözüm için çözmek</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2ile O durulayın ve slaytları su buharlaşır için sıcak bir tabakta bırakın. Kontrast olması gerekiyorsa toluidin ile mavi boyama tekrar (şekil 4B) gelişmiş.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Şekil 4 . Dorsoventral bölümleri farklı kontrast stainings ile yetişkin thoraces reçine gömülü. Her iki panelleri DM1 modeli sinekler Abp1 olduğu gibi şekil 2Bile beslenen görüntülerini göster. (A) bir bölümü OsO4 kontrast görüntüsü. (B) bölümünde toluidin ile mavi lekeli kas demetleri daha iyi görselleştirme sağlar. Ölçek çubuğu: 200 µm.
4. montaj IFM bölümleri
<ol><li>H2O buharlaşır kadar Isıtma blok slaytlarla kuru.</li>
	<li>1 veya 2 damla montaj orta bölümleri ve bir coverslip koydu. Dikkat: Bu adımda bir duman hood montaj orta zehirli olduğundan yürütmek.</li>
</ol>5. resim ve miktar kas alanının edinimi
<ol><li>DLM kaslar tüm kümesi odakta olması düşük büyütme oranında görüntü alabilir. Normalde 10 X kullanın.<ol>
<li>İstatistiksel analiz için sinek başı en az 5 seri fotoğraf çekmek ve deney grubu başına en az 5 sinekler çözümleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm kasları (şekil 5A) içeren görüntüyü seçin. Eksen veya bölüm yönünü kontrol ve örnekleri sonuçlarını deforme etmek uygunsuz yönlendirmeyle atın (şekil 3A karşılaştırmak / kötü arasında ayırt etmek için 3B'yi ve iyi yönlendirmeli bölümler, sırasıyla).</li>
	<li>ImageJ yazılım sadece DLMs (şekil 5A/5B) içeren bir alanı (piksel cinsinden) seçmek için kullanın. Farklı deneysel grupları arasında karşılaştırma için kullanılmak üzere başvuru alanı her zaman en büyük kas sinek olacaktır. İçinde tüm görüntüleri karşılaştırmak için farklı genotip, DLMs (şekil 5B) başvuru alanına eşit boyutları içeren alanı seçin.</li>
	<li>Resim-J komut görüntülerle binarize: İşlem/ikili/yapmak ikili ve alanları veya faiz (şekil 5C) kaslarının karşılık gelmeyen piksel silin.<ol>
<li>Komutuyla çizim araçları silmek ve kas dışındaki alanlarda artefactual siyah noktalar görünür durumda, silgi sembolü seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Şekil 5 . Görüntü analizi prosedürü kas alan tayini için. (A) miyotonik Distrofi tip 1 modeli enine bölümünü Toraks DLM içeren bir dikdörtgen ile uçmak. (B) sadece dolaylı uçuş kasları ve bağırsak (*) ile seçili alanı. (C) Binarized görüntü. Siyah alanlar faiz kaslarının karşılık gelir. Bağırsak kas alan doğru bir miktar için silindi. Ölçek çubuğu: 200 µm.
<ol start="5"><li>Kas dokusu (siyah piksel) toplam komutu ile dışarı karşılık gelen piksel yüzdesi ölçmek: Analiz/ölçüm ve Seç seçeneği alanı kesir. Bir tahmini her sineğin DLM kas kütlesinin alan bu yüzdesidir.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Drosophila melanogaster görünümünü tarafından karakterize miyotonik Dystrophies de dahil olmak üzere insan nöromüsküler hastalıklar7,10,11, çalışmaya uzun bir faydalı model olduğunu kanıtlanmıştır kas atrofisi. Burada sunulan Protokolü başlangıçlı veya sinek modeli belirli bir hastalık progresyon kaynaklanan kas dejenerasyon miktarının için yararlı bir araçtır. Örneğin, takip etmek ve farklı yaş sinekli bu analizi gerçe...

Meyve sineği Toraks işlevsel olarak, fizyolojik ve anatomik olarak ayrı olan uçuş kaslarının iki farklı sınıflar içerir. Bu kaslar: dorso-boyuna (DLM) ve dorso-ventral (DVM) kasları (şekil 1) ve zaman uyumlu uçuş oluşan dolaylı uçuş kasları (IFM), kontrol kas1,2. Bu kaslar birlikte uçmak için gerekli yüksek mekanik gücü oluşturmak. Boyutu, dağıtım ve IFMs rostro Kaudal bırakılmasını enine parça3 (şekil 2A) için kolay bir yönlendirme sağlar. Bu nedenle, biz bu kaslar kas atrofi Drosophila melanogasteriçinde çalışmaya seçtiniz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Şekil 1. Diyagram dolaylı uçuş kasları (IFMs) düzenleme gösterilen meyve sineği Toraks. (Solda) bir lateral görünüm ve (sağ) bir kesit Toraks ve temsil eder. IFMs (kırmızı) Dorso-boyuna (DLM) kasları oluşur ve Dorso-ventral (DVM) (yeşil) kaslar.
Doku yapısı ve histolojik kesitler yönünü dorso-ventral ekseni kontrolünü korunması kas kesit alanı uygun değerlendirme sağlamak için kritiktir. Tomlinson ve ark. değiştiren bir fiksasyon karışımı kullanılan Kas yapısını korumak için 4 . Kaslar iç doku olduğu için Ayrıca, Drosophila' ın ezilecektir sızdırmazlık bir fiksasyon karışımları hedef dokulara nüfuz edemez olarak sorundur. Bu sorunu aşmak için sinek baş, bacaklar, kanatları ve son iki parça girmek fiksasyon karışımı izin delik oluşturmak için karın kaldırıldı. Biz tedavi ile yoğun yağ düzeltmek için onun yetenek nedeniyle kullanılan, Osmiyum tetroxide (OsO4)5, dahil fiksasyon protokolünün parçası olarak trigliserid de dahil olmak üzere. OsO4 çoğu yapıları son derece iyi, özellikle saytolojik düzeyinde korur ve aynı zamanda görüntünün kontrast sağlar. Fiksasyon sonra Drosophila thoraces reçine enine yarı ince parça (1,5 µm) için gömülü. Geliştirilmiş kontrast için doku Ayrıca toluidin ile mavi Boyanabilen. Tam thoraces görüntüleri 10 X alındı ve kas alan görüntüler (boyutlarının eşit) binarizing ve yüzde toplam, ImageJ yazılımı ile dışarı kas dokusu (siyah piksel) karşılık gelen piksel miktarının sayılabilir.
Değişikliklere doku hazırlık ve fiksasyon karışımları, bu protokol için tanıttı OsO4 ve oxazolidin çözüm, konsantrasyon artış olarak üzerinde benzersiz kas dokusunun korunması izin. Bunun nedeni protokol bozulması ve deformasyon bile son derece atrofik koşullarında nöromüsküler dejeneratif hastalıklar gibi miyotonik Distrofi (DM) ile ilişkili posterior analiz örnekleri daha güvenilir hale dokusunun önler. Daha yaygın şekliyle, DM tip 1, genişletilmiş CUG tekrarlar miyotonik Distrofi protein kinaz (DMPK) Tutanaklar içinde tarafından bu nadir genetik bozukluk getirdiği. Mutant DMPK RNA Muscleblind gibi nükleer RNA bağlanıcı proteinler (MBNL1-3; çekilmek formu ribonuclear foci toplar Muscleblind (Mbl) Drosophila)6. Miyotonik Distrofi Drosophila modelinin 250 CTG tekrarlar kas myosin ağır zincir organizatörü (Mhc-Gal4) altında ifade ederek oluşturulan. Modeli sinekler ile tipik 'kanat' up düzenlenen fenotip uçamayan ve ciddi kas atrofi onların IFMs (şekil 2B) vardı. Önceki çalışmalarda bizim laboratuarda gerçekleştirilen IFMs kas alanının belirlenmesi bu modeli sinekler7kas atrofi, farklı kimyasal ve genetik değiştirici etkilerini ölçmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Örneğin, 250 CTG ifade sinekler C'de kas içinde tekrarlar Mbl izoformu overexpression elde kas alanının bir kurtarma Mbl tükenmesi haciz tarafından DM1 Patogenez8 (şekil 2C) tetikleyici faktör olduğu gibi. Abp1, bir hexapeptit kanıtlanmış anti-DM1 etkinlik9 (şekil 2B) ile DM modeli besleme uçar kas alanı da kurtarıldı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Şekil 2. Miktar'dorsoventral yetişkin thoraces reçine gömülü bölümlerinden. (A-D) dolaylı uçuş kaslarının Drosophila melanogaster belirtilen ilgili genotip ile. (A) denetim (yw) uçar. (B) ifade CTG kodlamayan 250 tekrarlar kas (UAS-CTG(250)x) bir azalma kas alan DLMs içinde denetim sinekler ile karşılaştırıldığında neden oldu. (C) bu kas atrofi fenotip Muscleblind (MblC) overexpression tarafından kurtarıldı (UAS-CTG (250) UAS MblC x) ve (D) beslenme modeli sinekli hexapeptit Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Tüm görüntüleri üst dorsal ve takımıdır. Transgenes bir Myosin ağır zinciri organizatörü (Mhc) kullanarak kas için tahrik-Gal4. (E) denetim sinekler göre kas alanının yüzdesi miktar farkları önemli olduğunu doğruladı. Histogram gösterir anlamına gelir ± S.E.M. **p< 0,01 ve * p < 0,05 (Student´s t-Testi). Ölçek çubuğu: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rapor burada yöntem kas geliştirme, bakım ve yaşlanma, hastalık patoloji ve kas dokusu endojen ve dış faktörler nasıl yanıt vereceğini hakkında güvenilir bilgi sağlar gibi uyuşturucu testi odaklanarak araştırmacılar için ilgi olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Image-J yazılımı</td>, <td>Ulusal Sağlık</td><td></td><td>Enstitüleri, https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Ultramikrotom</td>, <td>Leica Leica</td><td>UC6</td><td></td></tr>, <tr><td>Mikroskop</td>, <td>Leica</td><td>Leica MZ6</td>, <td>Parlak alan tekniği.</td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71970</td><td>Birkaç alternatif sağlayıcı mevcuttur.</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Dünyası Hassas Dünya</td><td>14003</td><td>Birkaç alternatif sağlayıcı var.</td></tr><tr><td>Kalıpların gömülmesi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70900</td><td>Birkaç alternatif sağlayıcı mevcuttur.</td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toksik.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Son derece toksik.</td></tr><tr><td>Propilen oksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Son derece toksik.</td></tr><tr><td>reçine (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Polimerize olmadığında kanserojendir.</td></tr><tr><td>Toluidin mavisi</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toksik.</td></tr><tr><td>Mountant Orta (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Tehlikeli.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Zararlı.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0.2 M seyreltme.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0.2 M seyreltme.</td></tr><tr><td>Boraks</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toksik.</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

İsraf, kas kütlesi kas atrofi bilinen ortak bir fenotip Drosophila modelleri nöromüsküler hastalıklar olduğunu. Biz (IFMs) dolaylı uçuş kaslarının sinekler, özellikle dorso-boyuna kaslar (DLM), ölçü birimi tarafından farklı genetik nedenler atrofik fenotip getirdiği tabi deneysel olarak kullanmışlardır. Bu protokol için biz yarı ince kesit için sinek göğüs kasları katıştırmak, kas ve çevreleyen doku arasında iyi bir kontrast elde etmek ve yarı otomatik ölçülebilir veri edinimi için optik mikroskop görüntüleri işlemek anlatan ve analiz. Biz metodolojik boru hattı üç belirli uygulamaları açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yöntemi miyotonik Distrofi sinek manken kas dejenerasyon ölçmek için nasıl uygulanabilir göstermek; İkinci olarak, kas kesit alanı ölçüm teşvik veya kas atrofi ve/veya kas dejenerasyonu önlemek genlerin tanımlamak için yardımcı olabilir; Üçüncü olarak, bu iletişim kuralı bir aday bileşik önemli bir hastalığa neden olan mutasyon bağlı belirli bir atrofik fenotip değiştirmek mümkün olup olmadığını belirlemek için uygulanabilirveya bir çevre tetikleyicisi tarafından.

MblC overexpression veya Abp1 yönetim miyotonik Distrofi sinek modeli atrofik fenotip içinde herhangi bir etkisi vardı olup olmadığını ölçmek için IFMs (şekil 1) parçası olan DLMs üzerinde duruldu. Biz model sinekler, 250 kodlamayan CTG tekrarlar Myosin ağır zincir Düzenleyici (Mhc) tarafından tahrik kas boyunca ifade kararlı-Gal4, kas alan sinekler denetlemek için karşılaştırıldığında % 50 azalma vardı. Buna ek olarak, MblC ve genişletilmiş CTG tekr...

Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Bu prosedürün genel amacı, kas kütlesini dolaylı olarak ölçmek ve kas büyümesini veya atrofilerini doğru boyutlandırmak amacıyla yetişkin Drosophila kaslarındaki kas alanını nicelleştirmektir. Bu amaçla; boyutları, dağılımları ve ayrıca bu konumdaki düşük ve kolay yönlendirmeli transvers kesit imkanı nedeniyle dorsal longitudinal kaslara odaklandık. Birinci adım, fiksasyon ve resin gömme işlemidir.Prosedürün ilk adımı, sineklerin CO2 ile anestezi edilmesi ve makas ile pens yardımıyla bacakların, kanatların ve abdomenin uç kısmının çıkarılmasıdır. İkinci olarak, toraksın deforme olmasını önlemek için gövdeler dikkatlice, buz üzerinde bulunan ve 200 µL çözelti 1 içeren bir virgül beş mililitrelik tüpe, tüp başına maksimum altı birey gelecek şekilde aktarılır. Gövdeler bu çözelti içerisinde 20 dakikadan fazla tutulmamalıdır.Son olarak, 200 µL çözelti iki ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüm sıvıyı uzaklaştırın, 200 µL çözelti iki ekleyin ve kadavraları bir ila iki saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bir sonraki adım, çözeltiyi uzaklaştırmak ve örnekleri dereceli bir etanol serisi aracılığıylayla dehidrate etmektir.Numuneleri, her biri on dakika sürecek şekilde iki kez propilen oksitte inkübe edin. Ardından, propilen oksidi 500 µL reçine ve 500 µL propilen oksit karışımıyla değiştirin ve numuneleri oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, karışımı %100 reçine ile değiştirin ve numuneleri dört saat boyunca inkübe edin.Ardından, her bir kalıp kuyucuğuna bir adet gelecek şekilde gövdeleri yeni reçine içeren plastik kalıplara aktarın. Gövdeleri kuyucuklar içinde bir ahşap çubuk yardımıyla yönlendirin ve reçineyi gece boyunca 70 °C'deki bir etüvde polimerize olmaya bırakın. Katılaşmış ve fırınlanmış reçinenin toksik olmaması nedeniyle, reçineyi atmak için 24 saat boyunca 70 °C'de fırınlayın.İkincisi, blokların düzeltilmesi ve kesit alınmasıdır. Jilet yardımıyla reçineyi tıraşlayarak, mikrotomda uygun yönlendirmeyi sağlamak amacıyla gövdeyi çevreleyen trapezoidal bir şekil oluşturun. Kasların mükemmel şekilde yönlendirildiğini mikroskop altında kontrol edin.Bundan sonra, bir ultramikrotom ile 1.5 µm kalınlığında kesitler alın ve bu kesitleri jelatinli lamlar üzerindeki su damlacıklarına aktarın. Son olarak, kesitlerin bulunduğu lamları, tüm su buharlaşana kadar 70 ile 80 °C sıcaklıktaki bir ısıtma bloğuna yerleştirin. Üç, IFM kesitlerinin boyanması.Kesitleri ısıtma bloğu üzerinde yaklaşık 30 saniye boyunca toluidine blue ile boyayın. Ardından, birkaç kez suyla durulayın ve suyun buharlaşması için lamları sıcak bir plaka üzerinde bırakın. Dört, IFM kesitlerinin montajı.Slaytları alıp kesitlerin üzerine bir veya iki damla kapatma medyumu damlatın ve üzerine uzun bir lamelle kapatın. Beş, görüntülerin elde edilmesi ve kas alanının miktar tayini. Sadece DLM'leri içeren bir alanı seçmek için ImageJ yazılımını kullanın.En büyük kas alanına sahip olan sinek görüntüsünün boyutlarını kontrol olarak alarak görüntüleri detaylandırın ve ilgilenilen kaslara karşılık gelmeyen alanları veya pikselleri silin. analyze, measurement komutuyla toplam pikseller içinde kas dokusuna karşılık gelen piksellerin yüzdesini belirleyin ve area fraction seçeneğini belirleyin. Bu alan yüzdesi, her bir sineğin DLM kas kütlesinin bir tahminidir.Temsili sonuçlar. Miyozin ağır zincir promotörü, MhC Gal dört tarafından yönlendirilen ve kas sistemi genelinde 250 kodlamayan CTG tekrarı eksprese eden model sineklerin, kontrol sineklere kıyasla kas alanında yüzde 50 oranında azalma olduğunu belirledik. Buna karşılık, aynı sürücü ile muscle blind C ve genişletilmiş CTG tekrarlarının birlikte ekspresyonu bu fenotipi güçlü bir şekilde baskılamış ve kasın enine kesit alanı kontrol sineklerin yüzde 70'i düzeyinde gerçekleşmiştir.Besleyici besiyerinde Abp1 hekzapeptidinin uygulanması da benzer şekilde atrofik fenotipi baskılamış ve bileşiği alan model sinekler, DF1 sinekleri için tipik olan %50 yerine, normal kas alanının yaklaşık %60'ını göstermiştir. Sonuçlar. Burada sunulan protokol, bir sinek modelinde belirli bir hastalığın başlangıcı veya ilerlemesi nedeniyle oluşan kas dejenerasyonunu nicelleştirmek için faydalı bir araçtır. Son olarak, bu yöntem küçük kas alanı farklarını saptamak, hatta nefrositler gibi farklı yapıların alanını nicelleştirmek için de optimize edilmiştir.İzlediğiniz için teşekkür ederiz.

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kas hasarı altta yatan mekanizmaların belirlenmesi çok önemlidir. Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu kas morfoloji ve protein ve diğer kas hücre bileşenleri lokalizasyonu analizi sağlar.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Drosophila uçuş kasları, kas gelişimi ve fizyolojisi için model bir sistem olarak kullanılır. Bu video, yetişkinlerin uçuş kaslarını açıklar ve pupalardan RNA dizilimi için uygun olan dolaylı uçuş kaslarının geliştirilmesini incelemek için bir protokolü vurgular.

Drosophila Geç Pupa İndirekt Uçuş Kası (IFM) Diseksiyonu: Yüksek Verimli Doku Toplama Yöntemi

C. elegans'ın tek sarkomer ve çoklu sarkomer veya çizgili kaslar olmak üzere iki tür kası vardır. Bu video, bir solucanın hareketinden sorumlu olan çizgili vücut duvarı kaslarının düzenini açıklar ve görüntü analiz yazılımı kullanarak kas morfolojisini ölçmek için örnek bir protokol içerir.

C. elegans Kas Alanı Ölçümleri: Çizgili Kas Morfolojisini Ölçmek İçin Standart Bir Yöntem

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Drosophila uçuş kası transkripsiyonel düzenleme, alternatif birleştirme, metabolizma ve mekanobiyoloji çalışma güçlü bir modeldir. Biz proteomics ve derin sıralama için ideal son derece zenginleştirilmiş örnekler oluşturmak için canlı pupa floresan etiketli uçuş kası diseksiyon için bir protokol salıyoruz. Bu örnekler kas gelişiminin çeşitli yönleri ne önemli mekanistik anlayışlar sunabilir.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Nöromüsküler kavşağın mimarisini koruyan ve yetişkin Drosophila bacağındaki motor nöronların ayrıntılı bir immünostokimyasal çalışmasını sağlayan bir diseksiyon tekniğini tarif ediyoruz.

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA'ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Burada, desenlenme ve büyüme kusurlarını ölçmek için yetişkin Drosophila gözlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için hızlı, düşük maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. Nokta montajı, yüksek çözünürlüklü görüntü elde etme ve görüntü analizi ile numune hazırlama protokolümüzü açıklıyoruz.

Harici yetişkin Drosophila yapılarının miktarının belirlenmesi için hızlı ve basit bir iş akışı

Drosophila , miyogenezin temel mekanizmalarını anlamak için güçlü bir modeldir. Toraks hemi-sezaritlerinin diseksiyonu ve hazırlanması için bu protokol, hem pupa hem de yetişkin aşamalarından dolaylı uçuş kasının mikroskopi analizini sağlar. Bu protokol, hücresel morfolojinin, protein lokalizasyonunun, kas yapısının ve miyogenezin diğer birçok yönünün konfokal görüntülenmesini sağlar.

Mikroskopi Yaklaşımları için Drosophila melanogaster Dolaylı Uçuş Kaslarının Diseksiyonu

Keşfedin Drosophila yetişkinlerinde optik kesitsel kas alanı belirleme yöntemini. Miyotonik distrofi modelinde kas kitlesini dolaylı ölçmek için dorsal longitudinal kasları analiz edin.

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Daha fazla video keşfet