Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

Bu protokolün genel amacı, aquaporin 4'e özgü T hücrelerinin evlat edinici transferi yoluyla merkezi sinir sistemi veya CNS otoimmün hastalığını indüklemek ve bunun CNS ve dinamik görme sistemi üzerindeki etkilerini izlemektir. Bu yöntem, yaygın olarak AQP4 olarak bilinen aquaporin 4'ün, nöromiyelitis optika'da ve diğer inflamatuar görme bozukluklarında spesifik T hücrelerinin rolü ile ilgili önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Optik koherens tomografinin ana avantajı, retina hasarının noninvaziv bir şekilde uzunlamasına monitörizasyonunu yapabilme kapasitesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Sharon Sagan ve RE Greens Laboratuvarı'nda bir araştırmacı olan Andreas Cruz Harans olacak. Piston olmadan bir cam Luer kilit şırıngasına iki erkek Luer kilit bağlantısına sahip üç bir naylon musluk takarak başlayın. Vanayı kapatmak için vana kolunu şırıngaya doğru çevirin ve şırıngayı açık ucu yukarı bakacak şekilde konumlandırın.

Girdaplamadan sonra, şırıngaya bire bir hacimde peptit ve Complete Freund'un Adjuvan solüsyonunu ekleyin ve cam pistonu şırıngaya tekrar yerleştirin. Pistonu yerinde tutarak, şırıngayı, musluk yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve kolu kullanılmayan dişi bağlantıya getirin. Şırıngadaki fazla havayı çıkarmak için pistona dikkatlice bastırın.

Çözüm, vananın ikinci erkek Luer kilit bağlantısını dolduracaktır. Ardından, piston ikinci erkek Luer kilit bağlantısına tam olarak yerleştirilmiş olarak ikinci bir cam şırınga takın. Bir emülsiyon oluşturmak için, çözeltiyi iki şırınga arasından yaklaşık iki dakika geçirmek için pistonları dönüşümlü olarak bastırın ve çözeltinin viskozitesinde gözle görülür bir değişiklik olana kadar çözeltiyi yaklaşık 10 dakika soğutun.

Çok sert bir beyaz emülsiyon oluştuğunda, tüm çözeltiyi şırıngalardan birine aktarın ve boş şırıngayı yeni bir milimetre Luer kilit şırıngası ile değiştirin. Yeni şırıngayı emülsiyonla doldurun. Şırıngayı musluktan çıkarın ve 25 gauge bir iğne takın.

Emülsiyonu kıvam açısından su testi yapmak için, emülsiyonun bir damlasını küçük bir su kabına boşaltın. Emülsiyon dağılmazsa, enjeksiyon için uygundur. Daha sonra her bir donör AQP4 nakavt faresini deri altından bir kez alt karın bölgesinin her iki tarafına ve göğüs duvarının her iki tarafına medial olarak koltuk altına enjekte edin.

Aşılamadan 10 ila 12 gün sonra, kasıktan boynuna kadar deride ve ilk farenin her bir bacağında orta hat kesisi yapın. Cildi peritondan uzaklaştırın ve tahtaya sıkıca sabitleyin. Daha sonra kasık ve koltuk altı lenf düğümlerini toplayın ve dokuları tam ortam içeren bir petri kabı içindeki bir hücre süzgecine yerleştirin.

Tüm lenf düğümleri toplandığında, hücre süzgecini buz üzerinde taze tam ortam içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve lenf bezi hücrelerini filtre ağından geçirmek için steril beş mililitrelik bir şırınga pistonunun düz ucunu kullanın. Hücre geri kazanımını kolaylaştırmak için ağı 20 ila 30 mililitre tam ortamla durulayın, ardından iki santrifüj yıkaması yapın. İkinci santrifüjlemeden sonra, sayım için peleti T hücresi ortamında yeniden süspanse edin.

Hücrelere uygun konsantrasyonlarda antijen, rekombinant fare interlökin faresi 23 ve rekombinant fare IL-6 ekleyin ve bu Th17 polarize edici karışımında 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna kuyucuk başına iki mililitre hücre ekleyin. Ardından plakayı 72 saat boyunca% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Polarizasyonun üçüncü gününde, polarize hücreleri yerinden çıkarmak için her bir oyuktaki kültürleri birkaç kez tritüre edin ve sayım için buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.

PBS'de iki yıkamadan sonra, hücreleri PBS'de mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila sekizinci hücreye seyreltin ve hücre süspansiyonunu döndürerek hafifçe karıştırın. Toplanmalarından sonraki bir saat içinde, hücreleri bir mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve her bir alıcı hayvana kuyruk damarı yoluyla intravenöz olarak 200 mikrolitre hücre verin. Daha sonra her fareye intraperitoneal olarak hemen ve iki gün sonra 200 mikrolitre PBS içinde seyreltilmiş 200 nanogram B boğmaca toksini enjekte edin.

Optik koherens tomografi ile alıcı hayvanların in vivo retinal görüntülemesi için, görüntülemeden beş dakika önce, göz başına bir damla %1 tropikamid ile göz bebeklerini genişletin ve ısı matını açın. Fareyi görüntüleme silindirinin üzerine yerleştirin ve anestezi akışını buna göre yeniden yönlendirin. Gözleri nemli tutmak ve kırma sürekliliğini sağlamak için% 0.3 hidroksipropil metilselüloz ile koruyun ve incelenecek gözün üzerine özel bir kontakt lens yerleştirin.

Kızılötesi fundus görüntüsünün rehberliğinde, ışının optik sinir kafası üzerinde ortalanmasına dikkat ederek lazeri lens kaplı göze yönlendirin. Yüksek çözünürlük modunda 25 B taraması gerçekleştirin ve ortalama 30 A taramasından elde edilen görüntüleri rasterleştirin. Her iki gözü de görüntüledikten sonra, kontakt lensi oftalmik jel ile değiştirin ve fareyi sıcak bir kurtarma kafesine yerleştirin.

Otomatik segmentasyon için modüler görüntüleme yazılımını kullanarak elde edilen görüntüleri analiz etmek için, önce iç retina katmanlarının sınırlarını temsil etmek için iç sınırlayıcı zara ve iç pleksiform katmana karşılık gelen segmentleri manuel olarak düzeltin. Daha sonra retina sinir lifi ve ganglion hücre katmanlarının iç retina tabakasının sınırları içinde bulunduğunu ve örtüşmediklerini doğrulayın. Patojenik T hücresi epitopları içeren AQP4 peptitleri ile deri altı bağışıklama, vahşi tip T hücresi tepkilerine kıyasla AQP4 nakavt farelerinin drenaj lenf düğümlerinde güçlü proliferatif T hücresi tepkileri ortaya çıkarır.

Bireysel V beta ekspresyonunun akış sitometrik analizleri, patojenik T hücresi epitopları içeren AQP4 peptitlerine özgü T hücrelerinin benzersiz TCR repertuarlarını kullandığını ve bu belirleyicilere patojenik T hücresi yanıtlarının normal olarak timik negatif seleksiyon ile düzenlendiğini gösteren seçici bir hiperproliferasyon gösterdiğini göstermektedir. Polarize T hücresi enjeksiyonundan yaklaşık altı ila dokuz gün sonra, alıcı farelerin neredeyse tamamı, gevşek kuyruk ve arka bacak felci dahil olmak üzere CNS otoimmün hastalığının klinik belirtilerini geliştirdi. Th17-polarize AQP4'e özgü T hücreleri, Th1-polarize AQP4'e özgü T hücrelerinden daha ciddi bir klinik hastalığa neden olur.

Örneğin, bu fare, Th17-polarize AQP4 peptide özgü T hücresi uygulamasından sonra tam arka bacak felci geliştirdi. AQP4 peptidine özgü Th17 hücrelerinin neden olduğu klinik hastalık ayrıca, mononükleer hücrelerin CNS, parankim ve meninkslere infiltrasyonu ve ayrıca optik sinir iltihabı ile ilişkilidir, bu da fareler hastalıktan kurtuldukça taban çizgisine dönen iç retina tabakasının şişmesi ve artan kalınlığı ile kanıtlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, AQP4 hedefli otoimmünitenin nasıl indükleneceği ve izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız, bu da T hücrelerinin nöromiyelit optikaya nasıl katıldığını anlamak için daha fazla çalışmaya izin verecektir.