Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

Bu protokolün genel amaçları, aquaporin 4-spesifik T hücrelerinin adoptif transferi ile merkezi sinir sistemi veya MSS otoimmün hastalığını indüklemek ve bunun sonucunda MSS ve dinamik görme sistemi üzerindeki etkileri izlemektir. Bu yöntem, yaygın olarak AQP4 olarak bilinen aquaporin 4 spesifik T hücrelerinin nöromiyelitis optika ve diğer inflamatuar görme bozukluklarındaki rolüne ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Optik koherens tomografisinin temel avantajı, retinal hasarın noninvaziv bir şekilde boylamsal olarak izlenebilme kapasitesidir.

Prosedür, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Sharon Sagan ve RE Greens Laboratuvarı'ndan bursiyer Andreas Cruz Harans tarafından gösterilecektir. İşe, iki erkek Luer kilit bağlantılı üç yollu bir naylon stopkoku, pistonu olmayan cam bir Luer kilitli şırıngaya takarak başlayın. Stopkoku kapatmak için stopkok kolunu şırınga yönüne doğru çevirin ve şırıngayı açık ucu yukarı bakacak şekilde konumlandırın.

Vorteksleme işleminden sonra, şırıngaya eşit hacimlerde peptit ve Complete Freund's Adjuvant çözeltisi ekleyin ve cam pistonu şırıngaya tekrar yerleştirin. Pistonu sabit tutarak, musluk yukarı bakacak şekilde şırıngayı ters çevirin ve kolu kullanılmayan dişi bağlantıya getirin. Şırıngadaki fazla havayı tahliye etmek için pistonu dikkatlice bastırın.

Çözelti, musluğun ikinci erkek Luer kilit bağlantısını dolduracaktır. Ardından, pistonu tamamen yerleştirilmiş ikinci bir cam şırıngayı ikinci erkek Luer kilit bağlantısına takın. Bir emülsiyon oluşturmak için, çözeltiyi iki şırınga arasında yaklaşık iki dakika boyunca sırayla pistonları bastırarak geçirin ve çözeltinin viskozitesinde gözle görülür bir değişiklik olana kadar çözeltiyi yaklaşık 10 dakika soğutun.

Çok katı beyaz bir emülsiyon oluştuğunda, çözeltinin tamamını şırıngalardan birine aktarın ve boşalan şırıngayı yeni bir bir milimetrelik Luer lock şırınga ile değiştirin. Yeni şırıngayı emülsiyonla doldurun. Şırıngayı musluktan çıkarın ve 25 gauge bir iğne takın.

Emülsiyonun kıvamını su testiyle kontrol etmek için, bir damla emülsiyonu küçük bir kap içindeki suya boşaltın. Emülsiyon dağılmazsa, enjeksiyon için uygundur. Ardından, her bir donör AQP4 nakavt fareye alt karnın her iki yanına ve göğüs duvarının koltuk altına medial olan her iki yanına birer kez deri altına enjeksiyon yapın.

İmmünizasyondan 10 ila 12 gün sonra, ilk farenin kasık bölgesinden boynuna kadar deri boyunca orta hat boyunca bir insizyon yapın ve her iki bacağını aşağıya doğru kesin. Deriyi peritondan ayırın ve tahtaya sıkıca sabitleyin. Ardından inguinal ve aksiller lenf düğümlerini toplayın ve dokuları, komplet besiyeri içeren bir petri kabı içindeki hücre süzgecine yerleştirin.

Tüm lenf düğümleri toplandığında, hücre süzgecini buz üzerinde taze tamamlanmış besiyeri içeren 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve lenf düğümü hücrelerini filtre gözeneklerinden geçirmek için steril beş mililitrelik bir şırınga pistonunun düz ucunu kullanın. Hücre geri kazanımını kolaylaştırmak için süzgeci 20 ila 30 mililitre tamamlanmış besiyeri ile durulayın ve ardından iki kez santrifüjle yıkayın. İkinci santrifüjden sonra, sayım yapmak için peleti T hücresi besiyerinde yeniden süspanse edin.

Hücrelere uygun konsantrasyonlarda antijen, rekombinant fare interlökin mouse 23 ve rekombinant fare IL-6 ekleyin ve bu Th17 polarizasyon karışımındaki hücrelerin her kuyucuğa iki mililitre gelecek şekilde 12 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa ekleyin. Ardından plağı, %5 CO2 içeren, nemlendirilmiş 37 °C bir inkübatöre 72 saat süreyle yerleştirin. Polarizasyonun üçüncü gününde, polarize hücreleri yerinden çıkarmak için her kuyucuktaki kültürleri birkaç kez tritüre edin ve sayım için buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.

PBS ile iki kez yıkama yaptıktan sonra, hücreleri PBS içinde 1 × 10⁸ hücre/mL konsantrasyona seyreltin ve hücre süspansiyonunu dairesel hareketlerle hafifçe karıştırın. Toplama işleminden sonraki bir saat içinde hücreleri bir mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve her alıcı hayvana kuyruk veninden intravenröz olarak 200 µL hücre uygulayın. Ardından, her fareye hemen ve iki gün sonra, 200 µL PBS ile seyreltilmiş 200 ng B pertussis toksinini intraperitonal olarak enjekte edin.

Alıcı hayvanların optik koherens tomografi ile in vivo retinal görüntülemesi için, görüntülemeden beş dakika önce, her göze bir damla %1 tropicamide ile pupillaları dilate edin ve ısıtıcı pedi açın. Fareyi görüntüleme silindirine yerleştirin ve anestezi akışını buna göre yönlendirin. Gözleri nemli tutmak ve refraksiyon sürekliliğini sağlamak için %0,3 hydroxypropyl methylcellulose ile koruyun ve incelenecek göze özel bir kontakt lens yerleştirin.

Kızılötesi fundus görüntüsünün rehberliğinde, lazer ışınının optik sinir başına merkezlendiğinden emin olarak lazeri lensle kaplanmış göze yönlendirin. Yüksek çözünürlük modunda 25 B-taraması gerçekleştirin ve görüntüleri 30 ortalamalı A-taramasından rasterize edin. Her iki gözün görüntülemesini tamamladıktan sonra, kontakt lensi oftalmik jel ile değiştirin ve fareyi sıcak bir iyileşme kafesine yerleştirin.

Otomatik segmentasyon için modüler görüntüleme yazılımını kullanarak elde edilen görüntüleri analiz etmek için, öncelikle iç retinal tabakaların sınırlarını temsil etmek üzere iç sınırlayıcı membran ve iç pleksiform tabakaya karşılık gelen segmentleri manuel olarak düzeltin. Ardından, retinal sinir lifi ve ganglion hücre tabakalarının iç retinal tabaka sınırları içerisinde yer aldığını ve birbirleriyle örtüşmediklerini doğrulayın. Patojenik T hücre epitopları içeren AQP4 peptidleri ile yapılan deri altı immünizasyon, AQP4 nakavt farelerin drenaj lenf düğümlerinde, vahşi tip T hücre yanıtlarına kıyasla güçlü proliferatif T hücre yanıtlarını tetikler.

Bireysel V beta ekspresyonunun akım sitometrik analizleri, patojenik T hücresi epitopları içeren AQP4 peptidlerine özgü T hücrelerinin benzersiz TCR repertuvarları kullandığını ve seçici bir hiperproliferasyon sergilediğini göstermektedir; bu durum, söz konusu belirleyicilere verilen patojenik T hücresi yanıtlarının normalde timik negatif seleksiyon ile regüle edildiğini göstermektedir. Polarize T hücresi enjeksiyonundan yaklaşık altı ila dokuz gün sonra, alıcı farelerin neredeyse tamamında düşük kuyruk ve arka ekstremite paralizisi dahil olmak üzere MSS otoimmün hastalığının klinik belirtileri gelişmiştir. Th17-polarize AQP4-spesifik T hücreleri, Th1-polarize AQP4-spesifik T hücrelerine göre daha şiddetli bir klinik hastalık indüklemiştir.

Örneğin, bu fare Th17-polarize AQP4 peptit spesifik T hücre uygulaması sonrası tam arka ekstremite felci geliştirmiştir. AQP4 peptit spesifik Th17 hücreleri tarafından indüklenen klinik hastalık, MSS parenkimine ve meningeslere mononükleer hücre infiltrasyonunun yanı sıra, fareler hastalıktan iyileştikçe bazal seviyeye dönen iç retinal tabakanın şişmesi ve kalınlığının artmasıyla kanıtlandığı üzere optik sinir inflamasyonu ile de ilişkilidir. Bu videoyu izledikten sonra, T hücrelerinin nöromyelitis optika'ya nasıl katıldığını anlamak için yapılacak ileri çalışmalara olanak sağlayacak şekilde, AQP4 hedefli otoimmünitenin nasıl indükleneceği ve izleneceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmanız gerekir.