Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Bu prosedürün genel amacı, omurgalı genomlarının fonksiyonel açıklamasını iyileştirmek için düşük bollukta embriyonik örnekler kullanarak farklı histon modifikasyonlarının bağlanma profillerini araştırmaktır. Bu yöntem, gelişimsel biyoloji alanında, belirli bir embriyonik dokunun kimliğini tanımlayan temel güçlendiriciler ve genler gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajları, sınırlı miktarda özel materyal gerektirmesi ve hem lokal spesifik hem de genom çapında analizler için kullanılabilmesidir.

Bu yöntem, embriyonik dokularla transkripsiyon regülasyonu veya hücresel heterojenlik hakkında bilgi sağlayabilse de, patent örnekleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu deney için tavuk embriyoları olan evre HH19'u elde etmek için, verimli beyaz Leghorn tavuk yumurtalarını üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 80 nemde yatay yönde kuluçkaya yatırın. HH19 embriyolarını izole etmeye başlamak için, blastodermi düşürmek için 10 milimetrelik bir şırınga ile üç mililitre albümin çıkararak onları erişilebilir hale getirin.

Ekstra embriyonik zarları çıkarmak için, gözde küçük bir açıklık açmak için ince makas kullanın. Bir mililitre kilit çözeltisi ekleyin. Bükülmüş bir iğne yardımıyla 0,5 mililitre Hint siyah mürekkebi ekleyin.

Embriyoyu çevreleyen ekstra embriyonik zarı kesmek için ince cerrahi makas ve forseps kullanın. Daha sonra embriyoyu delikli bir kaşıkla 20 mililitre PBS çözeltisi içeren 4,5 santimetrelik bir petri kabına aktarın. Stereo mikroskop altında buz üzerinde çalışarak, amniyonunu ve ekstra embriyonik zarın kalan kısımlarını incelemek ve atmak için ince makas ve forseps kullanın.

Daha sonra, transvers spinal nöro tüpü veya SNT segmentini embriyonun brakiyal seviyesinde kesin. SNT'yi izole etmek için diseksiyonu kaudal olarak torasik bölgeye uzatın. Bitirmek için, SNT'yi lateral ve ventral olarak çevreleyen dokuları çıkarmak için forseps kullanın.

SNT'leri izole ettikten sonra, her bir segmenti 37 santigrat derece ılık tripsin içeren 3,5 santimetrelik bir petri kabına daldırın. SNT etrafındaki nöro olmayan dokuların gevşemesi stereo mikroskop altında görüldüğünde, numuneleri soğuk 1x PBS'ye aktarın. Tripsinizasyonu durdurmak için numuneleri %10 FBS içeren soğuk DMEM içeren yeni bir kaba aktarın.

Kalan mezenkimal ve ektodermal dokuları SNT'den manuel olarak çıkarmak için forseps kullanın. Bu temiz SNT bölümünü 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Daha sonra, dokuyu metin protokolüne göre homojenize edin.

13,5 mikrolitre% 37 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde 15 dakika inkübe edin. Formaldehiti söndürmek için, tüpe 25 mikrolitre 2.5 molar glisin ekleyin ve oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde 10 dakika inkübe edin. Tüpü santrifüjleyin ve ardından, peleti metin protokolüne göre yıkayın.

Çapraz bağlamadan sonra, peleti 300 mikrolitre buz gibi soğukta yeniden süspanse edin, pipetleme ile tam lizis tamponu. Numuneleri sallanan bir platformda dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri dört santigrat derecede sonikleştirin.

Sonikasyondan sonra, numuneleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 x G'de santrifüjleyin. Süpernatanı veya lizatı 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hücresel kalıntı peletini atın. Lizatı metin protokolüne göre seyreltin.

Ardından, giriş kontrolü olarak her numuneden küçük bir alikot tutun ve 20 santigrat derecede dondurun. Kromatin çökeltisine maruz kalacak kalan numuneleri inkübe edin veya metin protokolüne göre uygun antikorlarla çipleyin. Ardından, daha önce yıkanmış manyetik boncuklara 300 mikrolitre antikora bağlı kromatin ekleyin.

Numuneleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Antikorları boncuklara bağlamak için, tüpleri bir tüp döndürücüye yerleştirin ve en az dört saat boyunca dört santigrat derecede dikey olarak döndürün. Kromatine bağlı boncukları yıkamak için, buz üzerinde bekletilen tüpe bir mililitre buz gibi RIPA yıkama tamponu ekleyin ve tüpü ters çevirerek veya hafifçe vurarak karıştırın.

Tüpü oda sıcaklığında manyetik tutucuya yerleştirdikten sonra boncukların yana oturmasını bekleyin. Berrak sıvıyı dökün ve bu yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Tüpe bir mililitre TE 50 milimolar sodyum klorür ekledikten sonra, bu çözeltideki kromatine bağlı boncukları taze bir 1.5 milimetre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü manyetik tutucuya yerleştirin ve boncuklar yerleştiğinde sıvıyı boşaltın. Daha sonra, boncukları önceden soğutulmuş bir santrifüjde üç dakika boyunca dört santigrat derecede 900 x G'de santrifüjleyin. Boncuklar manyetik tutucuya yerleştirildikten sonra, kalan tüm TE'yi bir jel yükleme ucu kullanarak çıkarın.

Oda sıcaklığında çalışarak, boncuklara 210 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve hafifçe vurarak yeniden askıya alın. Tüpü önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri boncuklarla oda sıcaklığında 16.000 x G'de bir dakika santrifüjleyin.

Boncuklar manyetik tutucuya yerleştikten sonra, süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Önceden donmuş giriş kontrol örneğini 20 santigrat dereceden oda sıcaklığına kadar çözdürün. Numuneye 90 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve kısa bir süre girdaplayarak karıştırın.

Çapraz bağları tersine çevirmek için, çipi ve kontrol numunelerini gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında çalışarak, tüp başına bir hacim TE tamponu ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. RNA'yı sindirmek için, kontrol ve çip örneklerine RNAse A'yı mililitre başına 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve karıştırmak için tüpleri ters çevirin.

Tüpleri önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Sonraki DNA saflaştırması için proteini sindirmek için, tüplere mililitre başına 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona proteaz K ekleyin ve karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Tüpleri önceden ısıtılmış bir ısı bloğunda 55 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

DNA'yı ek materyallere göre çıkarın ve saflaştırın. Bu DNA artık kantitatif PCR ve çip arama kütüphanesi hazırlığı için kullanılabilir. Başarılı bir çip için gerekli olan sonikasyon verimliliği, giriş kontrol numunelerinin agaroz jel elektroforezi ile doğrulanır.

Bu örnekte, tavuk spinal nöral tüpü veya SNT bölümleri kullanılarak, 200 ila 500 baz çifti arasında değişen optimal bir parça boyutu elde etmek için 11 sonikasyon döngüsü kullanıldı. Yontulmuş DNA, tavuk SNT'sinde aktif ve inaktif olan genlerin promotör bölgeleri etrafındaki aktive edici ve baskılayıcı histon işaretlerinin zenginleştirme seviyelerini ölçmek için kantitatif PCR ile analiz edildi. Bu, daha fazla analiz için çok fazla DNA kaybetmeden sadece birkaç düşük tarafı ölçerek yontulmuş kaliteyi değerlendirmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Çip arama kütüphaneleri sırayla hazırlandıktan sonra, tavuk SNT'sinde üretilen H3K27 tri metilasyon ve H3K4 tri metilasyon çip arama verileri için temsili bir çekirge gösterilmiştir. Benzer çip arama profilleri, maksiller çıkıntılar ve evre HH3 embriyoları gibi farklı tavuk embriyonik dokularında da başarıyla oluşturuldu. Bu, burada sunulan çip protokolünün sınırlı miktarlarda çeşitli embriyonik dokulardan epigenomik profiller oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Embriyonik bir dokuda histon modifikasyon profillerini oluşturmak için bu protokolü kullanarak, sinyallerin bu dokuda bulunan tüm farklı hücre tiplerinden geleceğini hatırlamak önemlidir. Bu protokolü takiben ve daha fazla başlangıç biyolojik materyali kullanarak, transkripsiyon faktörleri, koaktivatörler veya RNA polimeraz 2 alt birimleri gibi transkripsiyonel düzenlemede yer alan diğer proteinlerin bağlanma profillerini araştırmak mümkün olmalıdır. Bir kez kurulduktan sonra, bu protokoller gelişim biyolojisi veya tıbbi genetik alanındaki araştırmacıların omurgalı genomlarının işlevsel değişimini iyileştirmelerini ve miyogenez, evrim ve insan hastalıklarının moleküler temeli hakkında önemli bilgiler edinmelerini sağlayacaktır.