Name: Bir 2-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü Ç Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırma ve sirküler dikroizm ile karakterizasyon yöntemlerini. Bu protokol, araştırmacılara modifiye oligonükleotit sentezinde standart ve tekrarlanabilir teknikler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazının hazırlanması, Colorado Denver Üniversitesi&#39;nden (JMRE) başlatılan fonlarla desteklendi. AF bir Araştırma ve Yaratıcı Etkinlikler ödülünün (RaCAS, CU Denver) desteğini kabul etmek istiyor. Colorado Denver Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Ofisi&#39;nden yayın masraflarını karşılamak üzere finanse edildi. Video bölümündeki katkıları için Bayan Cassandra Herbert ve Sayın Yannick K. Dzowo&#39;ya laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyoruz.

1. RNA Oligonükleotidlerinin Katı Faz Sentezi <ol><li> Her fosforamiditi içeren solüsyonların hazırlanması (Tablo 1). <ol><li> Nükleotid sayısını sayın ve her tabana karşılık gelen n + 1 denklemine (n = nükleotid sayısı) uyun ve eksik değerleri içeren tabloyu doldurun. Hacim = 0,1 M konsantrasyonda nükleotid başına 0,15 mL, susuz asetonitril içinde çözülmüştür. </li><li> Her bir fosforamiditi fırında kurutulmuş 10 mL kehribar şişelere (Septum Üst Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Üstü) tartın ve bir kurutma ajanı içeren bir desikatör kullanarak vakum altına yerleştirin. </li><li> Desikatörü kuru argon ile doldurun, şişeyi çıkarın ve alete sabitlemeden önce ilgili miktarda asetonitril ile (susuz) hemen inceltin. NOT: Gaz geçirmez şırınga kullandığınızdan ve susuz bir atmosfere sahip olduğunuzdan emin olun. </li><li> Şişeden septayı çıkarın ve mAchine, bir şişe değiştirme işlevi aracılığıyla. NOT: Bu işlem, sentezden önce hattı astarlamak için her bir çözeltinin ek bir 0.15 mL&#39;sini (dolayısıyla yukarıdaki n + 1 denklemindeki fazla hacim) gerektirir. </li></ol></li><li> Yazılımı kullanarak dizi ve katı faz sentezinin kurulması ( Şekil 3 ). <ol><li> Yazılım simgesini ( örn . OligoNet 1.0.1) tıklayın ve Gösterge adı&gt; Tamam&#39;ı seçin . Dosya&gt; Yeni Sentez&gt; Sipariş ile yeni bir sentez oluşturun. </li><li> Doldurun: Tarih; RunID; Alet seç; Sıra adı; Dizisi (5&#39;-3 &#39;sonu). Çevrimin altında, daha önce yaratılan yöntemi atayın ( Şekil 3 ). Son prosedürü seçin, ( oligonükleotid CPG reçinesine yapışır bırakır)&gt; manuel. </li><li> DMT Off&gt; (sentezin sonunda bir 5&#39;-OH grubu elde etmek için son adımda TCA muamelesi) seçin ; Dosya kaydet&gt; Farklı kaydetVe deney için bir isim verin. </li><li> Senteze başlamak için dosyayı gönderin Sipariş&gt; Sentezöre sipariş gönder ve sütunu seçin 1-4 . Synthesizer penceresini açın ve her adımı izlemek için trityl monitor | işlevi seçin | trity&gt; seçeneğini seçin. </li><li> Bir kerede sentezlenecek olan oligonükleotidlerin sayısına bağlı olarak adımları tekrarlayın (tüm siparişlerin aynı yöntemi, yani aynı eşleşme sürelerini ve olayların sırasını belirttiğine dikkat edin). </li><li> Sentez başlatmak Synthesizer&gt; Hazırlanmaya hazırlanın . Sütunları istenen 3&#39;üncü uçla birlikte alet üzerinde belirtilen konumlara yerleştirin. Enstrüman üzerinde Başlat&gt; Hayır&#39;ı tıklayın (ABI hazırlığı için). </li><li> Sentez tamamlandıktan sonra, kolonu aletten çıkarın ve yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin, ardından yaklaşık 0.5 saat boyunca düşük basınç altında kurutun. NOT: rand&#39;da derin bir portakal rengi olup olmadığını kontrol etmeniz önerilirTritil monitör işlevinden kaynaklanabilecek olası hataları önlemek için kaplinler (adım 1.2.4 - 1.2.7). </li></ol></li><li> RNA oligonükleotidlerinin korumasızlaştırılması ve saflaştırılması. <ol><li> Siyah kapağı çevirerek sütunu açın ve beyaz reçinenin tümünü veya bir kısmını 1.6 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne aktarın (veya ihtiyaca göre veya amacına göre). 1: 1&#39;de 0.5 mL metilamine (suda% 40) / amonyak (% 40 su) ekleyin. </li><li> Santrifüj tüp kapağını parafilm ile sabitleyin ve bir ısı bloğu kullanarak 1.5 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ısıtın. NOT: Amonyak konsantrasyonunun reaksiyon tüpü içinde sabit kaldığından emin olmak için tüpün üzerine ağır bir cisim yerleştirilebilir. </li><li> Isı bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar yavaşça soğutun. İçeriği aşağı doğru döndürmek için numuneyi kısaca santrifüjleyin, sonra süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Tüpleri sıvı azot (veya kuru buz / etanol banyosu) içine batırarak örnekleri dondurun ve dönerken kurumaya konsantre edinIndirgenmiş basınç altında bir santrifüjde karıştırın. </li><li> Katıları 0.4 mL trietilamin / N-metilpirolidinon / trietilamin-trihidroflorür (2: 2: 3 oranında) çözeltisinde yeniden askıya alınız. 1,5 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ısıtıp yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutulur. </li><li> 0.04 mL NaOAc çözeltisi (3M, pH 5.5 - HC1 ile ayarlanır) ilave edildikten sonra bir pipet ucu ile hafifçe karıştırılır. Etanol (1 mL) ilave edin ve ca. -70 ° C (kuru buz / etanol banyosu) 15 dakika boyunca. </li><li> 15.000 rpm&#39;de ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Alikuğin çıkarılması için bir pipet kullanın ve oluşan pelleti düşürülen basınç altında kurutun. </li><li> Elde edilen katı, yükleme tamponu (0.2 mL,% 90 sulu formamit, 1 mM EDTA) içinde yeniden askıya alın ve karışım homojen olana kadar karıştırın. </li><li> Süspansiyonu önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jeline yükleyin (% 20 denatüre edici, kuyu boyutları: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Jel üzerinde bromofenol mavi işareti 1 / 2-2 / 3 arasında bulunana kadar bir akım uygulayın.(Jel boyutları: ~ 21.5 cm x 30 cm). </li><li> Jeli standtan çıkarın ve jel içeriklerini camdan plastik sargısına (her iki tarafın üstü örtülü olarak) aktarın ve bantları görselleştirmek için silika ile kaplı ince tabaka kromatografi (TLC) plakasının üzerine yerleştirin (254 nm&#39;de floresan boya içerir) Bir UV-lamba kullanarak ( λmax = 254 nm). </li><li> Üst bandın bulunduğu konumu tanımlamak için bir işaretleyici kullanın ve yeni bir traş bıçağı kullanarak kesiniz. RNA içeren (plastik sarım olmadan) jel 50 mL&#39;lik konik bir tüp içine yerleştirilir ve bir cam çubuk kullanılarak küçük parçalara ezilir. </li><li> Jel artıkları bir NaCl aq içine asar. Solüsyonu (2 mM ve 1 mM EDTA) ilave edin ve süspansiyonu 37 ° C&#39;de 12 saat çalkalayın. Konik boruyu 10 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Bir ters faz C18 kartuşu kullanarak Desalt. <ol><li> Kartuşu, 10 mL şırınga kullanarak, aşağıdakilerle yıkayarak hazırlayın: Asetonitril (10 mL) H2O (iki kez, 10 mL) 5 mM NH4 Cl sulu. Çözeltisi (3 mL) RNA içeren çözelti, jel kalıntılarından hiçbirini dökmemeye özen gösterilir. </li><li> H2O ile (üç kez, 10 mL) yıkanır. </li><li> % 60 sulu bir çözeltiyi kullanarak kolondan alın. Metanol çözeltisi (3 mL) </li></ol></li><li> İndirgenmiş basınç altında konsantre edin ve RNaz içermeyen suda (0.3 mL) yeniden çözülür, </li><li> UV-vis spektrumunu (200-450 nm) ölçmek için, seyreltilmiş bir solüsyon (10 mcL) hazırlayın ve UV-vis aletine ( örn . Nanodrop) 1 mcL koyun. </li><li> Elde edilen çözeltinin konsantrasyonunu belirlemek için bira Lambert Kanunu kullanın: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Burada A = elde edilen absorbans; Ε = hesaplanan molar sönme katsayısı; C = konsantrasyon ve 1 mm&#39;lik bir yol uzunluğu için l = 0.1. </li><li> Oligonükleotitler için molar sönme katsayılarını hesaplayın; Burada bir on-line hesap makinesi ile hesaplanmıştırDINAMelt yazılımını kullanan (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> MALDI-TOF yoluyla yoğunlaşma tayini ve karakterizasyonu. <ol><li> Desalete tabi tutmak için bir C18 ucu yüklü bir pipet ucu kullanarak bir MALDI plakasına numuneler yükleyin ve her bir oligonükleotidi spot edin. <ol><li> Ucu% 50 asetonitril (10 uL x 2) ile yıkayın. Ucu% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA; 10 uL x 2) ile dengeleyin. İpucu örnekle yükleyin (tipik olarak 100-150 pmol). </li><li> Ucu% 0.1 TFA (10 uL x 2) ve daha sonra su (10 mcL x 2) ile yıkayın. </li><li> Numuneyi istenen matrisi içeren bir solüsyona süzün; % 50 asetonitril içerisinde 10 uL 25 mM-2,4,6-trihidroksiasetofenon monohidrat (THAP), 10 mM amonyum sitrat ve 300 mM amonyum florürden oluşan bir solüsyon kullandık. </li><li> Doğrudan MALDI plakası üzerinde, 0.9 uL (hava ile kurutma) takiben ve gerekirse prosedürü tekrarlayın. NOT: Tüm spektrumlar reflektör pozitif modunda elde edilmiştir. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. CD yoluyla RNA Yapı Analizi <ol><li> CD çözümleri hazırlama. <ol><li> Modifiye edilmiş RNA [3 uM] NaCl [10 mM] ihtiva eden 0.25 mL Hazırlama, sodyum fosfat tamponu [10 mM, pH 7.2] ve MgCl2 [5 mM]. Numune, analiz için hazırdır, özellikle de moleküler olmayan bir geçiş gösterirse. </li><li> Amaç, dupleks yapıları veya bimoleküler geçişleri analiz etmekse, şu an kompleman (mevcutsa 1 molar eşdeğer) ekleyin veya aşağıdaki adıma geçin. </li><li> Numuneyi, 90 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirin ve yavaş soğutmayı oda sıcaklığına (genellikle 2 - 4 saat) kontrol etmek için sıcaklığı kapatın. </li></ol></li><li> Spektrum edinimi <ol><li> Boş çözeltisi (NaCI, 10 mM sodyum fosfat, 10 mM, pH 7.3, MgCl2, 5 mM) hazırlanması, transfer tOa mikro-küvet (1 cm yol uzunluğu, 250 μL minimum hacim) yerleştirin ve cihaz içindeki numune değiştiricisinin bir tutma yerine yerleştirin. </li><li> RNA içeren örneği başka bir mikro küvete aktarın ve örnek değiştiricide konumlandırın. Termal denatürasyon geçişini ölçüyorsanız, sulu katmanı bozmadan bir yağ yatağı ekleyin ve bir parça Teflon bant kullanarak küvet kapağını sabitleyin. </li><li> Enstrümanda bulunan hava yüzer havasını yaklaşık olarak hareket ettiren bir akış sağlamak için azot tankını açın. 40. Soğutucuyu açın. </li><li> Cihazı açın ve yazılımı Spectra Manager simgesini açın, ardından satın alma penceresi Spectra Measurement&#39;i açın . </li><li> Alma işleminden önce aleti azot ile 5 dakika temizleyin. </li><li> Aşağıdaki parametreleri ölçün&gt; Parametreleri kullanarak spektrumları elde edin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: <ol><li> Genel altında şunları seçin: Tarama 200-350 nm; Kanallar CD ve HT: Veri0.1 nm&#39;de perde; 100 nm / dak&#39;da tarama hızı; 1 nm&#39;de bant genişliği; 5 birikim sayısı. </li><li> Hücre birimi altında 20 ° C&#39;yi seçin. Kontrol altında, Deklanşör otomatik olarak açılıp kapanır&#39;ı seçin. Bilgi altında, adı, konsantrasyon, operatör seçin. </li><li> Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam&#39;a tıklayın. </li></ol></li><li> Tamam tıklama, buna uygun olarak örnek değiştirici 1-6 küvetlerin pozisyon (lar) tespit, spektrumları Ölçü&gt; Örnek ölçümü elde edin. </li></ol></li><li> Termal denatürasyon geçişi yapacaksanız: <ol><li> Kapat Edinim yazılımı Dosya&gt; Çıkış ve yeni bir program açın Değişken Sıcaklık Ölçümü&gt; Ölçüm&gt; Parametreler . </li><li> İstenilen şekilde ayarlanabilen bir termal geçiş kaydetmek için aşağıdaki parametreleri uygulayın: <ol><li> Sıcaklık altında başlangıç ​​sıcaklığı seçin: 4 ° C; Aralık: 0.2; taRget: 90 ° C; Gradyan: 1 ° C / dak; 0 saniye bekle Başlangıç ​​/ Bitiş altında, Durum ve bitiş durumunu istediğiniz gibi seçin. </li><li> Genel altında, 3 Kanal, CD / HT / Abs; Bant genişliği: 1 nm; Dalga boyu: 270 nm (veya istenen şekilde). Kontrol altında, hiçbiri seçin. Bilgi altında, adını, yoğunluğunu, operatörünü seçin. </li><li> Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam&#39;a tıklayın. </li></ol></li><li> Örnekleri 4 ° C&#39;ye soğutun ve bir spektrum ölümü elde etmeden önce bu sıcaklıkta 5 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Spektrum için veri inceleme. <ol><li> Fonksiyonu yazılımda kullanarak, boş tayfı, hedef tayin etmeden, tampon sisteminden kaynaklanan arka plan sinyalleri için hesaba katın : Spektrum Analizi&gt; Dosya&gt; Aç . </li><li> Boş bir dosya ve bir spektrum dosyası açıldıktan sonra, Görünüm 2&#39;yi Görünüm 1&#39;in (ekranın sol tarafında) altında sürükleyin. </li><li> Pr için tıklayınÇıkarma&gt; çıkarma&gt; Tamam veya veri alışverişi&gt; Tamam . </li><li> Verileri bir ASCII dosyası olarak ayıklayın: Dosya&gt; Ver ve ASCII&#39;yi seçin. </li><li> Karşılık gelen spektrumu oluşturmak için yazılımı kullanın. Sinyal-gürültü oranının beklenenden düşük olduğu durumlarda verilerin düzleştirilmesi isteğe bağlıdır. Bu dönüşüm düzleştirme verisi seçeneğini uygulayarak uygulanabilir. </li></ol></li><li> Termal denatürasyon geçişleri için veri incelemesi. <ol><li> Verileri bir ASCII dosyası olarak JASCO dosyasından ayıklayın. </li><li> Eliptikite noktalarını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak çizin. Genellikle, incelenen dalga boyuna bağlı olarak verilerin düzeltilmesi gereklidir. Bazı durumlarda, 210 nm&#39;de dalga boyunun kullanımı düzleştirmeyi gerektiren çizimler arasında daha büyük varyasyonlar gösterdi. Bununla birlikte, numune ve konsantrasyonlara bağlı olarak, ham veriler kullanılarak bir takım hesaplamalar yapılmıştır. </li><li> Termal deneyi hesaplamak için(T m ) değeri, eğrinin birinci türevi elde edilir. Maksimum veya minimum bu parametrenin bir göstergesi idi. Önceki adımda olduğu gibi, bazı durumlarda en doğru değeri elde etmek için verilerin düzgünleştirilmesi gerekir. NOT: Deneyler tipik olarak üçlü olarak gerçekleştirilmiştir, bu da ölçüm için ilgili ortalama ve standart sapma ile sonuçlanmıştır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229210603_The_synthesis_of_oligodeoxyprimidines_on_a_polymer_support">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li>
<li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403901904617">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+Chemistry+and+its+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li>
<li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+Thermal+Stability%2C+Biophysical+Properties%2C+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2%27-O-2-Thiophenylmethyl+Groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li>
<li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li>
<li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoro+pyrimidines%3A+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li>
<li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li>
<li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li>
<li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li>
<li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li>
<li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA%3A+Pseudocomplementary+Invader+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li>
<li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001879588">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li>
<li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+N-%28deoxyguanosin-8-yl%29-2-acetylaminofluorene+%28dG-AAF%29+into+oligonucleotides+using+modified+%27ultra-mild%27+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+%28CEM%29+as+the+2%27-O.-protecting+group%3A+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li>
<li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties%2C+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex%2C+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li>
<li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+techniques%3A+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li>
<li>Mergny, J. -L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thermal+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li>
<li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethyl-2%27-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer%3A+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22CHEMBIOCHEM%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li>
<li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7%2C8-dihydro-8-hydroxyadenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Breslow, R., Huang, D. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+ions+including+Mg2%2B+and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu el yazısının amacı, DNA veya RNA&#39;nın oligonükleotidlerinin sentezini başarılı bir şekilde elde etmek veya arttırmak için alan, acemi veya uzman araştırmacılarına rehberlik etmektir. Açıklanan metodoloji, standart fosforamidit kimyası yoluyla otomatik bir DNA / RNA sentezleyicisi kullanan katı faz sentezinin kullanımına odaklanmaktadır. Raporda, RNA dodecamerlerin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu adım adım anlatılıyor. Buna ek olarak, CD&#39;nin kullanımı, ikincil yapısal motifleri ve termal denatürasy...

DNA / RNA&#39;nın oligonükleotidlerini elde etmek için katı-faz sentezi, 1970&#39;lerden beri çeşitli alanlarda, birçok uygulamaya hizmet eden güçlü bir araçtır 1 , 2 , 3 fosforamidit yapı taşları 4 kullanarak. Geniş etki örnekleri şunlardır: etiketleme (tıklama kimyası reaksiyonları yoluyla ) 5 , yapısal sondalama 6 ve antisens teknolojileri 7&#39;nin yanı sıra, biyolojik mekanizmaları 8 , 9 , genetik materyal olarak kaynakların aydınlatılması 10 ve burada kullanımı birçok others.The modifikasyon arasında çeşitli doğal ve / veya kimyasal modifikasyonlar 11, 12, ihtiva eden bir RNA oligonükleotid elde etmek için gerekli çabalarında ilk adımBu önemli biyopolimerin yapısını ve fonksiyonunu zamansal olarak kontrol edebilmek için fotoaktif sondalar. Diziler ile RNA dodekamerleri sentezi: 5 &#39;- [Cua CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [Ağustos AUU CCG UAG] -3&#39; (altı çizili konumları C2&#39;- O -thiophenylmethyl modifikasyonu dahil edilmesini temsil eder ) Bu çalışmanın odağını oluşturmaktadır. Diziler, RNA iplikçiklerinin tekli iplikçikler olarak veya bunların karşılık gelen dupleks yapıları olarak kantifikasyonunu ve ölçülmesini mümkün kılacak şekilde seçildi (diğer ikincil yapılar termodinamik olarak kararlı olarak tahmin edilmedi). Yapısal parametreleri, yani dupleks oluşumu ve termal denatürasyon geçişlerini oluşturmak için CD kullanıldı. sentez Bu oligonükleotidlerin elde edilmesine yönelik genel prosedür Şekil l&#39; de gösterilmekte ve kademeli süreç izlemektedir: otomatik katı faz sentezi → DeprOteksiyon → Saflaştırma → Niceleme → Karakterizasyon. Şekil 2 , bu prosedürde gerekli olan monomerik birimleri göstermektedir. RNA katı faz sentezi (Şekil 2, sol) ve örneğin, G, A ve C, nükleofilik eksosiklik aminler için baz etkisiyle değişen koruma gruplarının kullanımı, fosforamidit kimyası dayandığını DNA benzerdir, Asetil, benzoil, fenoksiasetil, t -butil veya N , N- dimetilformamid ( Şekil 2 , sağda). C2&#39;-OH grubunun (deoksoligonükleotid biyopolimerleri bulunmayan) varlığından dolayı RNA&#39;da göz önüne alınması gereken bir diğer husus, bu nükleofilik konumun korunması ve daha sonra korumanın kaldırılması için eklenmesi gereken ek adımdır. Bu bağlamda, silikondan koruma grupları, biorthogonal kısımları (specificallHalkalı seçimler olarak tert -butildimetilsilil (TBDMS) ve triizopropilsililoksimetil (TOM) gruplarıyla ( Şekil 2 , sol alt) fluorür varlığında korumanın bozulması). Bu çalışmada, otomatik sentez, standart fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Cihaz üzerindeki üretici ayarları, fosforamiditlerin ticari versiyonlarını DNA için kullanırken otomatik seyreltme adımı veya kullanıcı tarafından ayarlanan hacimlerde seyreltme seçeneği içerir. Bununla birlikte, RNA fosforamiditini tartmaya ve elle seyreltmeye karar verdik: 1) RNA&#39;nın kanonik fosforamiditlerinin fiyatı daha yüksek (bazı durumlarda 50 kat daha pahalı); 2) modifiye fosforamiditler genellikle küçük miktarlarda elde edilir; Ve 3) otomatik bir seyreltme basamağı (imalatçı tarafından belirlenmiş) kullanılarak atık malzeme miktarı büyüktür. Buna ilave olarak, 1) ticari olarak temin edilebilen katı destekler3&#39;-uç olarak işlev görecek şekilde korunmuş bir nükleobaz içeren bir antikor ( örn. , CPG); Ve 2) C2&#39;- O -konumunda bir TBDMS grubu ile korunan ticari fosforamiditler (kanonik nükleozazlar). Sentez adımlarının ayrıntılı listesi, Şekil 3 ve Tablo 1&#39;de RNA sentezi için ayarlanmış adımlar için ilave açıklamalar ve yorumlar ile birlikte verilmektedir. Ayrıca, Şekil 4 , her bir detritilasyon adımından çıkan tritil katyonu nicelleştiren &#39;Trityl Monitor&#39; seçeneğini seçtikten sonra her adım için gözlemlenen aşamalı verimleri göstermektedir. Deneyimimizde, tipik olarak sınırlayıcı faktör, istenen modifikasyonu içeren fosforamiditin elde edilmesiydi. Yani, seçilen yerlerde modifikasyonların yapılmasına izin veren sentetik bir metodolojinin geliştirilmesi. Bu raporda,Karşılık gelen sentetik metodoloji olan C2&#39;- O- tiyofenilmetil grubunu kurduğumuz, modifiye edilmiş bir nükleotidin dahil edilmesi. Bu grup, küçük boyutludur ve katı faz sentezini hiçbir şekilde etkilemez. Bu grubun, RNA oligonükleotidlerine dahil edilmesi, yapısal ve termodinamik parametreler 4 ile birlikte rapor edildiği için, burada, modifiye edilmiş fosforamiditlere yol açan organik sentezin hiçbir yönü tarif edilmeyecektir. Korumanın Arındırılması ve Karakterizasyonu Ekzosiklik aminlerin ve β-siyanoetil gruplarının korumasının bozulması, CPG-reçinesinden ayrılma ile aynı adımda gerçekleşir. Bu jel üzerinden ardından arıtma florür iyonu varlığında C2&#39;- O -silil gruplarının ayrılması yolu ile ve ardından AMA sulu bir çözeltisi varlığında elde edilen reçinenin ısıtılması, yaygın olarak kullanılan koşullar, uygulamalı veElektroforez. Bu, birçok durumda, standart koşullar, daha yumuşak koşullar 13, 14, örneğin, metanol / potasyum karbonat (MeOH / K 2CO, 3&#39;tür) veya bütilamin gerektirebilir bazik koşullar ya da florid iyonları ile kararsız olan modifikasyonlar haline iken. Dolayısıyla, karşılık gelen fosforamititlerin üzerinde farklı koruma grupları seti gereklidir. Ayrıca, bu yöntemle önceki tecrübelerimize ve diğer enstrümantasyon eksikliğine bakıldığında korumasız oligomerleri saflaştırmak için tercih edilen alternatif olarak elektroforezi seçtik. Bununla birlikte, HPLC etkili bir yöntem olarak alternatif olarak kullanılabilir 15 . Saflaştırılmış oligonükleotidlerin karakterizasyonu, 16 numaralı grubumuz tarafından bildirilen bir prosedür kullanılarak, kütle spektrometrisi, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonlaşma-uçuş süresi (MALDI-TOF) ile gerçekleştirildi. Yapısal karakterizasyonu ve özellikleri<html> Elde edilen dubleks mal stabilitesi CD üzerinden gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, CD&#39;nin modifiye ve modifiye edilmemiş oligonükleotidlerinin termal denatürasyon geçişlerini belirlemek için CD&#39;nin elastikiyetinde ca. 210 nm &#39;de bir λ max 270 nm, ve aynı zamanda (negatif elipslik) bandın kayboluşu. Hibridizasyon öncesi ve sonrası spektrum karşılaştırması, farklılıklarını göstermek ve kullanılan metodolojinin geçerliliğini sağlamak için verilmiştir. CD kullanımı, nükleik asitler ve aminoasitler 17&#39;deki yapısal motiflerin belirlenmesinde yaygın olarak kabul görür ve bu nedenle çeşitli yapısal ve termodinamik parametreleri belirlemek için bir araç olarak kullanılabilir 18 ; Bununla birlikte, tekniğin termal denatürasyon geçişlerini değerlendirmek için kullanıldığı pek çok örnek bulunmamaktadır. Bazı örnekler, G-quadruplex&#39;leri içeren DNA&#39;daki termal kararlılıkların belirlenmesini içerirAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 veya RNA 21&#39;in dubleksleri ve saç tokalarında. Bu rapor, uzman olmayan okuyucuya veya görüntüleyen kişiye, bu tür bir araştırmaya sorunsuz başlamasını sağlayacak bir dizi araç sunmayı amaçlamaktadır. Bu heyecan verici bilim dalında yer alan diğer araştırma laboratuarlarındaki metodolojiler ve tekniklerle geliştirmek ve karşılaştırmak için hizmet edecektir. Bu rapordaki içerik, bu teknolojinin mevcut protokollerini çeşitli kaynaklardan ekler ve her basamak için görsel bir yardımla deneyimi zenginleştirir ve kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril %99,9, HPLC Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril %99,9, DNA dizilimi için susuz</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid, %99+ACROS</td> <td>Organikler</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür %98+,</td> <td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sitrat, dibazik% 98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Florür &nbsp;% 98.0, ACS sınıfı</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit suda% 28 - 30, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra yüksek saflık</td> <td>&nbsp; Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akrilamid Ultra saf</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat, %97</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, susuz, histolojik sınıf</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu dehidrat% 100.2</td> <td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit, %36,5 - 38,0, Sertifikalı ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat, %99</td> <td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, %99,9,&nbsp; HPLC Sınıfı</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Metilamin suda% 40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Metil-2-pirolidinon vesusuz,% 99.5</td> <td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Kuyu Eki (123 x 81 mm) &nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Moleküler BiyoÜrünler</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat, susuz %99,2, Sertifikalı ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, %100,5, Sertifikalı ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik dihidrat %99,0</td> <td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' Trietilamin, %99+Alfa</td> <td>Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamin trihidroflorür, %98</td> <td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit, %99</td> <td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihidroksiasetofenon monohidrat %98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td><RNA sentezi için güçlü>reaktifler: </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>deblokaj çözücü karışım, diklorometan içinde %3 trikloroasetik asit</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Kap Karışımı A, THF/Piridin/Asetik anhidrit</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Kap Karışımı B, THF'de %10 1-metilimidazol</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Aktivatör, susuz asetonitril içinde 0.25 M 5-etiltio-1H-tetrazol</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Oksitleyici Çözelti, THF/Piridin/Su İçinde 0.02 M İyot</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Fosforamidit&nbsp;</td><td>Glen Araştırma</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Fosforamidit</td><td>Glen Araştırma</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Fosforamidit</td><td>Glen Araştırma</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Fosforamidit ve nbsp;</td><td>Glen Araştırma</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

bir 2&#39;-amino asit içeren rna oligomerlerinin katı faz sentezi protokolü<em&gt; Ç</em&gt; tiyofenilmetil değiştirme ve sirküler dikroizm ile karakterizasyonlar

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Katı faz sentezi, çeşitli alanlardaki uygulamalar için ve farklı araştırma amaçları için popüler bir metodoloji haline getirmiştir, özellikle DNA veya RNA&#39;dan oluşan, kanonik ve modifiye edilmiş nükleik asit polimerleri elde etmek için kullanılmıştır. Burada açıklanan prosedür, C2&#39;- O -konumunda bulunan sıfır, bir veya iki modifikasyon ihtiva eden RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; dodekamerlerinin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu üzerine odaklanmaktadır. Problar, standart organik sentez yoluyla RNA nükleotitlerine dahil edilen ve ilgili fosforamiditleri vasıtasıyla karşılık gelen oligonükleotidlere dahil edilen 2-tiyofenilmetil gruplarına dayanmaktadır. Bu rapor, fosforamidit kimyasından, iki kanonik nükleobaz (Uridin (U), Sitozin (C), Guanozin (G), Adenosin (A)) ve aynı zamanda 2&#39;- 0- konumunda modifiye edilmiş 2-tiyofenilmetil işlevselleştirilmiş nükleotidleri kullanmaktadır. pozisyon; Bununla birlikte, metodoloji büyük bir var için uygundurYıllar içinde geliştirilen değişiklikler. Oligonükleotidler, kontrollü gözenekli cam (CPG) desteğinde, ardından reçineden ayrılma ve standart koşullar altında korumanın bozulması, yani bir amonyak ve metilamin karışımı (AMA), bunu takiben hidrojen florür / trietilamin / N-metilpirolidinon kullanılarak sentezlendi. Karşılık gelen oligonükleotidler, poliakrilamid elektroforezi (% 20 denatürasyon) ile saflaştırılmış, akabinde eluyon, tuz giderme ve ters fazlı kromatografi (Sep-pak, C18 -kolon) yoluyla izole edilmiştir. Nicelik ve yapısal parametreler sırasıyla mor ötesi görünür (UV-vis) ve dairesel dikroizm (CD) fotometrik analizi ile değerlendirildi. Bu rapor, bu alana girmek isteyen yeni başlayanlar ve uzman araştırmacılar için bir kaynak ve rehber görevi görmeyi amaçlamaktadır. Yeni teknolojiler ve metodolojiler geliştirildiğinde ilerlemiş bir iş olarak hizmet etmesi bekleniyor. Bu metodolojilerin ve tekniklerin tanımıAdlı belge, fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisine (2013 yılında yenilenmiş ve satın alınmış) karşılık gelmektedir.

C2&#39;- O -konumunda sıfır, bir veya iki 2-tiyofenilmetil modifikasyonu içeren RNA dodekamerlerinin sentezi, ilgili saflaştırma ve karakterizasyonu ile birlikte açıklanmaktadır. Dahası, CD yoluyla gerçekleştirilen yapısal analizin ayrıntılı bir tarifi de dahildir. Dört RNA dizisi (tamamlayıcı bir sekansa sahip bir iplik dahil), katı faz sentezi yoluyla elde edildi ve onu her bir oligonükleotidden 300 - 700 nmol arıtm...

Bu makale, C2&#39;- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Bu raporun genel amacı, katı faz sentezi yoluyla RNA oligonükleotidleri elde etme prosedürünü örneklendirmektir. Model olarak RNA dodekamerleri sentezlenecek, bunların saflaştırılması ve karakterizasyonu da gösterilecektir. Bu yayın, görsel bileşeni aracılığıyla, çeşitli alanlardaki araştırmacıların kullandığı metodolojilerin ve olanakların kapsamını genişletecektir.Küçük bir protokol ile birlikte görsel bir yardımcı sunmak, araştırmacıların bu teknikleri kullanmalarına olanak sağlayacaktır. Bu tekniğin avantajlarından biri, çok çeşitli modifikasyonlara uygun olmasıdır. Günümüzdeki uygulamalar daha zorlayıcı hale geldikçe, standart bir protokole sahip olmak önem kazanmaktadır.Fosforamidit kimyası, yönteminin dayanıklılığı ve terapötik uygulamalar için oligonükleotidler elde etme potansiyeli nedeniyle yeniden canlanmaktadır. Oligonükleotid satın almak cazip olsa da, modifikasyonların fiyatı ve temini, bu oligomerlerin kurum içinde hazırlanmasına olan ilgiyi artırmakta, bu da söz konusu prosedürü son derece önemli kılmaktadır. Bu prosedüre başlamak için, her bir fosforamiditi fırında kurutulmuş 10 mililitrelik amber şişelere tartın ve her şişeyi önceden 20 gauge bir iğne ile delinmiş bir septumlu kapakla kapatın.Şişeleri, kurutucu madde içeren bir desikatör kullanarak derhal vakum altına alın. Desikatörü kuru argon ile doldurduktan sonra, her bir şişeyi çıkarın ve katı fazlı bir peptit sentezleyiciye sabitlemeden önce hemen susuz asetonitril ekleyin. Ardından, her şişenin septasını çıkarın ve şişe değişim fonksiyonu aracılığıyla sentezleyiciye yerleştirin.Katı faz sentezini kurmak için yazılım simgesini seçin. Sentezleyici adını seçin ve OK'ye tıklayın. Ardından, File ve New Synthesis Order seçeneklerini belirleyerek yeni bir sentez oluşturun. Bunu takiben, çalıştırma tarihini, müşteriyi ve çalıştırma kimliğini (run ID) girmek için istem penceresini kullanın. Enstrümanı, sekans adını ve sekansı seçin.Cycle sekmesi altında, önceden oluşturulmuş yöntemi atayın. Ardından, oligonükleotidin CPG reçinesine bağlı kalmasını sağlayan End Procedure manual seçeneğini seçin. DMT Off seçeneğini belirleyin.Dosya ve Farklı Kaydet seçeneklerini belirleyerek dosyayı kaydedin. Ardından, deney için bir isim girin ve Kaydet'e tıklayın. Sonrasında, Sentezleyiciye Siparişi Gönder ve Sipariş seçeneklerini belirleyerek sentezi başlatmak için dosyayı gönderin. İstem penceresinde bir kolon konumu seçin ve Tamam'a tıklayın. Sentezleyici penceresinde, Trityl İzleyici'yi seçin.Choose Function'a tıklayın ve her adımda 1 yazarak Trityl Monitor'ü takip edin. Synthesizer ve Prepare to Start seçeneklerini belirleyerek sentezi başlatın. Kolonları, istenen üç-prime ucu cihaz üzerinde belirtilen konumlarda olacak şekilde yerleştirin.Ardından, cihaz üzerinden Start ve No seçeneklerine tıklayın. Sentez tamamlandığında, kolonu cihazdan çıkarın ve yuvarlak tabanlı bir balona yerleştirin. Kolonu indirgenmiş basınç altında yaklaşık 0,5 saat boyunca kurutun.Beyaz reçineyi kolondan 1,6 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 0,5 mililitre sulu metilamin ve amonyak çözeltisi ekleyin. Santrifüj tüpü kapağını parafilm ile sabitleyin ve içeriği 60 derece Celsius'ta bir buçuk saat boyunca ısıtın. Konsantrasyonun sabit kalmasını sağlamak için tüplerin üzerine ağır bir nesne yerleştirin.Oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, içeriği çöktürmek için örneği kısaca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü beş dakika boyunca kuru buz-etanol banyosuna yerleştirerek 70 °C'ye soğutun ve ardından bir speed vac konsantratör kullanarak kuruyana kadar konsantre edin.Şimdi, katı maddeleri 0,4 mililitre amin trihidraflorür çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve ardından kapağı laboratuvar filmi ile sabitleyin. Çözeltiyi 60 °C'de bir buçuk saat boyunca ısıtın. Sabit konsantrasyonu sağlamak için tüplerin üzerine ağır bir nesne yerleştirin.Çözelti oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, 0,04 mililitre sodyum asetat çözeltisi ekleyin ve ardından bir pipet ucuyla nazikçe karıştırın. Bir mililitre etanol ekleyin ve çözeltiyi kuru buz-etanol banyosunda 15 dakika boyunca yaklaşık 70 derece santigrat sıcaklığa soğutun. Bunu takiben, çözeltiyi dört derece santigrat sıcaklıkta 15.000 RPM'de on dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı çekmek için bir pipet kullanın ve oluşan peleti indirgenmiş basınç altında kurutun. Kurutmanın ardından, elde edilen katıyı ve yükleme tamponunu resüspande edin ve çözelti homojen hale gelene kadar karıştırın. Ardından, süspansiyonu önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jele yükleyin.Bromotimol mavisi belirteci jel boyunca yarıya ila üçte iki oranında inene kadar jellerden elektrik akımı uygulayın. Jeli standdan çıkardıktan sonra, jel içeriğini camdan streç filme aktarın ve bantları UV lamba kullanarak görüntülemek için silika ile kaplı ince tabaka kromatografi plakası üzerine yerleştirin. Üst bandın bulunduğu konumu belirlemek için bir kalem kullanın ve burayı bir jilet yardımıyla kesin.RNA içeren jeli 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve bir cam çubuk kullanarak küçük parçalara ayırın. Ardından, jel kalıntılarını sulu bir sodyum klorür çözeltisi içinde süspande edin ve süspansiyonu 37 °C'de 12 saat boyunca çalkalayın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından 3400 RPM'de on dakika boyunca santrifüjleyin.Numuneyi ters faz C18 kartuşu kullanarak tuzdan arındırmak için, önce kartuşu asetonitril, su, sulu amonyum klorür ve RNA çözeltisi ile yıkayarak jel kalıntılarını geride bırakın. Su ile yıkama işleminin ardından, kolondaki RNA'yı üç mililitre %60 sulu metanol çözeltisi kullanarak üç farklı test tüpüne elüe edin. Tüpleri kuru buz banyosunda beş dakika boyunca 70 °C'ye soğutun ve ardından içerikleri bir speed vac konsantratör kullanarak kuruluk noktasına kadar konsantre edin.Elüatı düşük basınç altında konsantre ettikten sonra, kalıntıyı 0,3 mililitre RNase-free su içerisinde yeniden çözün. Çözeltiyi seyrelttikten sonra, 200 ile 450 nanometre arasındaki UV vis spektrumunu ölçmek için UV vis cihazına bir mikrolitre numune yerleştirin. MALDI-TOF analizi için, önce bir C18 pipet ucunu %50 acetonitrile ile yıkayın.Pipet ucunu %0,1 trifluoroasetik asit ile dengeleyin. Ardından, pipet ucuna 100 ila 150 pikomol numune içeren bir çözelti yükleyin. Pipet ucunu %0,1 TFA ve su ile yıkadıktan sonra, numuneyi istenen matriksi içeren bir çözeltiye elüye edin.Çözeltinin 0.9 µL'sini bir MALDI plakasına damlatın ve örneğin kurumasına izin verin. RNA yapı analizi için, RNA içeren örneği bir mikroküvete aktarın ve dairesel dikroizm cihazının örnek değiştiriciye yerleştirin. Cihaz üzerindeki hava şamandırasını yaklaşık 40 değerine getirecek bir akış sağlamak için azot tankını açın.Ardından, soğutucuyu açın. Şimdi, cihazı çalıştırın. Spectrum Manager simgesine tıklayarak yazılımı açın ve ardından Spectrum Measurement'a tıklayarak Acquisition penceresini açın.Cihaz azot ile temizlendikten sonra, Ölçüm (Measure) ve Parametreler (Parameters) seçeneklerini belirleyerek dairesel dikroizm spektrumlarını elde edin. Genel (General) sekmesi altında, tarama için 200-350 nanometreyi, kanallar için CD ve HT'yi, veri aralığı (data pitch) için 0,1 nanometreyi, tarama hızı için dakikada 100 nanometreyi, bant genişliği için bir nanometreyi ve akumülasyon sayısı için beşi seçin. Hücre Birimi (Cell Unit) sekmesi altında, 20 derece Celsius'u seçin.Kontrol sekmesi altında, Dekpan otomatik olarak açılır ve kapanır seçeneğini belirleyin. Bilgi sekmesi altında, numune adını, operatörü, konsantrasyonu ve çözücüyü girin. Veri sekmesi altında, istenen klasöre gidin ve Tamam'a tıklayın. Ölç ve Numune Ölçümü'ne tıklayarak spektrumları elde edin.Son olarak, birden altıya kadar olan örnek değiştirici içindeki küvetlerin konumlarını belirleyin ve Tamam'a tıklayın. Dört RNA zinciri katı faz sentezi yoluyla elde edilmiş ve saflaştırma sonrası her bir oligonükleotitten 300 ile 700 nanomol arasında ürün sağlanmıştır. Oligonükleotidlerin MALDI-TOF kromatogramları burada gösterilmektedir. Tek zincirli örnekler veya dupleks yapılar karşılaştırıldığında, 260 nanometredeki bant ile kanonik ve modifiye oligonükleotidlerin karşılaştırılmasından elde edilen normalize edilmiş UV vis spektrumlarında belirgin bir fark gözlemlenmemiştir.Buna karşın, dairesel dikroizm spektrumlarının ölçümü üzerine küçük değişiklikler gözlemlenmektedir. Ayrıca, üç dubleks yapının Tm ölçümleri, dizginlerden birine eklenen iki primer orto-fenilmetil modifikasyonunun neden olduğu destabilizasyonu belirten farklı bir değer göstermiştir. Katı faz sentezi veriminin reaktif saflığına bağlı olduğunu unutmamak önemlidir.Nem her adım üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olacaktır; çünkü mevcut su miktarı her zaman reaktif düzeyde tutulmalıdır. Bildirilen metodoloji, bilim insanları için genel bir kaynak teşkil etmek üzere tasarlanmıştır. Teknik, istenen modifikasyona, mevcut cihazlara veya zaman kısıtlamalarına bağlı olarak değişiklik gösterebilir.Burada kullanılan kimya türü, 1980'lerden beri kullanılan ve hem akademik hem de endüstriyel ortamlarda hala yoğun şekilde tercih edilen oldukça sağlam bir metodolojiyi temsil etmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kendi modifiye edilmiş veya kanonik RNA veya DNA oligonükleotidlerinizin sentezini, saflaştırmasını ve karakterizasyonunu gerçekleştirebilmeniz gerekir. Gerekli reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi koruyucu ekipmanlar her zaman takılmalıdır.Tüm reaktifler dikkatle ve uygun olduğunda bir çeker ocak içerisinde kullanılmalıdır.

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz yüksek verimli seçici 2 'hidroksil asilleme tek nükleotid çözünürlükte binlerce nükleotid birkaç yüz ile RNA'lar yapılarını belirlemek için bir teknoloji sondalama yeni kimyasal, ters transkripsiyon, kapiler elektroforez ve ikincil yapı tahmini yazılımı kullanır.

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Burada spirocyclic heterocycles sentezi için verimli bir yöntem göstermek için bir iletişim kuralı mevcut. Beş adımlık süreç katı fazlı sentezi ve Michael bağlayıcı stratejileri yeniden kullanır. Genellikle sentezlemek zor, biz spirocyclic moleküller diğer modern yaklaşımlar aksi ulaşılmaz sentezi için özelleştirilebilir bir yöntem mevcut.

Katı faz [4.4] Spirocyclic Oximes sentezi

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Burada RNA DNAzyme bağımlı dekolte için bir protokol salıyoruz. Bu, RNA 2'-O-metilasyonun hızlı ve yere bağlı analizini sağlar. Bu yaklaşım, snoRNA aktivitesinin ön veya önemli değerlendirilmesi için kullanılabilir.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

Burada, bir cDNA ara ürünü olmadan kısa RNA'yı (çalışma başına &lt;35 nt) dizilemek için doğrudan bir yöntem olarak ve tek bir çalışmada tek baz hassasiyetinde farklı nükleotid modifikasyonlarını dizilemek için genel bir yöntem olarak kullanılabilen LC-MS tabanlı bir dizileme yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

13 C/ 15 Netiketli ve etiketsiz RNA'da mikro-milisaniye dinamikleri1H R1φ  gevşeme dağılımı nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile ölçmek için bir protokol sunuyoruz.  Bu protokolün odak noktası, NMR deneylerinin yüksek saflıkta numune hazırlanması ve kurulumunda yatmaktadır.

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

Oligonükleotid 5′-trifosfatlar, esansiyel biyolojik yollarda her yerde bulunan bileşenlerdir ve biyoteknoloji uygulamalarında artan kullanım görmüştür. Burada, standart otomatik sentez teknikleriyle hazırlanan oligonükleotidlerden başlayarak oligonükleotid 5′-trifosfatların rutin sentezi ve saflaştırılması için teknikleri açıklıyoruz.

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

Öğrenin RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırma ve sirküler dikroizm ile karakterizasyon yöntemlerini. Bu protokol, araştırmacılara modifiye oligonükleotit sentezinde standart ve tekrarlanabilir teknikler sunar.

Bir 2-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü Ç Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar (Video) | JoVE Journal

Bir 2'-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü

Daha fazla video keşfet