Bir 2'-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü Ç Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Bu raporun genel amacı, katı faz sentezi yoluyla RNA'nın oligonükleotidlerini elde etme prosedürünü göstermektir. RNA'nın dodekamerleri model olarak sentezlenecek ve saflaştırılması ve karakterizasyonu da gösterilecektir. Görsel bileşeni sayesinde bu yayın, çeşitli alanlardaki araştırmacılara kullanılan metodolojilerin ve olanakların kapsamını genişletecektir.

Küçük bir protokolle birlikte görsel bir yardım sağlamak, araştırmacıların bu teknikleri kullanmalarını sağlayacaktır. Bu tekniğin bir avantajı, çok çeşitli modifikasyonlara uygun olmasıdır. Günümüz uygulamaları daha talepkar hale geldikçe, standart bir protokole sahip olmak önemlidir.

Fosforamidit kimyası, yöntemin sağlamlığı ve terapötik uygulamalar için bir oligonükleotid elde etme potansiyeli nedeniyle yeniden canlanıyor. Oligonükleotidlerin satın alınması cazip olsa da, modifikasyonların fiyatı ve mevcudiyeti, bu oligomerlerin şirket içinde hazırlanmasına olan ilgiyi kaydırır ve bu nedenle bu prosedürü son derece önemli hale getirir. Bu işleme başlamak için, her bir fosforamiditi fırında kurutulmuş 10 mililitrelik amber şişelere tartın ve her şişeyi daha önce 20 gauge iğne ile delinmiş bir septum ile kapatın.

Kurutma maddesi içeren bir kurutucu kullanarak şişeleri hemen vakum altına yerleştirin. Dessikatörü kuru argon ile doldurduktan sonra, her bir şişeyi çıkarın ve katı fazlı bir peptit sentezleyiciye sabitlemeden önce hemen susuz asetonitril ekleyin. Ardından, septayı her şişeden çıkarın ve bir şişe değiştirme işlevi aracılığıyla sentezleyiciye yerleştirin.

Katı faz sentezini ayarlamak için yazılım simgesini seçin. Sentezleyici adını seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, Dosya ve Yeni Sentez Sırası'nı seçerek yeni bir sentez oluşturun. Bunu takiben, çalışma tarihini, müşteriyi ve çalıştırma kimliğini girmek için bilgi istemi penceresini kullanın.Aracı, sıra adını ve sırayı seçin.

Döngü sekmesi altında, daha önce oluşturulan yöntemi atayın. Ardından, oligonükleotidi CPG reçinesine bağlı bırakan Prosedürü Sonlandır kılavuzunu seçin. DMT Kapalı'yı seçin.

Dosya ve Farklı Kaydet'i seçerek dosyayı kaydedin.Ardından, deneme için bir ad girin ve Kaydet'e tıklayın. Ardından, Siparişi Sırala ve Sentezleyiciye Gönder'i seçerek senteze başlamak için dosyayı gönderin. Bilgi istemi penceresinde bir sütun konumu seçin ve Tamam'a tıklayın. Synthesizer penceresinde Trityl Monitor'ü seçin.

İşlev Seç'e tıklayın ve her adımda 1 yazarak Trityl Monitor'e tıklayın. Sentezleyici'yi seçerek senteze başlayın ve Başlamaya Hazırlanın. İstenilen üç asal uca sahip sütunları enstrüman üzerinde belirtilen konumlara yerleştirin.

Ardından, tıklayın Başlama ve Hayır enstrümanda. Sentez tamamlandıktan sonra, sütunu cihazdan çıkarın ve yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin. Kolonu düşük basınç altında yaklaşık 0,5 saat kurutun.

Beyaz reçineyi kolondan 1.6 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 0.5 mililitre sulu metilamin ve amonyak çözeltisi ekleyin. Santrifüj tüpü kapağını parafilm ile sabitleyin ve içeriği bir buçuk saat boyunca 60 santigrat dereceye ısıtın. Konsantrasyonun sabit tutulduğundan emin olmak için tüplerin üzerine ağır bir nesne yerleştirin.

Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, içeriği döndürmek için numuneyi kısa bir süre santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Beş dakika boyunca kuru buz etanol banyosuna koyarak tüpü 70 santigrat dereceye kadar soğutun ve ardından bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kuruyana kadar konsantre edin.

Şimdi, katıları 0.4 mililitre bir amin trihidraflorür çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve ardından kapağı laboratuvar filmi ile sabitleyin. Çözeltiyi bir buçuk saat boyunca 60 santigrat dereceye ısıtın. Sabit konsantrasyonu sağlamak için tüplerin üzerine ağır bir nesne yerleştirin.

Çözeltiyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, 0.04 mililitre sodyum asetat çözeltisi ekleyin ve ardından bir pipet ucuyla hafifçe karıştırın. Bir mililitre etanol ekleyin ve çözeltiyi 15 dakika boyunca kuru buz etanol banyosu ile yaklaşık 70 santigrat dereceye soğutun. Bunu takiben, çözeltiyi on dakika boyunca dört santigrat derecede 15.000 RPM'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın ve elde edilen peleti düşük basınç altında kurutun. Kuruduktan sonra, elde edilen katı ve yükleme tamponunu tekrar süspanse edin ve çözelti homojen olana kadar karıştırın. Ardından, süspansiyonu önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin.

Brometimol mavisi işaretleyici jelin yarısı ila üçte ikisi arasında yer alana kadar jelin içinden bir akım uygulayın. Jeli standdan çıkardıktan sonra, jel içeriğini camdan plastik sargıya aktarın ve bantları bir UV lambası kullanarak görselleştirmek için silika kaplı ince bir tabaka kromatografi plakasının üzerine yerleştirin. Üst bandın bulunduğu konumu belirlemek için bir işaretleyici kullanın ve bir tıraş bıçağı kullanarak kesin.

RNA'yı içeren jeli 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve bir cam çubuk kullanarak küçük parçalara ayırın. Şimdi, jel kalıntılarını sulu bir sodyum klorür çözeltisine süspanse edin ve süspansiyonu 12 saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından on dakika boyunca 3400 RPM'de santrifüjleyin.

Ters fazlı bir C18 kartuşu kullanarak numuneyi tuzdan arındırmak için önce kartuşu asetonitril, su, sulu amonyum klorür ve RNA çözeltisi ile yıkayın ve jel kalıntılarını geride bırakın. Su ile yıkadıktan sonra, üç mililitre% 60 sulu metanol çözeltisi kullanarak RNA'yı kolondan üç farklı test tüpüne boşaltın. Tüpleri kuru bir buz banyosunda beş dakika boyunca 70 santigrat dereceye kadar soğutun ve ardından bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı kullanarak içindekileri kuruyana kadar konsantre edin.

Eluantı düşük basınç altında konsantre ettikten sonra, kalıntıyı 0.3 mililitre RNaz içermeyen suda yeniden çözün. Çözeltiyi seyrelttikten sonra, UV vis spektrumunu 200 ila 450 nanometre arasında ölçmek için UV vis cihazına bir mikrolitre biriktirin. MALDI-TOF analizi için önce bir C18 pipet ucunu %50 asetonitril ile yıkayın.

Pipet ucunu %0,1 trifloroasetik asit ile dengeleyin. Ardından, pipet ucunu 100 ila 150 pikomol numune içeren bir çözelti ile yükleyin. Pipet ucunu %0,1 TFA ve su ile yıkadıktan sonra, numuneyi istenen matrisi içeren bir çözeltiye boşaltın.

0.9 mikrolitre çözeltiyi bir MALDI plakasına bırakın ve numunenin kurumasını bekleyin. RNA yapısı analizi için, RNA içeren numuneyi bir mikro küvete aktarın ve dairesel bir dikroizm aletinin numune değiştiricisine yerleştirin. Cihaz üzerinde bulunan hava şamandırasını yaklaşık 40'a hareket ettiren bir akış sağlamak için nitrojen tankını açın.

Ardından soğutucuyu açın. Şimdi, enstrümanı açın. Spektrum Yöneticisi simgesine tıklayarak yazılımı açın ve ardından Spektrum Ölçümü'ne tıklayarak Edinme penceresini açın.

Cihazı nitrojenle temizledikten sonra, Ölçü ve Parametreler'i seçerek dairesel dikroizm spektrumlarını elde edin. Genel sekmesi altında, tarama için 200-350 nanometre, kanallar için CD ve HT, veri aralığı için 0,1 nanometre, tarama hızı için dakikada 100 nanometre, bant genişliği için bir nanometre ve birikim sayısı için beş seçin. Hücre Birimi sekmesi altında 20 santigrat derece'yi seçin.

Kontrol sekmesi altında, Deklanşör otomatik olarak açılır ve kapanır'ı seçin. Bilgi sekmesi altında, numune adını, operatörü, konsantrasyonu ve çözücüyü girin. Veri sekmesi altında, istediğiniz klasöre göz atın ve Tamam'a tıklayın. Ölç ve Numune Ölçümü'ne tıklayarak spektrumları edinin.

Son olarak, birden altıya kadar olan numune değiştiricideki küvetlerin konumlarını belirleyin ve Tamam'a tıklayın. Dört RNA ipliği, katı faz sentezi yoluyla elde edildi ve saflaştırmanın ardından her oligonükleotidin 300 ila 700 nanomolünü verdi. Oligonükleotidlerin MALDI-TOF kromatogramları burada gösterilmiştir. Tek sarmallı numuneler veya dubleks yapılar karşılaştırıldığında, 260 nanometredeki bant ile kanonik ve modifiye oligonükleotidlerin karşılaştırılmasından normalleştirilmiş UV vis spektrumlarında önemli bir fark gözlenmemiştir.

Bununla birlikte, dairesel dikroizm spektrumlarının ölçümü üzerine küçük değişiklikler gözlenir. Ek olarak, üç dubleks yapının Tm ölçümleri, ipliklerden birine iki ana otiyofenilmetil modifikasyonunun dahil edilmesiyle indüklenen kararsızlığın göstergesi olan farklı bir değer gösterdi. Katı faz sentezinin veriminin reaktif saflığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir.

Nemin her adım üzerinde olumsuz bir etkisi olacaktır, çünkü mevcut su miktarı her zaman reaktif olmalıdır. Rapor edilen metodoloji, bilim adamları için genel bir kaynak olarak hizmet etmeyi amaçlamaktadır. Teknik, istenen modifikasyona, mevcut enstrümantasyona veya zaman kısıtlamalarına bağlı olarak değişebilir.

Burada kullanılan kimya türü, 1980'lerden beri kullanılmakta olan ve hala akademik ve endüstriyel ortamlarda yoğun olarak kullanılan çok sağlam bir metodolojiyi temsil etmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, RNA veya DNA'nın kendi modifiye edilmiş veya kanonik oligonükleotidlerinin sentezini, saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu gerçekleştirebilmelisiniz. Gerekli reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi koruyucu ekipmanların her zaman giyilmesi gerektiğini unutmayın.

Tüm reaktifler dikkatli bir şekilde ve uygun olduğunda bir çeker ocak içinde kullanılmalıdır.