Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Bu prosedürün genel amacı, insan NK hücrelerininle sitotoksik aktivitesini değerlendirmektir. Bu yöntem, fonksiyonel veya klasik NK hücre eksikliği olan hastaların izlenmesinde kullanılabilir. Akış sitometresine dayalı bu tekniğin temel avantajları; hassas olması, tekrarlanabilir olması ve radyoaktif kromyum salınım testi gibi standart NK hücresi fonksiyon değerlendirme yöntemlerinden daha hızlı olmasıdır.

Bu yöntem, yeni NK hücresi hedefli tedavilerin test edilmesinin yanı sıra, NK hücresi biyolojisinin önceden ulaşılamayan derinlikte çok parametreli akış sitometrik analizleri için de kullanılabilir. Standart protokollere uygun olarak, tam kan örneklerinden periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) izole etmek için yoğunluk gradyanı ayrıştırmasıyla başlayın. Klinik örneklerle çalışırken saflaştırılmış NK hücreleri yerine PBMC'lerin kullanılması büyük fayda sağlar.

İzole edilen hücreleri, komple medyumu kullanarak mililitrede 5x10⁶ hücre konsantrasyonuna seyreltin ve K562 hedef hücrelerini santrifüj ile hemen toplayın. 5x10⁵ adet 562 hücresini, %1 FBS ile desteklenmiş 500 µL taze medyumu içinde yeniden süspande edin. Ardından, hedef hücreleri 500 µL CFSE çalışma çözeltisi ile işaretleyin ve hücre çözeltisini pipetleme yöntemiyle üç ila beş kez nazikçe karıştırın.

Işık koruması altında 37 °C'de 10 dakika beklettikten sonra, etiketleme reaksiyonunu oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 10 mL komple medya ile durdurun. Durdurma inkübasyonunun sonunda hücreleri santrifüjle toplayın ve sayım için etiketlenmiş hedef hücre peletini bir mL komple medya içinde yeniden süspande edin. Ardından hücreleri taze komple medya ile 1 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin ve hedef hücreleri nemlendirilmiş 37 °C ve %5 CO₂ içeren bir inkübatöre yerleştirin.

Başarılı bir analiz için, hedef hücre stresini minimuma indirin ve efektör hücreyi topladıktan sonra mümkün olan en kısa sürede test edin. Hedef hücre etiketlemesinden sonraki 30 dakika içinde, 96 kuyucuklu U tabanlı doku kültürü işleminden geçmiş plakayı tabloya göre etiketleyin. Ardından; 25'e bir, 12,5'e bir ve 6,25'e bir efektör/hedef hücre oranı kuyucuklarına, yalnızca hedef hücrelerin bulunduğu kuyucuklara ve yalnızca efektör hücrelerin bulunduğu kuyucuklara 100 µL tamamlanmış besiyeri ekleyin.

Sitotoksisite kontrol kuyucuklarına ve 50:1 ile 25:1 efektör hücre/hedef hücre oranı kuyucuklarına 100 µL efektör hücre ekleyin. Ardından, 25:1 efektör hücre/hedef hücre oranı kuyucuğuyla başlayarak, sadece hedef hücre içeren kuyucukları atlayıp, her hücre transferi arasında iyice karıştırarak, sonraki iki kuyucuk boyunca bir sonraki en düşük hücre oranı konsantrasyonuna sahip kuyucuğa 100 µL hücre aktarın ve son 100 µL hücreyi sadece efektör hücre içeren kuyucuklara ekleyin. Sadece Tween içeren K562 ölüm pozitif kontrol kuyucuklarına 100 µL 2X %0,2 Tween çalışma çözeltisi ekleyin.

NK hücre sitotoksisite pozitif kontrol kuyucuklarına 30 µL vial iki çalışma çözeltisi ekleyin. Ardından, yalnızca efektör hücrelerin bulunduğu kuyucuklar hariç tüm kuyucuklara, 100 µL komple medyuma hazırlanmış mililitre başına 1x10⁵ etiketli K562 hedef hücre ekleyin. Tüm hücreler ekildikten sonra, tüm kuyucukları çok kanallı pipet ile karıştırın.

Hücreleri kısa bir santrifüj işlemiyle çöktürün ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda plakayı buza veya soğuk bir platforma yerleştirin ve her kuyucuğa 50 µL taze hazırlanmış ölü hücre boyası ekleyin. Ardından tüm kuyucukları nazikçe karıştırın ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.

Az önce gösterildiği üzere, dört saatlik soğuk kültür sonrası CFSE ve ölü hücre boyamasının akış sitometrik analizi, yalnızca hedef hücrelerin bulunduğu kuyucuklardaki hücrelerin %15 veya daha az hücre ölümü yaşadığını ortaya koymaktadır. Yalnızca efektör hücrelerin bulunduğu kuyucuklarda hücre ölümü yüzde beşten az gözlemlenmişse, bu kuyucuklarda herhangi bir CFSE sinyali tespit edilmez. Tween aracılı hedef hücre öldürme kuyucuklarındaki hücre ölümü ise tipik olarak %85'in üzerindedir. NK hücre fonksiyonu kusuru olan hastalarda, sağlıklı bireylerle karşılaştırıldığında test edilen oranların çoğunda veya tamamında azalmış bir öldürme aktivitesi gözlemlenir; bu durum, söz konusu hastalardan alınan NK hücrelerinin, azalan efektör hedef hücre oranıyla korele olan farklılaşmış bir sitotoksisite azalması sergilediğini kanıtlamaktadır.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, iki saatlik hazırlık ve plakalama, dört saatlik inkübasyon ve 30 dakikalık veri toplama dahil olmak üzere toplam altı buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, hücre hazırlığı ile ko-inkübasyon başlangıcı arasındaki gecikme süresini en aza indirmek için hedef ve efektör hücrelerin paralel olarak hazırlanmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, insan NK hücrelerinin floresan işaretli hedef hücrelere karşı sitotoksik aktivitesinin akış sitometrisi ile nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.