Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi
19 Eylül 2017
Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.
Bu deneyin genel amacı, bakteri üremesini yüksek verimli bir şekilde hassas bir şekilde analiz etmektir. Bu prosedürü kullanarak, birden fazla ortam veya çeşitli suşlar aynı anda test edilebilir. Bu yöntem, sistem biyolojisi ve mikrobiyoloji alanlarında, hücre büyümesinin hangi belirleyici faktörlerin olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajları, araştırmacıların bakteri hücrelerinin büyüme eğrilerindeki maksimum büyüme hızı ve maksimum popülasyon yoğunluğunun küresel parametrelerini hassas bir şekilde değerlendirmelerine izin vermesidir. Bu yöntem e hakkında fikir verebilir. Coli büyümesi, çevresel bakterilerin büyüme tahlili ve taranması gibi diğer mikroorganizmalara da uygulanabilir.
Başlamak için, silikon kauçuk tıpalar, pipetler ve hedef suşları olan beş sterilize edilmiş cam tüpü temiz bir tezgaha yerleştirin. Silikon kauçuk tıpayı açmadan önce cam tüpün ağzını bir bunsen brülörüne maruz bırakın. Tüp açıldıktan sonra silikon kauçuk tıpayı aleve maruz bırakın ve ardından kapağı hafifçe cam tüpün üzerine geri yerleştirin.
Daha sonra, cam tüplerden birine beş mililitre M63 ve diğer dört tüpe 4,5 mililitre M63 eklemek için elektronik pipeti ve tek kullanımlık serolojik pipeti kullanın. Bir koloni seçmek için p200 ucunu kullanın ve beş mililitre M63 içeren cam tüpe aşılayın. Bir süspansiyon yapmak için tüpü girdaplayın.
Daha sonra, bu çözeltinin 0.5 mililitresini 4.5 mililitre M63 içeren dört tüpten birine aktararak çözeltiyi 10 kat seyreltin. Kalan tüpler için bu işlemi tekrarlayın. Cam tüplerin ağızlarını ve silikon kauçuk tıpaları sterilize ettikten sonra, tüpleri tıpalarla kapatın.
Ardından, beş tüpü 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir çalkalama inkübatöre yerleştirin ve 200 rpm'de sallayın. Kültürü gece boyunca veya 10 ila 30 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, p1000 ile tek kullanımlık bir küvete 1.000 mikrolitre M63 ekleyin.
Tek kullanımlık küveti bir spektrofotometreye yerleştirin. Programı 600 nanometrelik sabit bir dalga boyunda başlatın ve boşluğu ölçün. Beş cam tüpü çalkalama inkübatöründen temiz tezgaha taşıyın.
M63'ü tek kullanımlık küvetten atın ve p1000 ile aynı tek kullanımlık küvete 1.000 mikrolitre kültür ekleyin. Ardından, hücre kültürünün optik bulanıklığını ölçün. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir mikrotüpe 250 mikrolitre sterilize edilmiş% 60 gliserol çözeltisi ve 750 mikrolitre seçilen hücre kültürü ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
Kalan dokuz mikrotüpü mikrotüp standına yerleştirin ve hazırlanan karışımdan 100 mikrolitreyi her tüpe dağıtın. Stokları derin dondurucuda 80 derecede saklayın. Mikroplaka okuyucuyu kurmak için önce yazılımı açın, görev yöneticisinde protokolleri açın ve yeni oluştur'u seçin.
Ardından standart protokolü seçin. Prosedürü açın ve ayarları yapın. Ayarlanan sıcaklığı açın ve inkübatörü açın.
Ardından, sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve gradyanı sıfır santigrat dereceye ayarlayın. Bir sonraki adıma devam etmeden önce ön ısıtmayı kontrol edin. Başlangıç kinetiğini açın ve çalışma süresini 24 veya 48 dakika olarak ayarlayın, ardından aralığı 30 dakika veya bir saat olarak ayarlayın.
Sallamayı açın ve sallama modunu doğrusal olarak ayarlayın. Sürekli sarsıntıyı kontrol edin ve frekansı 567 cpm'ye ayarlayın. Ardından, okuma, absorbans, uç nokta/kinetik ve monokromatörleri kontrol edin.
Dalga boyunu 600 olarak ayarlayın. Son olarak, prosedürün doğru olduğunu onaylamak için doğrula'ya tıklayın. Ve ileride kullanmak üzere yeni bir program olarak kaydetmek için kaydet'i tıklayın.
Büyümenin gerçek zamanlı kaydı için, sterilize edilmiş bir reaktif rezervuarına yaklaşık 25 mililitre M63 ekleyin. Ardından, seri seyreltme yapmaya hazırlanırken mikrotüplere 900 mikrolitre M63 ekleyin. Ardından, çözülmüş gliserol stoğuna ve girdaba 900 mikrolitre M63 ekleyin.
10 kat seyreltmenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre M63 ve girdap içeren başka bir mikrotüpe aktarın. İstenilen seyreltme sayısı elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın. Şimdi, sekiz kanallı bir pipet kullanarak sterilize edilmiş 96 kuyulu düz tabanlı mikroplakanın kenarındaki kuyuları 200 mikrolitre M63 ile doldurun.
Her seyreltilmiş numuneden 200 mikrolitreyi referans tablosuna göre mikroplaka kuyucuklarına yükleyin. Isıtma ve tohumlama verimliliği nedeniyle tahsis katmanlarından kaçınmak için, numuneleriniz için asla mikroplakanın kenarındaki kuyucukları kullanmayın ve aynı numuneyi mikroplaka üzerinde çeşitli konumlarda birden fazla kuyuya yükleyin. 96 kuyulu mikroplakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
Şimdi oku ve görev yöneticisini açın ve programı seçin. Ölçüme başlamak için Tamam'a tıklayın. Son olarak, kaydı veri analizi için yeni bir deneysel dosya olarak kaydedin.
Burada, deney gerçekleştirilmeden önce yapılmış bir başvuru tablosu örneği gösterilmektedir. Aşılanmış kültür örneklerinin 96 oyuklu plaka üzerindeki konumlarını belirtmek için sekize 12 tablo olarak 96 oyuklu bir plaka piktogramı çizildi. Büyüme hızı, OD600'ün tüm ardışık değer çiftleri için denklem uygulanarak hesaplanır.
Maksimum büyüme oranını tahmin etmek için ardışık beş büyüme oranının ortalaması ve standart sapması hesaplandı. Toplam 60 hücre kültürünün büyüme oranları, görüntülenen ısı haritası olarak gösterilir. Beyazdan kırmızıya bozunma, düşükten yükseğe büyüme oranlarını gösterir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün ve sırayla yapılırsa birkaç dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bakteri üremelerinin yüksek verimli bir şekilde son derece hassas ölçümleri için numunelerin nasıl hazırlanacağını ve mikroplakaya nasıl yükleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, düşük yoğunluklu hücre kültürlerinden kaçınmak ve hücrelerin 24 saat içinde büyümeye başladığından emin olmak için deneyi gerçekleştirmeden önce bir referans tablosu yapmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, popülasyon yayılımı için belirleyici faktörlerin neler olduğu ve dinamiklerin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için deneysel manipülasyonun otomasyonu ve hesaplamalı analiz gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra sistem biyolojisi ve mikrobiyoloji alanlarındaki araştırmacıların önünü açmıştır. Hücre büyümesindeki temel prensipleri keşfetmek ve kültür ortamının bileşimlerini optimize etmek.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, mikrobiyal fizyolojiyi anlamak için kritik öneme sahip olan bakteriyel büyümenin hassas ve yüksek verimli analizi için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, hücre büyümesini etkileyen temel faktörlere dair içgörüler sağlayarak, birden fazla besiyerinin veya farklı suşların eş zamanlı olarak test edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyal fizyoloji
- Sistem biyolojisi
- Mikrobiyoloji
Arka Plan
- Bakteriyel büyümeyi anlamak, mikrobiyal fizyoloji için temel teşkil eder.
- Yüksek veri çıkışlı analizler, büyüme parametrelerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
- Bu yöntem çeşitli mikroorganizmalara uygulanabilir.
- Mikrobiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Bakteriyel büyümeyi hassasiyetle analiz etmek.
- Büyüme hızları ve popülasyon yoğunluğuna ilişkin küresel parametreleri değerlendirmek.
- E. coli ve diğer mikroorganizmaların büyümesine dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteriyel büyüme koşullarının deneysel manipülasyonu.
- Yüksek kapasiteli analiz teknikleri.
- Çok sayıda suş ve besiyerinin eş zamanlı test edilmesi.
- Bakteriler için büyüme eğrilerinin değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Elde edilen maksimal büyüme hızlarının kesin değerlendirmesi.
- Büyüme eğrilerindeki maksimal popülasyon yoğunluğunun belirlenmesi.
- Bakteriyel büyümeyi belirleyen faktörlere dair kazanılan bilgiler.
- Çevresel bakteri taramasına uygulanabilirlik.
Sonuçlar
- Bu yöntem, mikrobiyal büyüme dinamiklerinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Sistem biyolojisindeki gelecek araştırmalar için bir çerçeve sunmaktadır.
- Mikrobiyolojik çalışmalarda daha geniş uygulama potansiyeline sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Uygunluk
Yüksek kapasiteli bakteriyel büyüme analizi, suş uygunluğunun ve besiyeri optimizasyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak antimikrobiyal keşiflerdeki erken aşama hedef doğrulamasını destekler. Büyüme hızının ve popülasyon yoğunluğunun hassas bir şekilde nicelleştirilmesi, mikrobiyoloji odaklı süreçlerdeki öncü adayların risklerini azaltmak için öngörüsel güven sağlar. Bu yöntem, sistem biyolojisi ve translasyonel mikrobiyoloji araştırmalarında ölçeklenebilir, tekrarlanabilir fenotipik tarama ihtiyacını karşılamaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Farklı genetik veya çevresel koşullar altında hücresel zindelik için bir gösterge olarak maksimum büyüme hızını ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Çoklu besiyeri formülasyonları genelinde yabanıl tip ve mutant suşların yüksek kapasiteli karşılaştırması yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Büyümeye bağlı gen fonksiyon koordinasyonunu nicelendirerek hedef seçimindeki mekanistik belirsizliği azaltır ve portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yeniden üretilebilir analiz standardizasyonu için valide edilmiş bakteriyel stoklar hazırlar ve tarama kampanyaları boyunca tutarlı OD600 tabanlı okumalar sağlar.
- Operasyonel Değer: Onlarca suşun veya koşulun minimum reaktif tüketimiyle ölçeklenebilir ve paralel şekilde test edilmesine olanak tanıyan 96 kuyucuklu plaka formatını kullanır.
- Analiz Hazırlığı: Hit onayı için lag, eksponansiyel ve stasyoner fazları yakalayarak tarama güvenilirliğini artıran ayrıntılı zamansal büyüme eğrileri oluşturur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Çevresel ve patojenik bakterilerde hastalığa özgü sistem sadakatini koruyarak, keşif aşamasındaki büyüme fenotiplerini preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Risk Ayarlı İlerleme: Büyüme kinetiğini, transkriptom reorganizasyonu ve genom genelindeki fitness eğilimleriyle ilişkilendirerek devam/dur kararlarını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Klinik sonuçlar yerine büyümeye bağımlı yolaklardaki öngörü güvenilirliğine odaklanarak, erken aşamadaki risk azaltma hedefleriyle uyum sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken biyolojideki hipotez testlerinden, özellikle antimikrobiyal ve mikrobiyom hedefli programlarda öncü bileşik tanımlama için assay hazırlama aşamasına kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Gen nakavtları, promoter varyantları veya stres koşulları genelinde büyüme dinamiklerinin hassas karşılaştırılmasını sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış OD600 ölçümleri, tekrarlanabilir stok hazırlama ve hit doğrulaması için kinetik veri çıktısı aracılığıyla analiz hazırlığı sunar.
- Analitikler: Koşulların ve suş performansının istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanıyan maksimum büyüme hızı ve popülasyon yoğunluğu gibi nicel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Fizyolojik koşulları taklit eden, çevreyle ilgili bakterilerin ve ortamların kullanımı yoluyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde büyüme profilleme için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturarak redundant protokol geliştirmeyi azaltır ve ekipler arası veri uyumunu sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörüsel güven, büyüme bağlantılı yolaklardaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Farklı suşlar ve besiyerleri arasında büyüme ölçümlerinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Daha iyi devam/durdur kararları, paralel testler yoluyla sermaye verimliliği ve erken dönem antimikrobiyal programlarda azaltılmış biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Büyüme uygunluk verilerine dayalı riskten arındırılmış önceliklendirme ile güçlü fenotipik profillere sahip suşların ilerletilmesinin sağlanması.
Uygulama Hususları
- Steril teknik, stok hazırlama ve OD600 kalibrasyonu konularında mikrobiyoloji uzmanlığı gerektirir.
- Sıcaklık kontrollü, çalkalama özellikli ve 600 nm'de kinetik absorbans okuması yapabilen bir mikroplaka okuyucuya bağımlıdır.
- Kenar etkilerini önlemek için referans tablolarının, dilüsyon protokollerinin ve kuyucuk konumlandırmasının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri, yavaş büyüyen veya seçici (fastidious) suşlar için inokülum yoğunluğunun ve besiyeri bileşiminin ayarlanmasını içerir.
- Pratik sınırlama: CFU'ya kıyasla düşük popülasyon yoğunluklarında daha katı bir tespit limiti söz konusudur ve güvenilir sinyal için yeterli inokülum gereklidir.
