Fare retina arteriyoller Ex Vivo reaktivite ölçümü için hazırlık adımları

Bu retina hazırlama yönteminin genel amacı, fare retinal arter reaktivitesini ölçmek için video mikroskobisini kullanmaktır. Bu yöntem, retina kan akışı regülasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve çeşitli oküler hastalıkların patofizyolojisine dair anlayışımızı geliştirebilir. Bu yeni tekniğin temel avantajı, retinal kan damarı reaktivitesinin çok yüksek optik çözünürlükte ölçülmesine olanak tanımasıdır.

Aynı zamanda, çok gelişmiş ekipmanlara da ihtiyaç duymaz. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, oftalmik arteri ve dallarını bulmak zor olabileceği için güçlük çekebilirler. Bu prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrenciler Jenia Kouchek Zadeh ve Wael Omran ile birlikte uygulamalı olarak göstereceğim.

Gerekli aletleri hazırlayarak deneysel prosedürlere hazırlık yapın. Ardından, farenin kafatasını sagital olarak iki yarıya bölmek için bir çift çelik makas kullanın ve cildi ile beyni çıkarmak için göz makası kullanın. Sadece orbital kemik kalana kadar kafatası kemiğini çıkarmak için göz makasını kullanın ve orbiti, cerrahi bir mikroskop altında, buz üzerinde bulunan buz gibi soğuk Krebs-Henseleit tamponu içeren bir diseksiyon kabına aktarın.

Orbital kemiği göz makasıyla kesin; göz küresini ve orbital dokuyu nazikçe çıkarmak için tip dört hassas pens ve öğrenci tipi Vannas yaylı makas kullanın. Tip beş hassas pens ve Vannas kapsülotomi makası kullanarak, oftalmik arterin ana dalına zarar vermemeye dikkat ederek Harderian bezini, bağ dokusunu ve ekstraoküler kasları dikkatlice çıkarın. Oftalmik arterlerin ana dalının proksimal ucundaki orbital dalları bağlamak için 10-0 Naylon sütürler kullanın ve göz küresini %70 etanol içeren bir Petri kabına aktarmak için tip dört hassas pens kullanın.

Deney sırasında sızıntıyı önlemek için oftalmik arterin tüm orbital dallarının bağlanması çok önemlidir. 10 saniye sonra göz küresini diseksiyon kabına geri koyun. Kornea, etanol maruziyeti nedeniyle beyazımsı görünecektir.

Tamponu taze Krebs çözeltisi ile değiştirin ve periferik korneayı delmek için mikroskop ile üç numara iğne kullanın. Korneayı diseke etmek ve iris dokusunu nazikçe kesip ayırmak için Vannas kapsülotomi makasını kullanın. Ardından, Vannas kapsülotomi makasının sivri ucunu koroid ile retina arasına yerleştirip koroid ve sklera kısmını kesin.

Retinayı özel yapım bir perfüzyon odasına yerleştirmek için, önce 100 µm uç çapına sahip cam bir mikropipetin ucunu bir iğne tutucu yardımıyla odanın silikon tüpünün içine itin. Ardından, mikropipet ucundaki kalıntıları temizlemek için şırıngayı tüpün diğer ucuna bağlayın. Perfüzyon odasını soğuk Krebs tamponu ile doldurun ve odayı bir stereomikroskobun altına yerleştirin.

Perfüzyon odasının içerisine 1,8 milimetrelik bir girintiye sahip şeffaf plastik bir platformu, 1,6 milimetre çapındaki iki çelik telin üzerine yerleştirin ve platformun üzerine paslanmaz çelik bir halka koyun. Optik siniri ve oftalmik arteri hala bağlı olan retinayı bir kaşık yardımıyla platform üzerine aktarın ve oftalmik arterin dikişli ucunu çıkarın. Mikropipet üzerine 10-0 Naylon sütür ile yapılmış iki döngü yerleştirin ve arteri sütürler kullanarak mikropipete sabitleyin.

Retinayı şeffaf platformun üzerine yerleştirmek için bir adet ince uçlu cımbız kullanın ve ön lens kapsülünü nazikçe yırtarak açmak için ikinci bir ince uçlu cımbız çifti kullanın. Lensi dışarı çıkarın ve tüm lens kapsülünü ve vitreusu temizlemek için mikro makas kullanın. Ardından, pars plana ile optik sinir arasındaki mesafenin yarısında retinaya dört adet radyal insizyon yapın ve retinayı platforma sabitlemek için paslanmaz çelik halkayı retinanın üzerine yerleştirin.

Retinal arteriolleri analize hazırlamak için, perfüzyon haznesini bir ışık mikroskobunun altına taşıyın ve 100X su daldırma objektif lensini seçin. Tüpleri bir parasiklik pompanın giriş ve çıkış portlarına bağlayın ve hazneyi %95 oksijen ile oksijenlendirilmiş ve %5 karbondioksit ile karbonatlandırılmış 37 °C Krebs tamponu ile sirküle edin. Mikropipet donanımlı silikon tüpü, üç yollu bir musluk aracılığıyla bir rezervuar silikon hortumuna bağlayın ve rezervuarı 50 mmHg yüksekliğe karşılık gelecek şekilde Krebs tamponu ile doldurun.

Objektifleri kullanarak, kan damarlarını veya alyuvarları aramak için retinal yüzeye manuel olarak odaklanın. Bir kan damarı bulunduğunda, damara odaklanın ve üç yollu musluğu açın. Damarın çapı hemen genişlemeli ve alyuvarlar görünmelidir.

30 dakikalık bir dengeleme süresinin ardından, arterioller %10'dan daha az lüminal çap azalması ile zayıf intrinsik tonlar geliştirecektir. Banyo solüsyonuna fare retinal kısıtlayıcı reaktif ekleyin ve damar canlılığını doğrulayın. Ardından, agonisti banyodan uzaklaştırmak için pompayı çalıştırın ve hazneye taze Krebs tamponu ekleyin.

Bu temsili deneyde, bir tromboksan mimetik olan U46619, vahşi tip C57Bl/6J farelerinin retinal arteriollerinde, 1 × 10⁻⁶ M konsantrasyonda dinlenme halindeki lüminal çapta yaklaşık %50 azalmaya kadar konsantrasyona bağlı vazokonstriktör yanıtlar oluşturmuştur. Agonist ile önceden daraltılmış arteriollerde, asetilkolinin kümülatif uygulaması, sağlam bir vasküler endotelyuma işaret edecek şekilde, 1 × 10⁻⁵ M asetilkolin konsantrasyonunda lüminal çapta ön daraltılmış çapın yaklaşık %25'ine kadar konsantrasyona bağlı artışlar tetiklemiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde 90 ila 120 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürleri uygularken, oftalmik arterin torsiyonunu önlemek için göz küresini açmadan önce tüm retrobulber arter dallarını bağlamayı, gözü etanole daldırmayı ve son olarak cam mikropipet uçlarında tıkanıklık olup olmadığını kontrol etmeyi unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, fare retinasının in vitro video mikroskopi ile arteriyel ölçüm için nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.