Name: Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Öğrenin fare kortikal nöron kültürleri hazırlama yöntemini. Erken doğum sonrası dönem farelerinden elde edilen bu kültürler, elektrofizyoloji ve görüntüleme teknikleri için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kültür gün önce hazırlıklar: <ul><li> Steril diseksiyon çözüm (DS) hazırlayın. </li><li> NBM/B27 (B27 takviyeleri ile Neurobasal Mediom) hazırlayın. </li><li> Gerekirse Otoklav GKD 2 O ve cam coversilps sterilize edin. </li><li> Poli-D-lizin ile Coat doku kültürü yemekler ya da cam lamelleri. </li></ul> Poly-D-Lizin Kaplama: Steril koşullar altında kültür bir gün önce hazırlayın. <ul><li> 10X PDL ve buz üzerinde yer çözülme kısım. </li><li> PDL 1 ml 9 ml steril ultra-filtrelenmiş su ekleyin ve iyice karıştırın (1X). </li><li> 1X PDL ile aşağıdaki gibi oda sıcaklığında gece Coat yüzeyler: <ul><li> cam lamelleri (Bellco Cam, Inc Kedi # 1.943-00.012): 75 ul / lamel VEYA </li><li> 24 kuyu kültür plaka: 300 ul / iyi VEYA </li><li> 35mm kültür çanak: 1ml/dish </li></ul></li><li> 5X steril su (sıvı aspirat steril Pasteur pipetler) ile durulayın. </li><li> Yüzey tamamen kuruyana kadar su çıkarın. </li></ul> Kültürleme prosedürü (steril koşullar altında laminer akış kaput yapılan) <ol><li> Süper yapıştırıcı kullanarak mikrotom Vibraslicer (Chipping Instruments Ltd) destek blok üzerine agar blok ve tutkal bu kesin. </li><li> Geç embriyonik evre (E17-18) fare fetusların euthanise baraj kullanırken, embriyonik çuval rahim ve ücretsiz bireysel fetusların çıkarın. Steril Petri kabı içine yerleştirin fetus ve devam aşağıda özetlendiği gibi. </li><li> Başını kesmek fare fetüs veya yavru (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış takip esaslar). </li><li> Soğuk DS ile dolu bir 60mm petri Whatman filtre kağıdı diske deri ve kafatası yer ve beyin çıkarın. </li><li> Steril bir jilet kullanarak beyincik kesti. </li><li> Spatula kullanarak beyin Pick up ve filtre kağıdı üzerinde aşırı sıvı drenaj yerinde Vibraslicer destek blok ve tutkal beyin (kaudal tarafında ve karın kısmı karşı karşıya agar), daha sonra beyin transfer. </li><li> Odasının soğuk DS ile doldurun. Hız seçici 8-9 ayarlayın. </li><li> Koku alma ampul itibaren, 200-400 mikron bölümden kesin. Vibraslicer bıçak korteks içeri girdiğinde, 600μm koronal bölümleri kesme başlar. P0 fare beyin kullanılabilir 4-5 dilim verimleri E17-18 fare beyin, genellikle, 3-4 kullanışlı dilim verir. </li><li> 10 ml cam yeniden süspanse un-takılı ters ucunu kullanarak DS 2 etiketli 35 mm petri beyin dilimleri aktarın. </li><li> Korteks inceleyin ve kılcal tüpler çıkarılmış cam iğneler kullanarak meninksler kaldırmak. </li><li> Kortikal kabuklar, 0.5-1 mm uzunluğunda küçük parçalara kesin. </li><li> Süzülür ES 0.2 mm, 35 mm petri içine 5 cc şırınga bağlı filtre. </li><li> Kortikal doku parçaları süzülmüş ES içeren petri kabına aktarın. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li></ol> Bu arada: <ol><li> Davlumbaz, Vibraslicer ve kesme araçları temizleyiniz. </li><li> 60 mm petri içine sıcak NBM/B27 5 ml ekleyin. </li></ol> 30 dakika sonra. inkübasyon: <ol><li> 10 ml DS doku transferi. 1 dakika dinlendiriniz. </li><li> Ilk Merhaba tüp swirls doku transferi ve 2-3 dk razı bekleyin. </li><li> İkinci Hi aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> İlk Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> İkinci Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> Üçüncü Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın. </li><li> Medya ile 60 mm çanak doku transferi. </li></ol> Diseksiyon mikroskobu altında: <ol><li> Temizlik doku enkaz ve doku hafifçe gevşetmek için çekti damlalıklı cam (delik boyutlarını azaltarak kullanabilirsiniz) geçerek her bir parça çiğnemek. </li><li> 15 ml konik tüp NBM + B27 dinlenme (- 35 mm yemekleri hafifçe karıştırın ve yerleşmek için büyük doku parçaları için bekleyin 5 için 24 plaka ya da 11 ml, 13 ml toplam olun) içeren hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Transfer hücre süspansiyonu (24 plaka ya da 2 ml / 35 mm kültür çanak / de 0,5 ml). </li><li> Cam lamelleri kullanırken, lamel başına 80 ul hücre süspansiyonu ekleyin ve 1 saat içinde doku kültürü inkübatör izin hücreleri NBM/B27 medya ile daha odasına sel önce uyması için. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 kültürler koruyun. </li></ol> Sonraki Gün 24 plaka: NBM/B27 orta klimalı 0.5 ml nöronal olmayan hücre ile her iyi besleyin (cNBM/B27 cNBM/B27 orta hazırlanması için protokol altında görüntülenir) 35mm yemekler: cNBM/B27 orta ile 0,5 ml değiştirin. 0.5 ml taze cNBM/B27 2-3 günde bir orta yerine kültür koruyun. Kültür ortamı glia hücre çoğalması teşvik olmamasına rağmen, kültürler gerekirse glial hücrelerin sayısını azaltmak için kültür günde 3-5 5μM FDU (5-Fluoro-2&#39;-dezoksiuridin, Sigma F0503) ile tedavi edilebilir. SET<html> -UP Diseksiyon ve Kültür % 70 EtOH diseksiyon araçları sterilize veya onlara otoklavda: <ul><li> Makas (med. küçük) Spatula (med. ve küçük) </li><li> Cımbız (med. ve küçük) jilet </li><li> Blade vibraslicer Tampon banyo için </li><li> Beyin için bıçak Destek için küçük metal kama </li></ul> Diğer malzemeler: <ul><li> Petri kapları (60 mm) </li><li> Petri kapları (35 mm) </li><li> Filtre kağıdı </li><li> Cam pipetlemeyin 10 ml </li><li> Steril tek kullanımlık pipetler, 5,10 ve 25 ml </li><li> Şırınga filtre 0.2 mikron </li><li> Şırınga 5 cc </li><li> Santrifüj tüpleri, 15 ml </li><li> Steril Pasteur cam pipetler </li><li> PDL kaplı kültür kaplarına veya cam lamelleri </li></ul> Etiket altı 15 ml santrifüj tüplerine ve hazırlık uygulayın: Tüp # 1: Enzim çözüm: Içeren 5 ml DS papain (Worthington LS 03.126) 50 U ekleyin: <ul><li> L-sistein 100μl (0.8mg) </li><li> 7 ul 0,1 N NaOH </li><li> 50 ul APV (5mM) </li></ul> Temizlemek için, oda sıcaklığında çözüm bırakın. Bu enzim çözeltisi ilk &#39;bulutlu&#39; görünür ve kullanmadan önce temizlemek gerekir. Tüp # 2 # 3: Merhaba Enzim İnhibitörü: 3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 ul APV (5mM). Kabarcıkları önlemek için yavaşça karıştırın, daha sonra iki 1.5ml alikotları bölmek. Tüp # 4 - # 6: Düşük Enzim İnhibitörü: 8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ul APV (5mM). Kabarcıkları önlemek için yavaşça karıştırın, üç 2.6 ml alikotları bölmek. Yeri tüpleri, buz üzerinde # # 6 üzerinden 2 sayılı. Tüp # 1 (Enzim Çözüm) oda sıcaklığında bekletin. Çözümler VE Alikot <ul><li> Çözüm A (Tuzlu Tamponlanmış) Sigma Formula wt 500 ml [kons.] </li><li> Sodyum Klorür NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm </li><li> Potasyum klorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mM </li><li> Sodyum Fosfat Dibazik susuz Na 2 HPO 4, S-0876 142,0 0.24g 0.17mM </li><li> Potasyum Fosfat mono susuz KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0.3g 0.22mm </li></ul> 400 ml ultra filtre edilmiş su ile çözülür kadar tüm malzemeyi ve karıştırın tartılır. Son hacim 500 ml getirin. , Temiz bir şişe ve otoklav yerleştirin. Mağaza, 4 ° C ve etiket &quot;DS Çözümü&quot;. <ul><li> Çözüm B (HEPES) Sigma Formula wt 250 ml [kons] </li><li> HEPES HEPES H-3375 283.3 20.97g 9,9 </li></ul> 200 ml ultra-filtrelenmiş su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın ve son hacim 250 ml getirmek. , Temiz bir şişe ve otoklav yerleştirin. Mağaza, 4 ° C ve etiket &quot;DS Çözüm B&quot;. <ul><li> Çalışma Çözüm 500 ml kons.] </li><li> Ultra süzülmüş su 400 ml </li><li> Stok çözelti 25 ml </li><li> Stok Çözüm B 14 ml </li><li> D-Glukoz (+) Sigma G-8270 3.0 g 33.3mM </li><li> Sakkaroz Sigma G-0389 7.5 g 43.8 mM </li></ul> 1N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Ultra filtre edilmiş su ile 500 ml son hacim kazandırın. Temiz bir cam şişe ve otoklav içine süzün. 4 ° C saklayınız Etiket, &quot;Diseksiyon Çözüm&quot;. Poly-D-Lizin Hazırlanışı: <ol><li> 1mg/ml steril H 2 O; 10x stok solüsyonu poli-D-lisin (Sigma P-7280 PDL) hazırlayın. </li><li> 1.0 ml alikotları olun. Bu çözüm için -20 ° C&#39;de 3 aya kadar saklanabilir. </li></ol> MEDYA <ol><li> 10ml B-27 Supplement (Gibco 17.504-044), 500 ml NBM şişe (Neurobasal Orta, Gibco 21.103-049). </li><li> 4 40 ml alikotları ve mağaza olun ° C </li></ol> APV <ol><li> APV 10 mg flakon 10 ml steril H 2 O (2-Amino-5-phosphonopentanoic asit, Sigma A-5282) ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> -20 ° C&#39;de 180 ul alikotları ve mağaza hazırlayın </li></ol> BSA / Ti <ol><li> 1 g BSA (Bovine Albumin. Sigma A-7030) ve 1 g tripsin inhibitörü (Sigma T-9253) 10 ml DS eritin. </li><li> 1N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. </li><li> 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtreleme ile sterilize edin. </li><li> -20 ° C&#39;de 400 ul alikotları ve mağaza içine Böl </li></ol> L-sistein Eppendorf tüp 200 ul DS 0.6 mg L-Sistein (Sigma C-7755) çözülür. AGAR (% 4) <ol><li> 100 ml steril su Bacto Agar 4 g (Difco 0140-01) eritin. Kültür için gerekli 4 ° C kadar tutun. </li><li> Mikrodalga Agar 35 mm petri eritebilir ve doldurun. Soğumasını ve polimerize bekletin. </li></ol> Papain (Worthington LS 03.126) Nunc Kültür şişelerde E_TITLE &quot;&gt; nöronal olmayan KÜLTÜRLER KAPLAMA Kültür ŞİŞE (4 Nunc şişe) <ol><li> 1X PDL yapmak için 3 tüplerin 10X PDL her birine 9 ml steril su ekleyin. </li><li> İlk şişe 30 ml 1X PDL aktarın. </li><li> Tüm büyüme yüzeyleri kaplıdır kadar hafifçe hareket ettirin. 1 dakika boyunca bekletin. </li><li> Ikinci şişe 1x PDL aktarın. 1 dakika boyunca bekletin. </li><li> Üçüncü ve dördüncü şişe ile tekrarlayın. </li><li> Durulama 150 ml steril H 2 O. ile 2X dört şişe </li></ol> ENZİM ÇÖZÜM (ES) HAZIRLANMANIZI: <ol><li> Kristalleri eriyene kadar 0,6 ml santrifüj tüpüne ağırlığı 0.8 mg L-Sistein (Sigma C7755) dışarı, 150ml DS ve vorteks eklemek. </li><li> 15 ml konik tüp 5 ml DS aktarın, sonra L-Sistein 150ml ekleyin. </li><li> 50 ünite Papain ekleyin. (Worthington LS 03.126) </li><li> 7ml 0.1N NaOH ekleyin. </li></ol> PREPARE MEM (Gibco # 11.090-081) <ol><li> 65 ml, 500 ml MEM şişeden çıkarın. Glikoz hazırlamak için 10 ml kaydedin. </li><li> 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15.070-063) ekleyin. </li><li> 10 ml 1M Glikoz (Sigma G-8270) (1.8 g / 10 ml MEM) </li><li> 50 ml fetal Bovine Serum (Gibco # 16.140-071) veya Sığır Buzağı Serumu (Omega BC-04). </li><li> Iyice karıştırınız, 4 kısım ve mağaza ° C </li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27 EKİ (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21.103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17.504-044) <ol><li> NBM şişe ve karıştırmak için B-27 flakon tüm içeriği ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de kısım ve mağaza </li></ol> BEYİN DOKU VE DİSEKSİYON <ol><li> Kuru araçları diseksiyon diseksiyon önce% 70 EtOH. </li><li> 3-15 ml tüp her 10 ml DS aktarın. </li><li> Fare yavrular (P0-P3) seçin, 4 şişe üç beyinleri gerekecektir. </li><li> 35 mm petri soğuk DS ekleyin. </li><li> Fare yavru başını kesmek ve beynini teşrih. </li><li> Soğuk DS içeren petri içine yerleştirin beyinleri. </li><li> Doku bir cam pipet geçmesine kadar küçük parçalar halinde doğrayın. </li></ol> ENZİM AYRILMA <ol><li> Tabak Pasteur pipeti ile mümkün olduğu kadar çok DS kaldırın. </li><li> 0.2 mikron filtre ve 5cc şırınga ES süzülür. </li><li> ES doku ile tabak koyun. </li><li> 37 ° doku inkübe dakika süreyle 30 ° C inkübatör (CO 2 ücretsiz). </li></ol> DOKU YIKAMA <ol><li> İlk DS tüp cam pipet ile transfer doku, mümkün olduğunca az ES olarak elde etmek için emin olun. </li><li> 1500 devirde 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Doku ve tekrar işlem iki kez daha aktarın. </li></ol> Öğütme <ol><li> 50ml santrifüj tüpü içine 38 ml MEM / FBS yerleştirin. </li><li> Bu petri 35 mm çanak ve transfer dokusu, MEM / FBS 3 ml ekleyin. </li><li> 1000μl Eppendorf pipetlemeyin ucu ile hafifçe triturating tarafından doku ayrıştırmaları. </li><li> MEM / FBS içeren tüp 38ml hücre süspansiyonu aktarın ve iyice karıştırın. </li></ol> KAPLAMA <ol><li> Her şişe eşit miktarda hücre süspansiyonu ve medya kültürü şişeleri dik durun. </li><li> Her kültürün şişe 90 ml MEM / FBS koyun. </li><li> Her şişede 10 ml hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> Etiket: Sigara Nöronal, baş harflerini ve tarih. 37 ° ° C ve% 5 CO 2 inkübe edin. </li></ol> BESLEME <ol><li> Gün 3 veya 4, sıcak MEM / FBS (süzün tüm medya ve MEM / FBS 100 ml) ile beslenirler hücreleri,. Kültürler konfluent olmak için 7-10 gün sürebilir. </li><li> Gün 7-10 NBM/B27 için ortam değiştirin. </li><li> Ertesi gün, medyanın toplamak. 0.22μm Filter </li><li> 40 ml hacimde ve MEM / FBS ile kültürü beslemek. </li><li> Sonraki 2 ya da 3 gün, NBM/B27 ortamı değiştirmek </li><li> Ertesi gün, toplamak ve işlemi tekrarlayın. </li><li> Yaklaşık medya toplama tutun. 2 hafta. </li></ol>

Yazarların beyan edilecek bir çıkar çatışması yoktur.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deoksiridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplementi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Besiyeri (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-5-fosfonopentanoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin İnhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit, 1N çözelti</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Steril 0.2 &amp;mu;m Şırınga Filtresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Cam Lamel, No1, 12mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Besiyeri (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>L-glutamin içermeyen Earle&amp;rsquo; tuzları ile; nöronal olmayan kültürlerin büyütülmesi için gereklidir</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>nöronal olmayan kültürler için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>nöronal olmayan kültürler için gereklidir</td></tr><tr><td>Nunclon &quot;Triple Flask&quot; Doku Kültürü Şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Nöronal olmayan kültürler için kullanın. Bu şişeler &quot;kondisyonlu Neurobasal Besiyeri/B27&quot; üretirken çok kullanışlıdır, ancak bunun yerine herhangi bir başka doku kültürü şişesi veya kabı kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Cam tabanlı &quot;Görüntüleme kapları&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Ters görüntüleme düzeneği kullanırken Kalsiyum veya Sodyum Görüntüleme için ideal olan cam tabanlı, 35mm kültür kapları. Ancak pahalıdır!</td></tr></tbody></table>

grubuyla fare kortikal nöron kültürler hazırlanması

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare beyin kortikal nöronal kültürlerin üretmek için süreç boyunca size rehberlik edecektir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme, protein ve / veya RNA izolasyon da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir. Bu kültürler de, geç embriyonik ya da doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal gelişim çalışması için bir platform sağlar. Bu prosedür, nispeten düz ileri doku kültürü tekniği biraz tecrübe gerektirir ve düzgün bir şekilde hazırlanır 2-3 saat daha uzun sürmemelidir. Talamo-kortikal fiber kanaldan kortikal kabuklu dikkatli olarak ayrılması istenmeyen non-nöronal hücrelerin sayısını azaltacaktır. Nöronal hücrelerin verimi enzim inkübasyon adımdan sonra yavaşça kortikal doku parçalarını çiğnemek artırmak için. Hücreleri ve erken nöronal hücre ölümü gereksiz hasarı önlediğini Bu zorunludur. Bu kültürlerin glia besleyici hücrelerin yokluğunda korunur, aynı zamanda nöronlarda zenginleştirilmiş büyüyen kültürlerin ilave bir avantaj sağlayacaktır.

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare kortekste nöronal kültürlerin üretmek için bir prosedür gösterir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme için kullanılan ve doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal geliştirme çalışması için bir platform sağlamak olabilir.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

Bu video, geç embriyonik ve erken postnatal fare beyninden kortikal nöronal kültürler oluşturma süreci boyunca size rehberlik edecektir. Bu kültürler ...

Merhaba, benim adım Hilgenberg. California'daki Irvine Üniversitesi'nde, Anatomi ve Nörobiyoloji Bölümü'nde çalışıyorum. Bugün size farelerden kortikal kültürleri nasıl hazırladığımız hakkında bilgi vereceğim.Bu nöronları hazırladığımız fareler postnatal gün fareleridir. Bu kültürleri genellikle elektrofizyoloji ya da protein veya RNA preparasyonları için kullanırız. Aynı kültür hazırlığını kalsiyum görüntüleme veya sodyum görüntüleme için de kullanıyoruz.Bu kültürlerin güzel yanı, aslında banker protokolünün bir adaptasyonu olmasıdır; ancak bu kültürleri glial besleyici hücreler olmadan büyütüyoruz, bu da işlemi çok daha kolay hale getiriyor ve kültürler genellikle glial hücrelerden ziyade nöronlar açısından daha zengin oluyor. Öyleyse başlayalım ve size bu nöronları nasıl hazırladığımızı göstereyim. Tamam, şimdi beyni çıkarabileceğimiz ve asıl diseksiyona başlayabileceğimiz noktadayız.Ancak öncesinde, bu hücreleri ekmek istediğiniz lamellerin kaplanması gerektiğini belirtmek önemlidir. Biz bunu genellikle oda sıcaklığında, 0.1 mg/mL polylysine konsantrasyonu ile gece boyunca yapmaktayız. Ertesi gün gelip polylysine'i uzaklaştırır ve lamelleri art arda üç kez yıkarız.Uygulamaya bağlı olarak büyük kaplar, küçük kaplar veya cam lamel kullanabilirsiniz. Pekâlâ, çeker ocak için tipik kurulum bu şekildedir; hangi çözeltileri hazır bulundurmanız gerektiğini, ayrıca beynin izolasyonu veya diseksiyonu ve ardından beynin gerçek kesitlerinin alınması için hangi aletlerin kullanışlı olduğunu size kısaca açıkladım. Burada bulunan, soğutulmuş diseksiyon çözeltisidir.Genellikle buz üzerinde tutulur. Beyinleri dilimlemek için kullandığımız bir vibratomu vardır. Beynin üzerine yerleştirildiği ve ardından dilimlendiği, diseksiyon çözeltisi içeren bir kabım bulunmaktadır.Beyni çıkarmak için ihtiyaç duyduğum çeşitli araçlarım var. Beyni sabit tutmak için kullandığım bir delme plakası mevcut.Bir şırıngaya, birkaç steril filtreye, Rotman kağıt kaplara ve çeşitli boyutlarda Petri kaplarına ihtiyacımız var. Bu da fare boru vurma aracım. Ayrıca burada çekilmiş cam pipetlerim de var.Bunlar, hem diseksiyon araçları olarak hem de beyin parçalarını toplamak ve temel olarak bunları tekrarlamak için kullandığım cam kapillerlerdir. Enzim solüsyonumuz, diseksiyon solüsyonu içerir. İçerisinde, papain'i aktive etmek için L-sistein ve pH'ı dengelemek için 0,1 normal sodyum hidroksit bulunmaktadır.Pepain eklendiğinde çözelti biraz bulanık olur ve dokunun enzimatik sindirimi için kullanılabilmesi önce berraklaşması gerekir. Artık prosedüre başlamak için temel olarak hazırız. FibroSlicer hazırlanmıştır.Beyin kesitlerini almak için bir bıçak yerleştirdim ve ayrıca altına, tampon çözelti içeren ve beyni destekleyen kabı koydum. Şimdi, beyni de destekleyecek olan destek plakama AGA bloğunu monte etmeye hazırım. Bu AGA kürlendi, %4'lük bir AGA'dır ve şöyle bir alanı doğrudan kesip çıkaracağım.Yan taraflarda ise temel olarak dikdörtgen bir helezon kesimi yapın. Ardından bir spatula kullanarak bu parçayı helezon bloğundan çıkarıyorum. Şimdi, helezonun düz tarafı öne bakacak şekilde bu helezonu destek plakama yapıştıracağım.Bu, beynin üzerine yapıştırıldığı ve ardından bu vida ile sabitlendiği destektir. Böylece kesit alma işlemini bu yönde yaptığımızda, beyin geriye doğru hareket etmez. Artık beyni çıkarmaya hazırız.Genellikle P sıfır veya P bir fare kullanırız. Tamam, bu başı kesilmiş fare kafası ve şimdi hızlıca saçlı deriyi çıkaracağım. İlk olarak, tam burada ve diğer tarafta bulunan kas bandını keseceğim.Ardından makasımla ilerliyorum. Makasın iç kısmının beyne zarar vermemesi için çok dikkatli oluyorum. Kafatasının her iki yanından kesim yapıyorum.Şimdi kıkırdağı alabiliriz; küçük ULA'mı kullanarak beyni bu şekilde çıkarıyorum. Ardından bu beyin, kesit solüsyonuyla doldurduğum ve tabanında watman filtre kağıdı bulunan Petri kabına aktarılır. Şimdi yapmak istediğim şey, beyni tutucuya monte etmek için düz ve sağlam bir alan elde etmek amacıyla beynin tabanını kesmektir.Şimdi destek plakama çok küçük bir damla hızlı yapıştırıcı koyacağım. Spatula ile beyni alacağım ve bu işlemde bana yardımcı olması için kavisli penslerimi kullanıyorum. Temel olarak yapmak istediğim, diseksiyon solüsyonundan kalan fazla sıvının bir kısmını süzmek ve beyni matkap destek aparatına monte etmektir.Artık beyni tampon banyosuna aktarmaya hazırız. Bu nedenle, küçük kaba diseksiyon solüsyonu ekliyorum ve beyni tutan desteği yerleştireceğim. Beyin, bıçağa bakacak şekilde monte ediliyor.Tamam, beyin şu an monte edildi; fibro dilimleyiciyi kullanacağım ve beyni bıçağa doğru hareket ettirerek beynin başlangıç noktasını bulmaya çalışıyorum. Olfaktör bölgenin küçük bir kısmını kestim. Şimdi bıçağımı yaklaşık 600 µm aşağı kaydırıyorum ve doğrudan korteksten geçmesi gereken bir kesim daha yapıyorum.Korteks gidiyor ve lamın üzerine çıkıyor. Lamı 600 µm daha aşağı hareket ettiriyorum ve ikinci kesiti alıyorum. Bunun kesintisiz, sürekli ve pürüzsüz bir şekilde yapılması önemlidir.Bıçağı geri çektiğinizde, fiber dilimleyiciyi durdurursunuz. Şimdi, yanlış şekilde kullandığım bir cam pipet kullanacağım. Aslında arka ucunu kullanıyorum ve bu kortikal kesiti yukarıya, buraya taşıyıp temiz bir Petri kabına aktaracağım.P0 veya P1 faresi için yaklaşık beş ila altı kesit toplayana kadar ve korteksin en sonuna ulaşana kadar beyin boyunca daima 600 µm ilerliyorum. Artık korteksi beynin geri kalanından ayırmaya hazırız.Pekala, burada diseksiyon araçları kadar keskin olan, çekilmiş cam pipetler kullanıyorum. Genellikle, elimdeki en küçük bölüm olan ve çıkarmamız gereken olfaktor bölgeden başlıyorum. Ayrıca, bu preparattan meningesleri de çıkarmaya çalışıyorum.Tekrar, bu parçanın olfaktör kısmını çıkararak, onu meninges'lerden soyuyorum, soyup alıyorum. Bazen kolayca ayıramayacağınız parçalar olabilir, bu durumda onlara takılmadan devam edin ve iyi parçaları geride bırakın. Ben her zaman bir uca doğru ilerlerim ve her bir bölümü sırayla işleyerek yoluma devam ederim.Meningesleri temizlemeniz önemlidir; ayrıca bu kesitlere baktığınızda, bu preparasyonda aslında istemediğiniz nöron dışı hücrelerin çoğunu içeren fiber traktının nerede olduğunu daha iyi görebilmek için kesitleri bazen ters çevirmek isteyebilirsiniz. Tamam, bu kesitte kortikal tabakanın altındaki bu fiber traktını net bir şekilde görebilirsiniz. Bu yüzden, kortikal tabakanın bittiği yerin hemen arasına batırıyorum ve bu preparasyonda kaçınmaya çalıştığımız nöron dışı hücrelerin çoğuna sahip olan fiber traktını işaret ediyorum.Bu hat boyunca, fiber traktlarını geride bırakmaya çalışarak kesim yapıyorum. Bu adımda, dokuyu küçük küpler halinde kıyıyorsunuz. Tamam, şimdi enzim çözeltimi bir şırıngaya takılı 0.2 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize ediyorum.Ve bunu, tam da şu şekilde, kortikal parçalarımın üzerine doğrudan ekliyorum. Tüm kortikal parçaları çevreleyecek kadar yeterli sıvı olduğundan emin olun; ardından bu kortikal parçalar, dokuyu oldukça gevşetmesi gereken 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika bekletilir. Bu kortikal parçaların inkübatörde inkübasyonu için 30 dakika geçmiş durumda.Bu sırada, hücrelerin nihayetinde içine yerleştirileceği, B 27 takviyeli bazı nörobazal medyumu ısıttım. Ayrıca burada bazı çözeltiler hazırladım. İlk olanı diseksiyon çözeltisidir.Yani bu standart bir diseksiyon solüsyonudur. Ardından, temizleyici olarak BSA ve NMDA reseptörü bileşenini bloke etmek için APV içeren yüksek tripsin inhibitörlü bir solüsyona aktarılırlar. Sonrasında ise düşük tripsin inhibitörlü BSA ve APV ile üç kez yıkama işleminden geçerler. Şimdi bu parçaları propan solüsyonundan çıkarıyorum ve DS diseksiyon solüsyonu içeren konik bir tüpe aktarıyorum.Bu topaklar yer çekimiyle aşağıya inecek ve tüpün konik kısmında tamamen çökmeleri bir veya iki dakika sürebilir. Ardından onları tekrar alacağım ve yüksek tripsin inhibitörü içeren solüsyona aktaracağım. Yine, bu topakların tüpün altına çökmesini beklememiz gerekecek.Yüksek tripsin inhibitörü çözeltisi ile bir yıkama daha yapılır ve ardından bu kümeler düşük tripsin inhibitörü ile yıkanır. Son yıkama ve düşük enzim inhibitörü işleminden sonra, hücreleri önceden ısıtılmış nöro-bazal besiyerine aktaracağım ve azalan lümen boyutuna sahip bir cam kılcal tüp ile hücreleri yukarı aşağı hareket ettirerek mekanik olarak disosiye etmeye başlayacağım. Şimdi hücreleri ve doku kümelerini triturasyon işlemine tabi tutacağım.Ancak bunu yapmadan önce, burada görünen tüm kalıntıları temizleyeceğim. Örneğin, hücrelerden sızan ve doku kümelerine tutunarak pamuk yumağı benzeri yapılar oluşturan protein ve DNA'lar mevcuttur. Bunları öncelikle temizlemeniz gerekir; aksi takdirde pipet ucunu tıkayarak dokuyu daha dar bir çapta zorlamış olursunuz.Ardından, hücrelerimi açıklığın içine ve dışına hareket ettirebilmek için uygun boyutta bir açıklık elde etmek amacıyla bu cam kılcal tüplerin bazılarını kıracağım. Bu iyi bir pipet. Bunun düzgün ve yuvarlak olduğunu, herhangi bir keskin kenarının bulunmadığını görebilirsiniz.Bunu fare boru içicime takacağım. Arada 0.2 mikronluk bir filtre var ve şimdi dokuları cam kılcal borumun içine ve dışına hareket ettireceğim. İlk işlem oldukça sorunsuz ilerlemelidir çünkü doku kümeleri pipet ağzından çok daha büyük değildir.Tek yapmanız gereken dokuyu gevşetmektir. Ardından, biraz daha küçük bir pipet ucuyla işleme devam ediyorum. Temiz ve düzgün, yuvarlak bir pipet ucu kullanmak istiyorum.Bu iyi görünüyor. Ayrıca, tüm kümeler borunun içine ve dışına aynı anda taşınır. Böylece doku şu an o kadar yumuşamış ve gevşemiş durumdadır ki, bu kümeleri tekrar medyuma süspanse ettiğinizde hücreler temel olarak kendiliğinden ayrılacaktır.Şimdi tüm disosiye hücrelerimi taze bir 15 mL konik tüpe aktaracağım ve hala büyük kümeler halinde olan hücreleri dağıtmak için onları iki veya üç kez daha nazikçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek soğutacağım. Ardından, içeride hala bulunan büyük parçaların çökmesi için bir veya iki dakika bekleyeceğiz. Ayrıca, kırdığınız cam kapilerlerden gelen ve dibe çökmesi gereken cam parçaları da olabilir.Ardından, bunun alikotlarını tamamen ly kaplanmış lameller veya kaplar üzerine ekmek için kullanabiliriz. Polilizin ile önceden kaplanmış olan bu cam lamel üzerine 80 µL ekliyorum ve bu güzel bir damlacık oluşturuyor. Hücreler zamanla çökecek ve cam lamele yapışacaktır.Yaklaşık bir saat sonra hücreler çökmüş olacak ve tüm kaba çok nazik bir şekilde biraz daha besiyeri ekleyeceğim. Bu şekilde hafifçe dairesel hareketlerle çalkalayabilirim. Ardından bu hücreler 37 derecedeki inkübatöre yerleştirilecek ve yarın onları kondisyonlu besiyeri ile besleyeceğim.Ancak şunlar kortikal hücrelerdir. Henüz bir günlük bile değiller. Dün ekildiler ve görebileceğiniz üzere çok sayıda nöron var, hepsinde çok sayıda akciğer nöronu bulunuyor ve ayrıca içeride bazı hücre kalıntıları da mevcut.Bunlar hayatta kalamayan hücrelerdir. Ve bunlar, sonraki birkaç beslemede yıkanarak temizlenecektir. Ölü hücreler, kıvrımlı membranlara sahip olan çok küçük, yuvarlak hücrelerdir.Bu disosiye kortikal kültürlerin nasıl hazırlanacağını size göstermiş oldum. Beyin dilimlerinden kortikal kabuğu çıkardığınızda, nöronal olmayan birçok hücre içerdiği için bunları thumb sala kortikal fiber yolundan ayırmanız gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ayrıca, hücreleri tritüre ederken aşırıya kaçmayın; çünkü bu durum, o ana kadar elde ettiğiniz izole hücrelerin çoğunu temel olarak öldürür.Bu nedenle doku dilimlerine karşı nazik davranın; böylece güzel bir kültür elde edersiniz. Deneylerinizde başarılar dileriz.

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Embriyonik fare beyin agrega kültür sistemi için protokolleri açıklanmıştır. Agrega multipotent atalarıdır geliştirmek ve nöronlar, astrositler ve oligodendrosit içine ayırt edebilirsiniz.

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Bu videoda, yeni doğmuş farelerden saf bir astrosit preparatı elde etme yöntemini açıklıyoruz.

Astrosit İzolasyonu: Fare Kortikal Astrositlerinin Saf Preparatını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Bu video, bölümlere ayrılmış bir yaklaşım kullanarak dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu kurulumda, nöronlar ve astrositler uzamsal olarak ayrılır, ancak şartlandırılmış bir ortamı paylaşırlar. Astrositler tarafından salınan nörotrofik faktörler, nöron farklılaşmasını ve sinaptik bağlantıların oluşumunu teşvik ederek nöron-glia etkileşimlerini düşündürür.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Burada, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun hipokampal nöronların akson başlangıç segmentlerinin (AIS) montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için bir protokol tanımladık.

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Öğrenin fare kortikal nöron kültürleri hazırlama yöntemini. Erken doğum sonrası dönem farelerinden elde edilen bu kültürler, elektrofizyoloji ve görüntüleme teknikleri için kullanılır.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

Daha fazla video keşfet