Name: Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, Danio rerio'da öldürücü iskelet mutantlarının penetransını döl testi ve seçici yetiştirme ile nasıl değiştireceğinizi. Bu yöntem, genetik mekanizmaları ve fenotipik varyasyonları anlamak için güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chuck Kimmel rehberlik için John Dowd bu üreme stratejisi geliştirme konusunda yardım için iskelet leke mükemmelleştirmek onun iş Macie Walker ve Charlene Walker ve Bonnie Ullmann yararlı Zebra balığı tavsiye için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser K99/R00 DE024190 için JTN tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler bu protokol için açıklanan uygun olarak ve Colorado Üniversitesi ve University of Oregon kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC) ile uyum içinde tamamlanmıştır.
 1. Seçili olmayan başlangıç stok hazırlanması fin tarafından ilgi mutant gen <ol><li>tespit heterozigoz taşıyıcılarının küçük 11 ve Genotipleme tam kardeş hayvanların bir hisse senedi seçtiğiniz yöntemi tarafından gibi KASP 12 , 13 , 14. Bu iletişim kuralı Zebra balığı mef2ca b1086 gerilme ile gerçekleştirildi.</li>
	<li>KASP Genotipleme 
	Not: Alleli belirli astar KASP için (bkz. Tablo reçetesi) reaktifler sağlayan şirket tarafından tasarlanmıştır. Uygun 6-karboksil-X-rodamine (ROX) boya konsantrasyon belirli gerçek zamanlı PCR makinesi için elde etmek için şirket Web sitesini ziyaret edin.
	<ol><li>Yer Zebra balığı kuyruk doku 50 µL lizis arabelleği (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, % 0.3 iyonik olmayan yüzey aktif, %0,3 Octylphenyl-polietilen glikol). 10 mg/ml İndinavir-K bir 96-şey PCR plaka ve Özet kuyu başına 10 µL termal cycler 55 ° c 2-5 h 20 min 94 ° C inactivation adım gelir için ekleyin. Lizis ürün sindirim. sonra buzdolabında Not: lizis ürünleri başarıyla hazırlık sonra birkaç ay için kullanılan. Doku 50 mM NaOH kullanarak lysed zaman KASP reaksiyonlar başarısız oldu. Bu bulgular NaOH yöntemi genomik DNA hazırlık KASP ile uyumlu değildir öneririz.</li>
		<li>Bir Spektrofotometre kullanarak genomik DNA ölçmek. Böylece yaklaşık 20-30 ng her reaksiyon içerir moleküler biyoloji sınıf su kullanarak genomik DNA şablonu sulandırmak. 
		Not: 4 veya 5 örnekleri ölçmek, onları havuz, sonra dilutions ortalama olarak dayalı tüm örnekleri için hazırlamak. Bu iletişim kuralı için yetişkin kuyruk doku kullanırken, 1: 100 seyreltme genellikle yeterli olur. DNA toplama kesin miktar gerekli değildir.</li>
		Mix <li>Ekle 0,14 µL KASP astar ve örnek bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ve mix kısaca içeriği tüp alt toplamak için centrifuging çok önce içine buzda başına karışımı 5 µL KASP ustanın. 
		Not: KASP ana mix ısı ve hassas ışık, buz üzerinde hisse senedi tutmak ve doğrudan güneş ışığı önlemek.</li>
		<li>Kullanılan gerçek zamanlı PCR makinesi için uygun bir 96-şey optik PCR plaka kuyu içine damlalıklı 5 µL astar/Master mix çözüm.</li>
		<li>, Damlalıklı 5 µL seyreltilmiş (yaklaşık 5-7 ng/µL) DNA şablon örnekleri her şey ve karıştırmak için bir pipet ile Aspire edin.</li>
		<li>Nükleaz ücretsiz su 3 Kuyu no-şablonu denetimler (NTC) hizmet ve tür seyreltilmiş teyit homozigoz vahşi, heterozigoz ve homozigoz mutant DNA template olumlu denetimler için 5 µL eklemek için Ekle 5 µL.</li>
		<li>Bir optik net film mühür plaka film her şey tamamen mühürlü sağlanması üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Kısaca bir santrifüj kapasitesi 600 x g içeriği alt toplamak için ve baloncuklar karışımından kaldırmak için plaka. 
		Not: buz ve kalkan tabağa ışıktan devam etmek için hazır kadar devam.</li>
		<li>Ana KASP reaksiyonu gerçekleştirmek için Tablo 1 ' de gösterilen Bisiklete binme programını kullanın.</li>
		<li>Analiz bilgisayar tarafından üretilen elde edilen dağılım çizim görüntüleyin. Başarılı bir tepki Arsa ( şekil 3) puan 4 ayrı gruplandırmalar gösterecektir: üç örnek gruplandırmalar karşılık gelen genotip ve NTCs kaynağını yakınındaki bir gruplandırması. Pozitif denetimler uygun örnek gruplandırma ile ayırmak.</li>
		Eğer bilgisayar programı does değil tanımak karşılık gelen belirli genotip, kümeleri Bisiklete binme ek olarak gruplandırmalar olabilir arsa <li>(Tablo 2) gerekli. Bilgisayar sıkı gruplandırmalar tarafından genotip tanıyana kadar ek program yineleyin.</li>
		<li>Daha kolay kullanım ve analiz için bir elektronik tablo dosyasına Genotipleme sonuçlarını aktarın.</li>
	</ol></li> <li>Birlikte ana su sistemi üzerinde tanımlanan heterozigoz hayvanlar evi.</li></ol>
 2. ilk yuvarlak döl puanlama <ol><li><ol>hayvanlar fin klipten kurtardıktan sonra <li>ikili kardeş heterozygotes çapraz ikili intercrosses kadar ayarla. Bölücüler embriyolar zaman uyumlu 16 emin olmak için kullanın.</li>
		<li>Embriyo toplamak ve kafesleri ıslahı izole ebeveyn çiftleri devam.</li>
		<li>İzlemek izole yetişkin böylece ayrılmış veya kapak ile sağlanan agresif balık (rendelenmiş balık ağları iş güzel). Balık beslenen ve onların su değişti statik su iken IACUC yönergeleri izleyerek.</li>
	</ol></li> <li>Embriyo yetiştirme <ol><li>sahne ve Zebra balığı embriyolar için standart koşullar 17 altında larvaların yükseltmek.</li>
		<li>Phenotypically vahşi türü hayvanlar Yüzme kesesi debriyaj % 75'i şişirilir, günde 5 veya 6 cam pipet kullanırken toplamak. Fenotipik vahşi türleri hangi ebeveynlerinin onları vermiştir kayıt odasında yerleştirin. 
		Not: birçok iskelet mutantlar doğrudur, çekinik öldürücü, çoğu mutant gen ile form yüzmek sidiktorbası 18 , 19 için homozigoz mutantlar başarısız. Bu nedenle, fenotipik vahşi türleri kolayca şişirilmiş yüzmek bladders dayalı mutant onların kardeşleri dan ayırt edilebilir.</li>
	</ol></li> <li>Alcian mavi/Alizarin Red kıkırdak ve kemik boyama <ol><li>0,17 g/L Tricaine kullanarak kendi yüzme bladders şişirmek değil larva anestezi-S embriyo medya. Hayvanlar bir geniş-geçişli cam Pasteur damlalıklı 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak. Tüp başına en fazla 100 larva ekleyin.</li>
		<li>Her tüpünden embriyo su kaldırmak ve 1 mL 1 x PBS tüp başına % 2 paraformaldehyde hayvan düzeltin. 
		Uyarı: Sulu PFA yanıcı ve ciddi deri ve göz tahrişine neden olur. Uygun kişisel koruyucu ekipman eldiven ve göz koruması gibi giymek ve yıkama eller iyice kullanımdan sonra.</li>
		<li>İçin 1 h rock; uzun fiksasyonu ve kemik boyama bozar. Tüpler bu sırasında düzenli olarak kontrol edin ve hiçbir larvaların sağlamak için tüm sonraki sallanan adımlar tarafına sıkışmış olmak veya tüpün dibine clumped.</li>
		<li>Cam pipet kullanarak tüpler üzerinden sabitleştirici kaldırmak, 1 mL % 50 etanol, ve 10 dakika süreyle rock eklemek</li>
		<li>Hazırlama 20 µL % 0,5 ekleyerek çözüm boyama taze Alizarin Red başına Alcian 1 mL premix (%0,04 Alcian mavi/10 mM MgCl 2 / %80 etanol). % 50 etanol kaldırmak için çözüm her tüp ve rock gecede boyama 1 mL ekleyin. Larvalar 5 gün için leke kalır.</li>
		<li>Leke çözüm tüpler kaldırın ve 1 mL % 80 etanol/10 mm MgCl 2 çözüm her tüp için ekleyin. Tüpler için en az 1 h rock; bir gecede durulama daha net bir Alcian mavi leke üretebilir.</li>
		<li>% 80 etanol/10 mM tüpler MgCl 2 çözümden kaldırmak ve 1 mL % 50 etanol ekleyin; 5 dk. için rock</li>
		<li>Tüpler % 50 etanol çözümden kaldırmak ve % 25 etanol ve rock 5 dakika süreyle 1 mL ekleyin</li>
		<li>% 50 etanol çözüm tüpler kaldırın ve 1 mL taze hazırlanan % 3 H 2 O ekleyin 2 /0.5% KOH beyazlatma çözüm. Kapaklar açık ve tüpler yaklaşık 10 dk ya kadar soluk kahverengi renklendirme çözüm üst kısmında görülebilir bir mikro-tüp rafa stand izin bırakın. 
		Not: Çözüm üstüne kabarcıklar formunun bir katmanı. Dikkatli zamanlama bu adımda gerekli olarak üzerinde beyazlatma zavallı bir çift leke sonuçlanır.</li>
		<li>Beyazlatma çözüm kaldır ve 1 mL % 25 glycerol/0.1% KOH ekleyin; 10 dk 1 h. kaya</li>
		<li>%25 glycerol/0.1% KOH çözeltisi tüpler kaldırmak için her tüp, kaya gece için 10 dakika için 1 mL % 50 glycerol/0.1% KOH çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>% 50 glycerol/0.1% KOH çözüm tüpler kaldırın ve tekrar her tüp için %50 glycerol/0.1% KOH çözeltisi ekleyin. Sallanan bir gecede larva içinde birikebilir hava kabarcıkları kaldırmak yardımcı olacaktır. Mağaza lekeli 4 ° C'de iskelet hazırlıkları ne zaman kullanılıyor.</li>
	</ol></li> <li>Fenotip puanlama <ol><li>puan için seçili fenotip alellerle mutant çoluk çocuk lekeli. Nichols vd. 1 mutantlar Ektopik kemik herhangi bir olay için attı. 
		Not: Zebra balığı anne statik suda ve Alizarin Red leke zamanla, iskelet iskelet hazırlama tamamlama bir kaç gün içinde puanı önemlidir çünkü.</li>
		<li>Alellerle bir fenotip vardır bir genotip oranıdır. Yüzde alellerle aşağıdaki formülle hesaplama: % alellerle (fenotip mutantlarla) = / (mutant toplam sayısı) × 100</li></ol></li></ol> 3. Aile seçimi <ol><li>Seç iki yüksek alellerle ve iki düşük alellerle aile için en yakın üretme. Alellerle ek olarak, verimlilik ve canlılığı yaymak için hangi aileleri seçerken dikkate almanız önemlidir; tartışma bu konuda daha fazla bilgi için bkz:.</li>
	<li>Her ebeveyn çifti bir alt hisse senedi tanımlayıcı vermek: aile.01,.02, vb</li>
	<li>Ev çeşitli karma seks ile ana sistemdeki ebeveyn çiftleri &#39; eşlik eden &#39; balık. Arkadaşı balık herhangi bir Zebra balığı satırı değiştirilmiş pigmentasyon veya fin yapısı gibi kalıcı, belirgin ayırt edici özellikler olabilir. 
	Not: pek çok araştırmacı başarıyla sadece çift olarak bir tank doğurmak devam ederken, olumlu sonuçlar ile birlikte birkaç arkadaşı balık konut tarafından görülür. Bu isteğe bağlı adım çiftleri daha büyük okullarda tutulması hayvanların üreme sağlar ve onlar tekrar tekrar gerektiği gibi geçti bu yüzden kolayca alındı. Ebeveyn çiftleri art arda büyük tam kardeş aileler oluşturmak için çarpı işareti; en az bir hafta önce aynı ebeveyn çifti geçiş tekrar bekleyin.</li>
	<li>Adım 2.2.2 larva ailelerden itlaf. nesil için seçilmiş değil.</li>
	<li>Mutant onların kardeşleri dan alellerle ile seçilen ailelerden gelen vahşi tipi kardeş larva içeren tankları etiket ve yetişkinliğe normal olarak yükseltmek.</li>
	<li>Yeni nesil en az dört tam kardeş aile, iki yukarı doğru satır ve iki aşağı doğru satır için olacak.</li>
	<li>Larva cinsel olgunluğa ulaştığında, yeni nesil bir adımla başlayan Protokolü yineleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism%2C+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+%28HDR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li>
<li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).</li>
<li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li>
<li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li>
<li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030235931095">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li>
<li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLerner%2C+IM+%22Population+Genetics+and+Animal+Improvement%22">Population Genetics and Animal Improvement</a>. , Cambridge University Press. (1950).</li>
<li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li>
<li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).</li>
<li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+the+KASP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li>
<li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11032-013-9917-x">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273260117_Introduction_of_High_Throughput_and_Cost_Effective_SNP_Genotyping_Platforms_in_Soybean">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li>
<li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I%3A+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li>
<li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+ways+to+lose+your+bladder%3A+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li>
<li>Mrakovčič, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1095-8649.1979.tb03612.x/abstract">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li>
<li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n11/full/nrg2664.html">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li>
<li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li>
<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39(2015).</li>
<li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FishFace%3A+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Bio%22%5BJournal%5D)">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li>
<li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Seçici ıslahı Gene işlevi inceliklerini örtüsünü açmak
Daha fazla veya daha az seçici ıslahı tarafından şiddetli olmak mutant fenotipleri değişen gen işlevi yeni anlayışlar kazanmak için basit bir yoludur. Seçili olmayan üreme standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada sunulan Protokolü mutant fenotipleri çok daha tam bir anlayış yol açabilir. Özellikle, ciddi suşları oluşturarak, mutant fenotipleri tam genişliğini, seçili olmayan hisse senetleri ile alınamıyordu bazı d...

Zebra balığı iskelet gelişimi anlamak için güçlü modeli bir sistemdir. Zebra balığı mutant suşları ile biyologlar gen işlevini skeletogenesis sırasında çözebilir. Ancak, Zebra balığı iskelet mutant fenotipleri gelişimsel ve genetik analizler engel olabilir değişken alellerle1,2,3,4 ile sunabilir. Bu yöntemin amacı üç katlı. İlk olarak, sürekli olarak ciddi fenotipleri üretmek Zebra balığı mutant satırlar gibi hızlandırılmış kayıt5 ve nakli6aşağı akım gelişim çalışmaları sağlar. Bu tür çalışmalar sadece tutarsız bir şekilde tezahür fenotipleri çalışmaya çalışırken tarafından sakat kalabilir. İkinci olarak, Zebra balığı suşları akraba evliliği genetik arka plan varyasyon, böylece deneysel tutarlılık ve tekrarlanabilirlik teşvik düşürebilir. Örneğin, tüm in situ hibridizasyon analizlere bir seçmeli olarak doğuştan zorlanma karıştırıcı değişkenliği azaltmak gerçekleştirip sonuçlara güçlendirmek. Üçüncü olarak, ağır ve hafif suşları üreten belirli bir mutasyon neden olabilir tüm fenotipik serisi ortaya çıkaracaktır.
İlk bakışta, ölümcül mutantlar seçici üreme imkansız görünüyor. Seçim için attı hayvanlar ölü olduğunda nasıl bir cins alellerle için? Neyse ki, Aile seçimi, özellikle test, döl tarafından seçici ıslahı için yöntemleri programları birçok yıl7,8için yetiştiriciliği hayvancılık etkinliğini göstermiştir. Bu programlar çoğunlukla sadece bir seks, ineklerin süt üretimi veya tavuk yumurta üretimi gibi mevcut özellikleri için seçici ıslahı için kullanılır. Bu tür erkekler doğrudan, attı olamaz ama onların döl attı ve bir değer daha sonra ailesine atanır. Bu stratejiden borçlanma, burada sunulan Protokolü faiz bir mutant gen için heterozigoz olan sabit ve lekeli mutant yavruları Zebra balığı bir çift gelen puanlama içerir. Bir fenotip içinde homozigoz öldürücü mutant çoluk çocuk alellerle ailesine hangi bireyler nesil satırında üretecek karar verirken atanır. Biz bu yöntemi alellerle Zebra balığı öldürücü iskelet mutantlar1vites için etkili bir yol bulmak.
Benzer şekilde diğer çalışmalar, bu seçici ıslahı Protokolü dikkate ölçütü debriyaj boyutu, çoluk çocuk yaşama, embriyo ve cinsiyet oranı9normal gelişimi gibi altında alır. Ancak, bu faktörlerin tüm mutant alellerle değişen hedefi mutant bir arka plan bağlamında kabul edilir. Bu nedenle, bu iletişim kuralı önceki seçici ıslahı paradigmalar gelişimsel mutant analizleri güçlendirmek hem de arka plan homojenliği artırmak için bir yöntem sunarak genişletir.
Güvenilir, hızlı Genotipleme Protokolü önceden geliştirmek önemlidir bu yüzden geniş Genotipleme, bu iletişim kuralı gerektirir. Orada birçok Genotipleme protokolleri kullanılabilir10,11, ancak biz KASP Genotipleme12,13,14 bulmak daha hızlı, daha verimli ve daha güvenilir--dan yöntemleri maliyetidir restriksiyon enzimi bölünme güçlendirilmiş dizileri10üzerinde temel. Bu nedenle, bu çalışmada KASP iletişim kuralı içerir. Ayrıca, bu iletişim kuralını iskelet mutant fenotipleri odaklanmak ve Alcian mavi/Alizarin Red önceki iletişim kuralları15değiştirilmiş boyama için bir yordam içerir.
Burada açıklanan yöntemi öldürücü mutant alellerle yukarı veya aşağı doğru kayması için basit bir stratejidir. Bu iletişim kuralı iskelet mutant fenotipleri üzerinde duruluyor olsa da, tüm mutant Zebra balığı satırlarının yetiştiriciliği için yararlı bir strateji olacağına inanıyoruz. Aslında, büyük olasılıkla bu üreme stratejisi yarar Zebra balığı uzanır. Biz bu protokolü alellerle organizmaların geniş bir aralıktaki kaydırmaya değiştirilebilir tahmin. Döl sınayarak öldürücü alellerle değişen ileri herhangi bir gelişimsel genetikçi ilerlemesini itme yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehit, peletlenmiş, katı</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Peletlenmiş PFA, toz PFA</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür, katı</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Sulu</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 geçirmez Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Mavisi, katı</td><td>Anatech Ltd.</td>'ye daha güvenli bir alternatiftir.<td>867</td><td>Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Kırmızı, katı</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol, sıvı</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit, sıvı</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit, ve nbsp; katı</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR Makinesi</td><td>Uygulamalı Biyosistemlerden</td><td></td> <td>olmalıdır</td></tr><tr><td>MicroAmp Barkodlu Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası (0,1 mL)</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' contası</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, Yüksek ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Astar Karışımı</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, katı</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potasyum klorür, katı</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, sıvı</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Trikain-S</td><td>Batı Kimyasalları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Kontrollü Damla Pastör Pipetleri</td> DNA kantitasyonu için <td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı öldürücü iskelet mutant alellerle test döl tarafından değişen

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebra balığı mutant fenotipleri çoğu kez eksik olarak penetrant, sadece bazı mutantlar tezahür. Tutarsız bir şekilde görünür ilginç fenotipleri çalışmaya zor olabilir ve sonuçları semptomlarıdır için yol açabilir. Burada açıklanan artırmak ve öldürücü Zebra balığı iskelet mutantlar alellerle azaltmak için bir basit üreme paradigma protokolüdür. Ölümcül mutantlar seçerek doğrudan yetiştirilmiş olamaz çünkü döl test klasik seçici üreme stratejisi istihdam edilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda Kompetitive alleli belirli PCR (KASP) Genotipleme Zebra balığı ve boyama larva Zebra balığı kıkırdak ve kemik için protokolleri içerir. Burada açıklanan yetiştiriciliği strateji uygulayarak downstream uygulamalarında daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan ilginç bir iskelet fenotip alellerle artırabilir. Buna ek olarak, bu seçici üreme stratejisi aracılığıyla mutant alellerle azalan en önemlisi mutasyona uğramış gen işlevi gerektiren gelişim süreçlerini ortaya çıkarabilir. İskelet özellikle burada kabul edilir iken, önerdiğimiz bu yöntemi tüm Zebra balığı mutant satırları için faydalı olacaktır.

Bu iletişim kuralı bir uzun vadeli hayvancılık anlayış Zebra balığı iskelet mutantlar (şekil 1) yararlı bir tekniktir. Döl test ederek seçici üreme bir kayma genel alellerle hem aşağı hem de yukarı doğru birkaç nesil (Şekil 2) verim. Önceki çalışmalarda, seçici ıslahı iki tur ortalama alellerle aşağı doğru 17'den % %31' e gittim. Benzer şekilde, bizim yukarı doğru çizgi, biz ortalama alellerle yukarı %63 %...

Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Bu yetiştirme stratejisinin genel amacı, mutant penetransını yukarı veya aşağı yönlü olarak manipüle etmektir. Bu seçici yetiştirme yöntemi, mutant fenotiplerinin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Yüksek ve düşük penetranslı mutant suşlar üretilerek, bir mutasyonun tüm fenotipik serisi anlaşılabilir.Mutantların resesif letal olduğu çoğu zebra balığı ölçeğinde, homozigot mutantlar doğrudan yetiştirilebilecekleri aşamaya gelmeden ölürler. Bu nedenle, burada gösterdiğimiz klasik selektif yetiştirme stratejisi olan progeni testini uyguluyoruz. Bu yönteme, ektopik kemik hücresi gelişimini zaman ayarlı (time-lapse) olarak kaydetmeye çalışırken ilk kez ihtiyaç duyduk.Maalesef, bunlarda sıklıkla ekstra kemik hücreleri ortaya çıktığı için seçici üretim yoluyla mutant penetranları değiştirmeye karar verdik. Bu yöntemi bir mutant hattı ile zebrafish ölçeğinde gerçekleştirmemize rağmen, diğer zebrafish mutant fenotiplerine ve muhtemelen diğer organizmalara da uygulanabilir. Metin protokolüne göre seçilmemiş başlangıç zebrafish stoklarını hazırladıktan sonra, KASP genotiplemesini şu şekilde gerçekleştirin.Zebrafish kuyruk dokusunu, 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 50 µL liz

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Zebra balığı artık kas distrofilerini, konjenital miyopatileri ve ilgili nöromüsküler hastalıkları modellemek için yerleşik ve güçlü bir araçtır. Çift kırılma ve dokunma ile uyarılmış kaçış davranışı, zebra balığı embriyolarının erken gelişim sırasında kas düzensizliği ve lokomotif bozukluğunun derecesini belirlemek için kullanılan iki yaygın noninvaziv testtir.

Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

Bu protokol, zebra balığı larvalarında döllenmeden 3-7 gün sonra bir ilaç tarama prosedürünü ve ardından morfolojik değerlendirmeyi tanımlar.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Bu çalışma, zebrafish larvalarında yüz yapısındaki değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım (tpsDigs2, MorphoJ ve PAST) kullanılarak kraniofasiyal kıkırdak şeklinin nicelendirilmesine yönelik bir protokolü tanımlar.

Şekil Morfometrik Analizleri: Zebrafish'te Kraniofasiyal Şekil Nicelesi için Analiz Yazılımı Araç Kutusu

Öğrenin, Danio rerio'da öldürücü iskelet mutantlarının penetransını döl testi ve seçici yetiştirme ile nasıl değiştireceğinizi. Bu yöntem, genetik mekanizmaları ve fenotipik varyasyonları anlamak için güçlü bir çerçeve sunar.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Daha fazla video keşfet