Name: Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin, iskelet kasında in vivo yaşlanma ve yeniden programlamayı değerlendirmek için bu güvenilir yöntemi. Doku hasarı sonrası hücresel plastisiteyi artırarak kas rejenerasyonunu destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onun mükemmel teknik destek için Clemire Cimper için borçlu bulunmaktadır. H.L. laboratuvar çalışmalarında Institut Pasteur, Merkezi Ulusal pour la Recherche bilimsel ve Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; tarafından finanse edildi ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) ve Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. ve A.C. doktora ve doktora sonrası Burslar canlandırmak Konsorsiyumu üzerinden tarafından finanse edilmektedir.

hayvanlar ele Avrupa toplum kuralları ve Etik Komitesi Institut Pasteur (CETEA) onaylı kurallarının başı olarak.
 1. hisse senedi çözümleri hazırlıkları <ol><li>kas örnek fiksasyon için malzemeleri hazırlayın. 0.5 g tragacanth sakız kas fiksasyon için donma katıştırma orta yapmak RT 20 mL su ile çözülür.</li>
	<li>SA-β-Gal boyama için çözümleri hazırlayın.
	<ol><li>Hisse senedi çözümleri K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), anılan sıraya göre tozu distile su içinde eriterek tarafından MgCl 2 (1 M) hazırlayın.</li>
		<li>Suda sulandrarak %0,2 C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eozin) hisse senedi çözüm hazırlayın.</li>
		<li>Hisse senedi çözüm (X-gal) (50 mg/mL) C 14 H 15 BrClNO 6 C 3 H 7 X-gal toz çözülerek hazırlamak yok (dimethylformamide, DMF).</li>
		<li>Mağaza K 3 Fe(CN) 6 ve K 4 Fe(CN) 6 çözüm 4 ° C'de ve dik, MgCl 2 
		Not: X-gal-20 ° C'de aliquot en fazla 6 ay saklanabilir. Eozin çözüm RT muhafaza ve gerekirse süzme sonra yeniden kullanılabilir. K 3 Fe(CN) 6 ve K 4 Fe(CN) 6 çözümleri protectedfromthe ışık vardır. X-gal çözüm suda sabit değil ve ışıktan korunması gerek.</li>
	</ol></li> <li>MicroRNAs boyama için hazırlanması çözümleri: %0,1 Na 3 C 6 H 5 O 7 (TRISODYUM sitrat), %0,1 C 14 H 22 O permeabilization çözüm içeren (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) distile su içinde hangi depolanması gereken 4'te ° C. RT. depolanan fosfat tamponlu tuz (PBS), % 5 fetal sığır serum (FBS) içeren engelleme çözüm hazırlamak</li>
</ol> 2. SA-β-Gal Staining TA kas bölümünde donmuş <ol><li>fiksasyon malzeme TA kas için tragacanth küçük bir miktar koyarak bir dilim mantar sakıza hazırlayın.</li>
	<li>Yaralandı fareler her iki cinsiyette (2 ay eski, C57/B6) cardiotoxin (CDX) ile 10 gün önce 13 daha önce açıklandığı gibi yaralandı. Aynı fare (PBS enjeksiyon) TA sigara yaralı negatif kontrol kullanın. Vivo yeniden programlama isterseniz, her fare Dox (1 mg/mL) ile içme suyu (ışıktan korunan), aynı gün şu CTX yaralanma sonra tedavi. 
	Not: Dox çözüm 3 günde toplam tedavi süresi 7 gün için değiştirilmesi gerekir.
	<ol><li>( şekil 1A) 13 daha önce açıklandığı gibi fare (yaralı ve kontrol) her iki TA kasları izole. Transvers kesitler sağlamak, TA kas distal tendon tragacanth sakız yerleştirin ve kas ( şekil 1B) dışında yaklaşık ¾ bölümünü terk ve doğrudan sıvı azot içinde dondurmak için isopentane için soğutmalı &#60; 1 min. 
		Not: dik bir pozisyonda ve mantar ortasına TA kas olduğundan emin olun. Örnekleri-80 ° C veya doğrudan cryosectioned 10 µm bölümlerinde depolanan.</li>
	</ol></li> <li>TA kas şekil 1B adımında açıklandığı gibi işlemek.
	<ol><li>Dağıt 1 st -10 inci bölümler her slaytın üst sol konumunda on farklı slaytlar üzerine doğru sırada. 11 inci Bölüm 1 st bölümüne bitişik ilk slaytta yer; 12 inci bölüm sağ yanı sıra ikinci slayt 2 nd bölümüne yerleştirilmesi için aynı sırada takip edecek. 10 bölümleri/slayt elde edilir kadar on slaytlar (toplamda 100 bölümleri) için ilk ve son bölümleri arasındaki mesafe en az 1 mm emin olmak için bu işlemi yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>4 dk %1 paraformaldehyde ve % 0.2 oxazolidin içeren PBS için bölümleri düzeltmek. PBS, 2 x 10 dk ile yıkayın. Ardından, PBS bölümlerde kuluçkaya (pH 5.5 =) için 30 dk. RT., tüm adımları 
	Not: Fiksasyonun enzimatik aktivite korumak için hafif olmak zorunda. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin. PBS pH önemlidir ve X-gal çözüm ışıktan korunmalıdır.</li>
	<li>X-gal solüsyon içeren içinde Incubate bölümler: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 ve 400 µg/mL X-Gal PBS, pH 5.5 =. Karanlıkta 24 h yıkama en az 37 ° C'de 3 x 10 min, dik, PBS, slaytlarla kuluçkaya 
	Not: Kuluçka en az 24 saat gerektirir ve SA-β-Gal sinyal en üst düzeye çıkarmak 48 saat sürebilir. Çözüm kuluçka 24 saat sonra değiştirilmesi gerekiyor. Slaytları ışıktan korunmalıdır. Eğer sadece SA-β-Gal boyama isteniyorsa, 2.5 adımla devam edin. MicroRNAs ile birlikte boyama isterseniz, lütfen ileri 3.1 FrameRelay.</li>
	PBS içinde <li>düzeltme slaytlar %1 paraformaldehyde 30 dk yıkama için PBS ile 3 x 10 dk. Counterstain % 0,2 Eozin ile slaytlar. Eozin çözüm 1 dk. için slaytları bırakın ve kısaca distile su ile yıka. Son olarak, sulu Floresanda montaj orta slaytlarla mount (Tablo malzemeleri görmek). 
	Not: Sonrası fiksasyon gerçekleştirmek için önemlidir. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin. Tüm adımlar RT. gerçekleştirilir</li>
</ol> 3. İmmünhistokimya kullanarak Anti-MicroRNAs antikor <ol><li>%4 paraformaldehyde için 10 dk. yıkama ile PBS, 2 x 10 dk. eklemek 200 µL slayta doğrudan permeabilization çözüm içeren PBS ile slaytlar düzeltmek ve 5 min için kuluçkaya. <ol><li>Yıkama slaytlar PBS, 2 x 5 min ve son yıkama, kullanım 200 µL PBS % 0.25 BSA doğrudan slaytlarda içeren. Dik, tüm bu adımları gerçekleştirmek 
		Dikkat: başlık altında fiksasyon adımıysa.</li>
	</ol></li> <li>Incubate slaytlar ile birincil anti-MicroRNAs antikor (son konsantrasyonu: 1,25 ug/mL) % 5 içeren PBS 4 ° C'de gecede FBS. PBS, 2 x 10 dk ile slaytlar yıkama ve son makinaya kullanım 200 µL PBS % 0.25 BSA 5 dk. gerçekleştir içeren tüm çamaşır dik adımlar 
	Not: buharlaşma önlemek için ıslak kağıt havlu ile bir kutu içindeki slaytları kuluçkaya.</li>
	RAb-HRP ikincil antikor 100 µL ile <li>Incubate slaytlardan kullanıma hazır kit (Tablo malzemeleri görmek) 45 dk. yıkama için PBS ile 3 x 5 dk, slaytlar için ikincil antikor kaldırın. Işıktan koruma ile RT, tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Görselleştirme <ol><li>ilk olarak, 3,3 seyreltik &#39;-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) substrat arabelleği kit (1 mL substrat tampon çözeltisi için DAB, 20 µL) kullanıma hazır tarafından sağlanan. Her slayda doğrudan DAB çözeltinin 100 µL ekleyin ve en fazla 10 dk RT. az kuluçkaya 
		Not: Seyreltilmiş DAB çözüm taze hazırlanmalı ve en fazla bir hafta 4 ° C'de depolanan Kuluçka süresi arka plan sinyal en aza indirmek için ayarlanabilir ama için tüm slaytlara aynı tutulmalıdır.</li>
		<li>Su ile durulama tarafından DAB çözüm kaldırın. Hızlı kırmızı çözüm (hazır kullanmak için Tablo reçetesi görmek) slaytlarla 20 dk. yıkama su kaydıraklı tekrar kısaca counterstain.</li>
		<li>Onları % 95 etanol için 5 m ile kurutmakBuna % 100 etanol tarafından 2 x 5 dk kadar takip ettim. Son olarak, hızlı sağlamlaştırma montaj orta slaytlarla mount (Tablo malzemeleri görmek).</li>
		<li>Gözlemlemek slayt arka plan önlemek için 20 X parlak alanındaki mikroskop altında. 
		Not: Hızlı kırmızı çözüm olabilir RT muhafaza ve süzme sonra yeniden kullanılan.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analiz ve miktar <ol><li>SA-β-Gal miktar <ol><li>slaytları inceden inceye gözden geçirmek ve elde edilen görüntüleri baz alınarak her bir slayt üzerinde en iyi bölümleri seçin. En az 2 bölümler/TA miktar için kullanın. Bölüm yargıç &#39; s Kalite tabanlı üzerinde doku bütünlüğü, boyama ve kalitesini counterstaining. Miktar için SA-β-Gal miktar tüm TA kas boyunca daha iyi gösterimini sağlar maksimum olası mesafe örnekleri arasında iki yüksek kaliteli bölümlerle seçin.</li>
		<li>Miktar SA-β-Gal pozitif hücrelerinin ( Şekil 2).
		<ol><li>Belirleme piksel boyutunu el ile en küçük ve en büyük pozitif SA-β-Gal hücreleri seçerek sırası.
			<ol><li>ImageJ yazılım kullanarak taranmış slayt dijital görüntü açın.</li>
				<li>Arabirim içinde tıklatın &#39; analiz &#39; &#62; &#39; araçlar &#39; &#62; &#39; ROI Yöneticisi &#39; &#62; &#39; analiz &#39; &#62; &#39; ayarla ölçüm &#39; &#62; &#39; alan seçin &#39;. Seçim aracını kullanın ve surround en küçük ve en büyük pozitif SA-β-hücre ve yatırım Getirisi müdürüne yanında tıkırtı üstünde eklemek Gal &#39; Ekle &#39;. Kullanarak boyutlarını ölçmek &#39; ölçü &#39; düğme ve değerleri daha sonra kullanmak için kaydetmek.</li>
			</ol></li> <li>Görünür pozitif hücreler seçilir emin olmak için eşik değerin ayarlanmasını.
			<ol><li>Convert tıklayarak gri tonlama için görüntü &#39; görüntü &#39; &#62; &#39; türü &#39; &#62; &#39; 8-bit &#39; ( şekil 2A). Daha sonra gitmek &#39; resim &#39; &#62; &#39; ayarla &#39; &#62; &#39; eşik &#39;, tüm olumlu SA-β-Gal hücreleri kırmızı ( şekil 2B) ile kaplıdır kadar ikinci ele alalım, o zaman tıkırtı &#39; Uygula &#39;.</li>
				<li>Tıklatarak analiz parçacıklar &#39; analiz &#39; &#62; &#39; parçacıklar analiz &#39; &#62; &#39; boyutu (piksel ^ 2) &#39; ve 4.1.2.1. adımda tanımlanan değeri uygulamak, girin &#39; Döngüsellik &#39;: &#39; 0.00 1.00 &#39;,'ı tıklatın &#39; tamam &#39;; a özet-in tüm sayılan parçacıklar ( şekil 2B) ROI Yöneticisi'nde gösterilir.</li>
			</ol></li> <li>Tüm seçili parçacıklar özgün görüntü aktarmak. El ile doğru miktar emin olmak için seçim ayarlayın. Pozitif hücrelerinin (Yeşil ok, şekil 2E) eklemek ve/veya yanlış pozitif hücre (kırmızı ok, şekil 2E) kaldırma. Son olarak, tedbir alan bölümü ( şekil 2B) kullanılarak özetleyen tarafından &#39; seçim aracını &#39;. ' I tıklatın &#39; ROI Yöneticisi &#39; &#62; &#39; Ekle &#39; &#62; &#39; ölçü &#39;.</li>
			<li>Önemlisi, bölüm alanı tarafından pozitif hücre sayısı normale.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>MicroRNAs miktar <ol><li>parlak alanını el ile 20 X büyütme, mikroskop altında MicroRNAs pozitif hücreleri saymak. 
		Not: Hızlı kırmızı counterstaining iyi değerlendirilmesi TA kas morfolojisi sağlar. Ancak, boyama çok hafif ve bölümün Seviyelendirmeyi Temizle'yi yoksun. Tarayıcı kez bölümleri kenarlığını tanımlamak başarısız olur ve doğru odak olamaz. Taramadan önce bölümleri kenarlarını daire veya bölüm algılamak için daha duyarlı bir tarayıcı kullanmak için işareti kullanmak mümkündür. Geçerli iletişim kuralı için el ile MicroRNAs pozitif hücreleri saymak en verimli yoldur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li>
<li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li>
<li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li>
<li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528(2015).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li>
<li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SA+beta+Gal+staining%3A+biomarker+or+delusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada, senescent her ikisi de algılamak için bir yöntem ve pluripotent kök hücre içinde Bilişim farelerin kas iskelet mevcut. Bu yöntem değerlendirmek ve her iki yaşlanma ölçmek ve hücresel plastisite vivo içindeikna etmek ve yaşlanma doku onarımı ve rejenerasyon rol incelemek için kullanılabilir.
Geçerli protokol, yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil içinde vivo senescent hücreleri kas iskelet algılamak için kullanılır. Bu tahlil Bu enzim aktivite asidik pH 4,...

Hücresel yaşlanma stres yanıt istikrarlı hücre döngüsü tutuklama tarafından karakterize bir şeklidir. Son on yıl içinde araştırma sıkıca yaşlanma embriyonik geliştirme, fibrozis ve1,2yaşlanma organizma da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik ve patolojik işlemlerle ilişkili olduğunu kurmuştur. Hücresel yaşlanma ilk3kısalma telomer tarafından tetiklenen ikileştirici onların ömrü sonundaki insan fibroblast tespit edilmiştir. İkileştirici stres yanı sıra, yaşlanma, DNA hasarı, oksidatif stres, oncogenic sinyalleri ve genomik/epigenomic değişiklikler, herhangi biri sonunda p53/p21 ve/veya pRB yolları etkinleştirebilir gibi neden olabilir birçok çekim gücü vardır kurmak ve kalıcı büyüme tutuklama1güçlendirmek. Senescent hücreleri önemli özelliklerinden biri olan metabolik olarak aktif kalır ve sağlam bir yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP) hızlı: salgısı birçok inflamatuar sitokinlerin, büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks faktör4. SASP faktörler arabuluculuk ve bağışıklık hücreleri çeken ve yerel ve sistemik doku ni1değiştiren güçlü etkileri nedeniyle yaşlanma etkisi yükseltecek önemli bir rol oynamak için önerilmiştir. İlginçtir, yaşlanma son zamanlarda doku onarımı ve yenilenme için5,6önemli olmak teklif edildi. Buna ek olarak, veri--dan bizim de dahil olmak üzere birkaç labs doku zarar indüklenen yaşlanma SASPs yenilenme7-9tanıtmak için üzerinden hücresel plastisite geliştirmek önerdi. Bu nedenle, tüm gelişmekte olan verileri yaşlanma içinde vivoeğitim önemini vurgulayın.
Yazı İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) dönemde, hücresel plastisite bir hücrenin yeni bir kimlik edinme ve farklı uyaranların her iki kültür ve in vivo10maruz alternatif bir kader benimsemeye kapasitesidir. Tam yeniden programlama elde vivo içinde11,12, olabilir bilindiği nerede ifade dört Yamanaka faktör içeren kaset: Oct4, Sox2, Klf4ve c-Myc (OSKM) indüklenen vivo içinde birden fazla organ teratomas oluşumu teşvik olabilir. Bu nedenle, bir etiketteki fare modeli (i4F) güçlü bir sistemi kritik düzenleyiciler ve hücresel plastisite11için önemli yollar tanımlamak için kullanılabilir.
Uygun ve hassas vivo içinde sistem nasıl hücresel yaşlanma anlamak önemlidir doku rejenerasyonu bağlamında hücresel plastisite düzenler. Burada, sağlam bir sistem ve yaşlanma ve doku rejenerasyonu bağlamında hücresel plastisite arasındaki bağlantıyı değerlendirmek için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Cardiotoxin (CTX) indüklenen kombinasyonu kas hasarı Tibialis Anterior (TA) kas grubunda, doku rejenerasyonu ve i4F fare modeli çalışmaya iyi kurulmuş bir sistem hücresel yaşlanma ve içinde vivo algılanmasını sağlar kas yeniden oluşturma işlemi sırasında yeniden programlama.
Hücresel plastisite ile yaşlanma arasında bağlantı değerlendirmek için i4F fare CTX ile akut kas hasarı ikna etmek için yaralı ve in vivo yeniden programlama ikna etmek için Doksisiklin ile (0.2 mg/mL) 7 gün boyunca tedavi. Bir CTX akut kas hasarı indüklenen ve rejenerasyon Protokolü son yayınlanan13, etik nedenlerle oldu iken, bu yordamı geçerli iletişim kuralında atlanacak. Senescent hücreleri zirvesine daha önce gözlemlenmiştir ne zaman14TA kas örnekleri 10 gün sonrası yaralanma13' toplanacak. Burada, bu ayrıntılı protokolünü yaşlanma (yolu ile SA-β-Gal) düzeyini ve programlama (via IHC MicroRNAs boyama) değerlendirmek için gerekli olan adımları açıklar.
Yaşlanma ile ilişkili beta-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil senescent hücreler kültür ve in vivo15içinde algılamak için en sık kullanılan tahlil olduğunu. Diğer deneyleri için karşılaştırıldığında, SA-β-Gal tahlil için in vivo çalışmada özellikle önemlidir sağlam doku mimarisi ile yerel onların ortamında senescent hücreleri tanımlaması sağlar. Ayrıca, SA-β-Gal tahlil IHC kullanarak diğer işaretleri ile çift mümkündür. Ancak, SA-β-Gal tahlil örnekleri, taze veya dondurulmuş olan büyük bir sınırlama kalır gerektirir. Donmuş TA kas numuneler gibi taze veya dondurulmuş dokular düzenli olarak kullanılabilir olduğunda, SA-β-Gal belli ki senescent hücreleri algılamak için en uygun tahlil olduğunu. MicroRNAs olduğunu reprogramed hücreleri iki nedenden dolayı algılamak için kullanılan işaretleyici: 1) pluripotency için; temel bir işaretleyicidir 2) daha da önemlisi, onun ifade Doksisiklin (dox) tarafından tahrik değil, bu nedenle Yamanaka kaset zorla ifade yerine İndüklenmiş Pluripotent algılar.
Bu çalışmada sunulan boyama iletişim kuralları ayrı ayrı miktar yordamı kolaylaştırmak için yapılan, ama da senescent her ikisi de görselleştirmek için ortak boyama bir yordam ve pluripotent kök hücreler aynı bölümünde yapılabilir unutmamak önemlidir.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>SA-&beta için; Gal boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>SA-&beta için; Gal boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>SA-&beta için; SA</td></tr><tr>-&beta için Gal boyama çözümü<td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>; Gal boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>İn vivo yeniden programlamayı indüklemek için</td></tr><tr><td>Kardiyotoksin</td><td>Lotaksan Değerliği, Fransa</td><td>L8102</td><td>Kas yaralanması için</td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>Fiksasyon çözeltisi için</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron mikroskobu bilimi</td><td>50-980-487</td><td>Fiksasyon çözeltisi için</td></tr><tr><td>NaSitrat : Sodyum Sitrat monobazik bioxtra, anhidr</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>Geçirgenlik çözeltisi için</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Geçirgenlik çözeltisi için</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Yıkama çözeltisi</td></tr><tr><td>Antikor anti-Nanog</td><td>Hücre sinyali</td><td>8822S</td><td>Tavşan monoklonal antikoru</td></tr><tr><td>EnVision+ Kitleri (HRP. Tavşan. DAB +)</td> <td>Nanog vahiy için</td> <td>Dako</td><td>K4010</td></tr><tr><td>Eosin% 1</td> <td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Karşı Boyama</td></tr><tr><td>Hızlı kırmızı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-3403</td><td>Karşı Boyama</td></tr><tr><td>Termo Bilimsel Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher bilimsel</td><td>9990402</td><td>Montaj çözümü</td></tr><tr><td>Mikroskopi için hızlı sertleşen montaj ortamı: Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Montaj çözümü</td></tr><tr><td>Mikroskop Faz Kontrastı Brightfield CKX41: 10X-20X-40X hedefleri</td><td>Nanog miktar tayini için</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td> Mikroskop</tr><tr><td>Fare: i4F-A</td><td>Abad ve diğerleri, 2013</td><td>N/A</td><td>Yeniden programlanabilir fare modeli</td></tr><tr><td>İskelet kası, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slayt Tarayıcı</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>Slayt tarama</td></tr></tbody></table>

yaralanma kaynaklı yaşlanma ve in vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Hücresel yaşlanma kanser ve yaşlanma gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçler için önemlidir istikrarlı hücresel büyüme krizi ile karakterize bir stres yanıttır. Son zamanlarda, yaşlanma Ayrıca doku onarımı ve rejenerasyon karıştığı olmuştur. Bu nedenle, senescent hücreleri vivotanımlamak için giderek kritik haline gelmiştir. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil senescent hücreleri hem de kültür ve in vivoalgılamak için en çok kullanılan tahlil olduğunu. Bu tahlil senescent hücreleri artan lizozomal içeriğinde lizozomal β-galaktozidaz faaliyet histochemical algılanması suboptimum pH (6 veya 5.5) sağlayan temel alır. Akış Sitometresi gibi diğer deneyleri ile karşılaştırıldığında bu doku mimari, Morfoloji, ilgili konumu gibi değerli bilgiler sunan ikamet çevreleri senescent hücrelerde tanımlaması sağlar ve Kaplin immünhistokimya (IHC) üzerinden diğer imleçli olasılığı. Büyük SA-β-Gal tahlil taze veya dondurulmuş örnekler şartı kısıtlamasıdır.
Burada, nasıl hücresel yaşlanma anlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut hücresel plastisite ve doku rejenerasyonu içinde vivoteşvik etmektedir. SA-β-Gal senescent hücreleri iskelet kas doku rejenerasyonu çalışmaya köklü bir sistemdir yaralanma üzerine algılamak için kullanır. Ayrıca, IHC MicroRNAs, bir işaretleyici pluripotent kök hücrelerin bir transgenik fare modelinde algılamak için kullanır. Bu iletişim kuralı incelemek ve hücresel yaşlanma indüklenen hücresel plastisite ve in vivo yeniden programlama bağlamında ölçmek sağlar.

Kas yaralanması indüklenen hücresel yaşlanma algılama
Son zamanlarda kas yaralanması geçici hücresel yaşlanma14indükler kanıtlanmıştır. 10 gün sonrası yaralanma (DPI), bozuk myofibers çoğunluğu yenilenme merkezi konuma sahip çekirdeklerin, myofibers, yenileyici bir hallmark ile geçiren ve kas mimarisini yeniden kurulur. İnfiltrating inflamatuar hücrelerin belirli bölgelerde görünür kalan süre önemli ölçüde a...

Burada senescent her ikisi de algılamak için detaylı bir protokol ve pluripotent kök hücre iskelet kas üzerine vivo içinde yeniden programlama inducing sırasında yaralanma mevcut. Bu yöntem doku yeniden oluşturma işlemi sırasında hücresel yaşlanma rolünün değerlendirilmesi ve in vivoyeniden programlama için uygundur.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Bu protokolün genel amacı, doku hasarı sonrası iskelet kasındaki hem in vivo senesansı hem de yeniden programlamayı değerlendirmektir. Bu yöntem, kas rejenerasyonunu desteklemek için hücresel plastisitenin nasıl artırılacağı gibi rejeneratif tıp alanındaki kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yerleşik ortamdaki senesent hücreleri tespit etmek ve miktarını belirlemek için güvenilir bir yöntem sunmasıdır.Hücre yaşlanmasının son zamanlarda doku onarımı ve rejenerasyonunda rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Yaşlanmanın doku onarımına ve rejenerasyonuna nasıl katkıda bulunduğuna dair mekanizmaların anlaşılmasının, rejeneratif tıp üzerinde kesinlikle bir etkisi olacaktır. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, iskelet kasında in vivo yeniden programlama üzerindeki potansiyel doku hasarı etkilerini araştırırken ortaya çıkmıştır.Bu prosedüre başlamak için, kas örneği lamlarını %1 paraformaldehit ve %0,2 glutaraldehit içeren PBS içerisinde dört dakika boyunca fikse edin. Ardından, lamları her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, lamları pH 5,5 PBS ile 30 dakika boyunca yıkayın.Ardından, kesitleri X-gal çözeltisi ile birlikte kar

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP ° C. elegans

Bu protokol, yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından izole edilmesi ve miyoblast progenitör hücrelerin kültür sağlam tekrarlanabilir ve basit bir yöntem tarif eder. Burada kullanılan kaslar ayak ve bacak kaslarını içerir. Bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için birincil miyoblastların zenginleştirilmiş popülasyonun izolasyon sağlar.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Ölçüm kemirgen iskelet kası contractile işlevinin hastalık ilerleme ve terapötik müdahale etkinliğini izlemek için kullanılan yararlı bir araçtır. Burada zaman içinde aynı fare tekrarlanan dorsiflexor kasları non-invaziv, vivo içinde değerlendirilmesi açıklayın.

Non-invaziv Dorsiflexor kas fonksiyonu farelerde değerlendirilmesi

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Bu protokolde, kas kök hücreleri için endojen nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyan bir in vitro kültleme ve fonksiyonel analiz yöntemi tanımlanmıştır.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Bu protokolün amacı orofasiyal kas fibrozis modeli oluşturmaktır. Dondurma yaralanması sonrası fareler masseter ve tibialis anterior kası arasındaki histolojinin karşılaştırılması masseter kas fibrozisini doğruladı. Bu model, orofasiyal kas fibrozisinin altında yatan mekanizmanın daha fazla araştırılmasını kolaylaştıracaktır.

Orofasiyal kas fibroz modeli oluşturmak için fare masseter kasında donma yaralanması

Öğrenin, iskelet kasında in vivo yaşlanma ve yeniden programlamayı değerlendirmek için bu güvenilir yöntemi. Doku hasarı sonrası hücresel plastisiteyi artırarak kas rejenerasyonunu destekler.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet