Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Bu protokolün genel amacı, doku hasarı sonrası iskelet kasındaki hem in vivo senesansı hem de yeniden programlamayı değerlendirmektir. Bu yöntem, kas rejenerasyonunu desteklemek için hücresel plastisitenin nasıl artırılacağı gibi rejeneratif tıp alanındaki kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yerleşik ortamdaki senesent hücreleri tespit etmek ve miktarını belirlemek için güvenilir bir yöntem sunmasıdır.

Hücre yaşlanmasının son zamanlarda doku onarımı ve rejenerasyonunda rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Yaşlanmanın doku onarımına ve rejenerasyonuna nasıl katkıda bulunduğuna dair mekanizmaların anlaşılmasının, rejeneratif tıp üzerinde kesinlikle bir etkisi olacaktır. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, iskelet kasında in vivo yeniden programlama üzerindeki potansiyel doku hasarı etkilerini araştırırken ortaya çıkmıştır.

Bu prosedüre başlamak için, kas örneği lamlarını %1 paraformaldehit ve %0,2 glutaraldehit içeren PBS içerisinde dört dakika boyunca fikse edin. Ardından, lamları her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, lamları pH 5,5 PBS ile 30 dakika boyunca yıkayın.

Ardından, kesitleri X-gal çözeltisi ile birlikte karanlıkta 37 °C'de en az 24 saat inkübe edin. Sonrasında, lamları üç kez, her seferinde 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Daha sonra, lamları %1 paraformaldehit içeren PBS ile 30 dakika boyunca post-fiksleyin.

Son olarak, lamları üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, lamları bir dakika boyunca eozin çözeltisine daldırarak %0,2 eozin ile karşı boyama yapın. Daha sonra, lamları kısa bir süre distile su ile durulayın.

Slaytları sulu, floresan yaymayan bir montaj ortamı ile kapatın. Slaytları %4 paraformaldehit içeren PBS ile 10 dakika boyunca sabitleyin. Slaytları her seferinde 10 dakika olacak şekilde iki kez PBS ile yıkayın.

Ardından, permeabilizasyon çözeltisini ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Bunu takiben, lamları iki kez, her seferinde beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Son yıkamada, %0,25 BSA içeren 200 µL PBS'yi beş dakika boyunca doğrudan lamların üzerine ekleyin.

Slaytları, %5 FBS içeren PBS içinde, 1.25 µg/mL konsantrasyondaki primer anti-Nanog antikor ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Slaytları iki kez, her seferinde 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Son yıkama adımında, %0.25 BSA içeren 200 µL PBS'yi beş dakika boyunca kullanın.

Ardından, lamları kullanıma hazır bir kit içerisinde bulunan 100 µL RAB-HRP sekonder antikor ile 45 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, sekonder antikoru uzaklaştırmak için lamları üç kez, her seferinde beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Bundan sonra, kullanıma hazır kit ile birlikte sağlanan substrat tamponunda DAB'ı seyreltin.

Şiddetli bir şekilde vorteksleyin. Her bir lama doğrudan 100 µL DAB çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında maksimum 10 dakika inkübe edin. Ardından, lamları suyla durulayarak DAB çözeltisini uzaklaştırın.

Slaytları iki dakika boyunca fast red çözeltisi ile karşı boyayın. Ardından, slaytları tekrar kısa bir süre suyla yıkayın. Bunu takiben, slaytları beş dakika boyunca %95 ethanol ile, ardından her biri beşer dakika sürecek şekilde iki kez %100 ethanol ileydehidre edin.

Ardından, lamları hızlı sertleşen montaj medyumu ile kapatın. Arka plan gürültüsünü önlemek için lamları mikroskop altında 20x büyütmede parlak alanla inceleyin. Bu işlemde, lamları tarayın ve doku bütünlüğü, boyama kalitesi ile karşıt boyamaya dayanarak, her lamda birbirine mümkün olan en uzak mesafede yer alan en iyi kaliteye sahip iki kesiti seçin.

Bu iki kesitteki SA-Beta-Gal pozitif hücreleri sayın ve ortalama değeri hesaplayın. Ardından, en küçük ve en büyük pozitif SA-Beta-Gal hücrelerini manuel olarak seçerek piksel boyutunun sıralamasını belirleyin. ImageJ Arayüzünde Analyze, Tools, ROI Manager, Analyze, Set Measurement sekmelerine tıklayın.

Ardından, Area seçeneğini seçin. Seçim aracını kullanarak en küçük ve en büyük pozitif SA-Beta-Gal hücrelerini çevreleyin ve Add butonuna tıklayarak bunları ROI Yöneticisine ekleyin. Bundan sonra, Measure butonunu kullanarak boyutları ölçün ve değerleri daha sonra kullanmak üzere kaydedin.

Ardından, görünürdeki tüm pozitif hücrelerin seçildiğinden emin olmak için eşik parametresini ayarlayın. Görüntü (Image), Tür (Type) ve ardından 8-bit seçeneklerine tıklayarak görüntüyü gri tonlamalıya dönüştürün. Sonrasında Görüntü (Image), Ayarla (Adjust) ve Eşik (Threshold) adımlarını takip edin.

Tüm pozitif SA-Beta-Gal hücreleri kırmızıyla kaplanana kadar ikinci imleci hareket ettirin, ardından Apply seçeneğine tıklayın. Analyze, Analyze Particles ve ardından Size seçeneklerine tıklayarak partikülleri analiz edin ve daha önce tanımlanan değeri uygulayın. Circularity kısmına 0.00-1.00 değerini girin ve OK seçeneğine tıklayın. Sayılan tüm partiküllerin özeti ROI Manager'da gösterilecektir.

Şimdi, seçilen tüm partikülleri orijinal görüntüye aktarın. Doğru nicelleştirme sağlamak için seçimi manuel olarak ayarlayın. Pozitif hücreler ekleyin veya yanlış pozitif hücreleri çıkarın.

Son olarak, seçim aracını kullanarak ilgili bölümün ana hattını belirleyip alanı ölçün. ROI Manager'a tıklayıp Add, ardından Measure seçeneklerini seçin. Mikroskop altında, parlak alan görüntüsündeki Nanog pozitif hücreleri 20x büyütmede manuel olarak sayın.

Burada, kas yaralanması sonrası in vivo yeniden programlama ve senesans düzeyini değerlendirmek için kullanılan şematik bir gösterim sunulmuştur. Hasarlı iskelet kasının dondurulmuş kesitlerinde SA-Beta-Gal ve Nanog boyamasının temsilci görüntüleri aşağıdadır. Bu görüntüler, eosin ile karşıt boyama yapılmış SA-Beta-Gal boyamasını ve fast red ile karşıt boyama yapılmış Nanog boyamasını göstermektedir.

Yaralanmamış kaslar üstte, yaralanmış kaslar ise altta gösterilmiştir. Bu grafik, yaralanma sonrası 10. gündeki ardışık kesitlerde SA-Beta-Gal pozitif ve Nanog pozitif hücrelerin miktarını ve korelasyonunu göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, boyamanın özgüllüğünü sağlamak için her zaman bir negatif kontrol eklemeyi hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, yaşlı hücrelerin hücresel kimliği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla immünofloresan gibi tüm yöntemler uygulanabilir ve farklı yaşlanma markerları ile tüm hücre tipleri seçilebilir. Her bir gelişme sonrası bu teknik, yaşlanma veya doku onarımı ve rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların, hücresel yaşlanmanın memelilerde doku onarımı ve rejenerasyonunu kolaylaştırmak için hücresel plastisiteyi nasıl teşvik edebileceğini keşfetmelerine yol açmıştır. Dolayısıyla, bu videoyu izledikten sonra, hem yaşlı hem de yeniden programlanmış hücrelerin in vivo olarak nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.