Name: Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNAların düzeyde şarj (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin, Escherichia coli'de transfer RNA şarj seviyelerini miktar olarak nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, farklı büyüme koşullarında RNA dinamiklerini karşılaştırmalı analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.

1. bakteriyel kültürlerde hazırlanması.
<ol><li>Grow bütün kültürlerde Erlenmeyer şişeler ile bir kültür/şişesi hacim oranı en az 1/6. 37,0 ° C'de kültürler ve tercih edilen karbon kaynağı, örneğin % 0,2 glikoz, en az 10 ile takıma morpholinepropanesulfonic asit (paspas) en az orta 18 160 rpm'de sallayarak tipik bir deneysel Kur içinde büyümek RNA hasat önce üst üste nesilleri.</li>
	<li>RNA hasat, önceki gün seyreltik BEZLERİ en az orta ertesi gün istediğiniz saatte istediğiniz OD 436 ulaşacak şekilde istenen yük outgrown bir kültür. Aşılama için formül tarafından kullanmak için kültür geçmek hacmi hesaplamak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> Not: Burada, OD Yeni istenen OD 436 gösterir Kuluçka sonra V Yeni gösterir seyreltilmiş kültür hacmi, OD eski gösterir üzerinden seyreltilmiş outgrown kültürünün OD 436, G gösterir kültür büyür, nesil sayısı üzerinden seyreltme (TRT 1) gün sonra (t 2) gerekli değildir ve olarak hesaplanan zaman zaman: zaman farklılığı (dk) arasında TRT 1 ve t 2 nesil süresi (dk) bölünür. Örnekleme zamanında kararlı durum büyüme sağlamak için G olmalıdır &#8805; 10; V eski taze ortamına aktarılması gerektiğini dışı yetiştirilen kültür seviyesini gösterir. Bu denklem için herhangi bir gecikme aşama hesaba katmaz bir yaklaşım olduğunu; seyreltme taze medya dışı yetişkin bir kültür sonra sık sık gözlenen bir fenomen.
	<ol><li>Büyüme koşulları deneme amacına bağlı olarak değişiklik gösterir, ama hücre hücre varyasyon tRNA düzeyleri ve sonuçları (önerilen), tekrarlanabilirlik artırmak için büyümek örnekleme öncesi durumunu sürekli kültürler sınırlamak için 19.</li></ol></li></ol> 2. Spike hücreler hazırlanması Not: tRNA selC bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kontrolü altında kodlama selC gen ifade E. coli zorlanma MAS1074,- indüklenebilir organizatörü spike zorlanma kullanılır.
<ol><li>Dilute MAS1074 outgrown bir kültür 0,05 BEZLERİ içinde bir OD 436 için en az orta 100 µg/mL Ampisilin ve % 0,2 glikoz ile desteklenmiştir. 160 rpm'de sallayarak 37 ° C'de kültür büyümek. 
	Not: tartışma bir alternatif başvuru zorlanma kullanımı için bkz.</li>
	<li>, OD 436 ~ 0,1, tRNA selC ifade ikna etmek için 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyin. Kültür OD 436 ~0.5 için büyümek (~ 3-4 s büyüme) ve kültür şişeye bir buz banyosu için hareket. RNA arıtma için tüm örneklerini hasat kadar buz spike hücre kültür devam.</li>
</ol> 3. Deneysel örnekleri hasat.
<ol><li>Öncesi sıcak (37 ° C) bir şapkalı 100 mL Erlenmeyer şişesi (veya benzeri) bir sıcak su banyosunda yerleştirerek her örnek için 4 mL % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA) içeren. 
	Not: dikkat, hidrojen klorür ve kloroform gibi toksik ve aşındırıcı duman üreten Isıtma üzerine TCA parçalanır. Güçlü bir asit suda çözümdür; Bu şiddetle üsleri ile reaksiyona girer ve birçok metaller atmış. Bu sıvı kullanırken gerekli tedbirleri alınmalıdır.</li>
	<li>Hemen önce hücre hasat, ölçmek ve kültür OD 436 rekor.</li>
	<li>Hücreleri hasat, kültür 4 mL TCA içeren önceden ısıtılmış bir şişesi transfer.</li>
	<li>İçin 5 s. karıştırma TCA ile hemen tüm enzimatik faaliyetleri devre dışı bırakır ve böylece tRNA şarj düzeyini korur şişeye el ile dönen tarafından örnek mix. 
	Not: Eğer birden fazla örnekleri toplanması için tüm örnekleri toplayana kadar hasat örnekleri TCA buz üstünde tutun.</li>
</ol> 4. Ayrıca spike hücreler Not: spike hücreler hazırlanması adım 2'de açıklanan.
<ol>Ne zaman tüm örnekleri için RNA hazırlık <li>toplanmıştır, her örnek için (OD üzerinde göre) % 5 spike hücreler ekleyin. 
	Not: Gerekli spike hücre kültür hacmi formülle hesaplanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> V spike gerekli, spike-in hücre kültürü hacmi gösterir nerede V exp hacmi gösterir (TCA) olmadan hasat deneysel hücre kültürü, OD exp deneysel hücre kültürü OD 436 hasat TCA içine zaman gösterir. OD spike spike hücre kültürünün OD 436 gösterir. Eğer birden fazla örnekleri farklı ODs hasat, birimin eklendi spike hücreler her örnek için formüle göre ayarlanmalıdır.</li>
	Spike hücreler katkısı faiz, RNA türü ölçmek için <li>sadece 4 mL spike hücreler 4 mL TCA ile karıştırılarak spike hücreler içeren bir örnek hazırlamak. RNA bu örnekten diğer örnekleri için aynı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, spike hücreler, olmadan sadece deneysel örnek içeren başka bir şişe al ve tRNA için deneysel örnek katkısını ölçmek için içerir selC düzeyleri; tRNA selC endojen düzeyleri E. coli K-12 negligibly düşük.</li>
</ol> 5. RNA'ın hazırlık Not: Burada açıklanan RNA hazırlık protokoldür esasen Varshney ve ark. tarafından açıklanan 1; Aminoacylated tRNA deacylation arıtma sırasında önlemek için asidik pH ve arıtma seyri boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak önemlidir. Örnekleri ve çözümleri tutmak için temiz steril tüpler/şişeler kullanın ve tüm çözümler ultrasaf (18,2 MΩ·cm direnci ile) su hazırlayın.
<ol><li>Bir buz soğuk santrifüj tüpü dönüştürmek dökün 8 mL. Örnekleri de 4 ° C. tamamen Kaldır süpernatant 9.500 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve 0.3 mL soğuk 0,3 M sodyum asetat içinde pH 4.5 ve 10 mM EDTA resuspend.</li>
	<li>Her örnek için bir soğuk 1.5 mL microcentrifuge tüp nakletmek ve eklemek ile aynı tampon equilibrated 0.3 mL fenol. 
	Not: dikkat, fenol zehirli gazlar oluşturur ve cilt için son derece korozif.</li>
	<li>Girdap her örnek 10 x 15 için en az 1 dk her girdap arasında bir iyimsersin. Vortexing arasında örnekleri 0 tutmak ° C. örnekleri soğuk kalmasını sağlamak için sık sık duraklar kullanın.</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 15 dk santrifüj örnekleri ° C. Transfer (üst aşama) su aşamaya yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpleri. 0.3 mL soğuk fenol ve girdap 4 x 15 s daha önce olduğu gibi ekleyin.</li>
	<li>4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. Transfer 2,5 kat % 96 etanol (~ 750 µL) birimi içeren yeni, soğuk 1.5 mL microcentrifuge su aşamaya tüpleri. Tüpler için 1 h-20 ° C veya gecede-80 kuluçka tarafından RNA çökelti ° C.</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj örnekleri ° C. süpernatant atmak ve RNA Pelet bozmadan 1 mL soğuk % 70 etanol dikkatle ekleyin. Yavaşça iç etanol ile tüplerin yıkamak için bir kez tersine çevirin. 
	Not: Pelet Bu adımda görmek zor olabilir.</li>
	<li>4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve kadar hiçbir etanol sol Pelet kuruması. Pelet tarafından şiddetle vortexing 20 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4.5 ve 1 mm EDTA resuspend. 
	Not: o-ecek var olmak resuspend zor gibi Pelet aşırı kuru değil.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, RNA konsantrasyonu 260 Absorbans ölçerek değerlendirmek nm.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, özel Jel Elektroforez 20 tarafından arıtılmış RNA kalitesini değerlendirmek.</li>
	<li>Mağaza örnekleri-80, ° C. 
	Not: Burada protokol duraklatılmış.</li>
</ol> 6. Kimyasal olarak deacylated denetimi örneğini hazırlanması Not: aminoacylated grup ayırt etmek için Kuzey üzerinde deacylated karşılığından tRNA leke, bir kimyasal deacylated aliquot alkali tedavisi tarafından hazırlanmıştır. Çoğu amaç için Kuzey her leke için deacylate tek bir örnek yeterli.
Buz <ol><li>tezcan RNA örnek. 4 µL aliquot RNA örneği için yeni bir tüp aktarın. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 ekleyin. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>PH 4.5 0,3 M sodyum asetat 15 µL ekleyip daha sonra 125 µL % 96 etanol ekler. -20 ° c için 1 h. RNA çökelti</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve 4 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4,5 ve 1 mM EDTA içinde resuspend. 
	Not: örnek-80 depolanıyorsa, protokol, duraklatılmış ° C.</li>
</ol> 7. Jel Elektroforez ve Kuzey kurutma <ol><li>Mix 4 µL örnek (tedavi edilmemiş veya kimyasal olarak deacylated) ile 6 µL yükleme arabellek (0.1 M sodyum asetat (pH 5,0), 8 M üre, % 0.05 bromophenol mavi ve % 0.05 Ksilen cyanol). 
	Not: yalnızca spike hücreler, içeren örnek eklemeyi unutmayın kimyasal olarak deacylated sample (ve bir hazır spike hücreler, olmadan).</li>
	<li>Örnekleri üzerine bir 0.4 mm kalınlığında % 6,5 polyacrylamide 0.1 M sodyum asetat arabellek (pH 5,0) 8 M üre içeren jel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) yükleyin. TRNA türler uygun ayırma için 60 cm uzun jelleri kullanın.</li>
	<li>Ayrı RNA, 4 ° C'de 10 V/cm Jel Elektroforez tarafından mavi bromophenol kadar ulaşır jel (~ 20 h) alt.</li>
	<li>Alan Ksilen cyanol boya ve bromophenol mavi doğru aşağı 20 cm boya kurutma için kullanılır (iki boyalar arasındaki uzaklığı 25-30 cm olmalıdır). Böylece jel onlardan biri kalır iki cam levha, dikkatlice ayırın. Filtre kağıdı ince bir parçası istenen blotting alan boyutuna kesme ve kurutma için kullanılacak jel parçası üzerine yerleştirilir. Filtre kağıdı tarafından kapsanmayan jel parçaları kesilmiş ve atılan. jel parça cam levha uzak çýkýntýdan için filtre kağıdı kullanın. 
	Not: Büyük jel çok kırılgandır çok özenle ele.</li>
	<li>Pozitif yüklü naylon membran (örneğin Hybond N + membran) jel üstüne yerleştirilir ve bu electroblotted 20 V 90 dk 40 mM Tris-asetat (pH 8.1), 2 mM EDTA Aktarım arabellek kullanarak için.</li>
	<li>Crosslink RNA UV ışık kullanarak membran için (0,12 J/cm 2). 
	Not: Membran-ebilmek şimdi var olmak stok oda sıcaklığında ve protokol burada duraklatıldı.</li>
</ol> 8. Tasarım ve sondalar doğrulanması Not: dikkatli tasarım ve Kuzey leke probları doğrulanması güvenilir sonuçlar elde etmek ve diğer RNA türleri ile istenmeyen çapraz hibridizasyon önlemek için çok önemli.
<ol><li>Kullanım probları olarak kısa sentetik oligonucleotides. Sonda sıra faiz tRNA dizisi en benzersiz bir parçası için tamamlayıcı - bu kez antikodon döngü olduğunu bir şekilde Tasarla. 
	Not: Çeşitli organizmalar üzerinden tahmin edilen tRNA sıralarının listesini veritabanı (GtRNAdb) 21 genomik tRNA bulunabilir.</li>
	<li>Ayarlama bir tahmin almak için dizinin uzunluğunu erime sıcaklığı 55-65 ° c</li>
	<li>Patlama (temel yerel hizalama arama aracı) seçilmiş sıra sıra 22 içinde açıklandığı gibi seçili tRNA için benzersiz olduğunu doğrulamak için deneyde kullanılan bakteriyel zorlanma genom dizisi karşı. 
	Not: Tablo 1 E. coli K12 birkaç farklı tRNA için önerilen sonda serilerini listeler. Sonda faiz tRNA için belirli ise, sadece iki grup Kuzey leke (şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA) görünür ve yalnızca bir grup şeritte deacylated örnek (doldurulmamış tRNA) ile görülür. Daha--dan iki grup varsa veya daha fazla sonda özgüllük doğrulanmasını isterseniz, bkz.</li>
</ol> 9. Kuzey blot hibridizasyon Not: Aşağıdaki adımlarda, membran sırayla probları başvurusu için belirli bir sonda da dahil olmak üzere istediğiniz belirli tRNA tamamlayıcı ile melezleşmiştir tRNA selC.
<ol><li>Membran bir hibridizasyon tüpü yerleştirin ve 6 mL hibridizasyon çözüm ekleyin (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, %0,5 (w/v) SDS, 100 mg/mL sheared ve denatüre ringa balığı sperm DNA ve 5 x Denhardt &#39; s çözüm (100 x Denhardt &#39; s çözüm % 2 sığır serum albümin, % 2 polyvinylpyrrolidone 40 ve % 2 = Ficoll)).</li>
	<li>Ön arabellek için 1S 42 ° C. Ekle 30 pmol radyoaktif oligo-DNA prob 5 dönen membran melezlemek &#39; - sonu - etiketli ile 32 (Sambrook et al. tarafından açıklandığı gibi hazırlanmış P 23) Not: dikkat, 32 P yüksek enerjili beta emisyonları önemli cilt ve göz doz tehlike sunabilirim. 32 s. radyoaktif atık kullanarak, uygun kurumsal güvenlik protokollerini göre atılmalıdır zaman gerekli tedbirleri alınmalıdır.</li>
	<li>Membran gece 42, dönen sonda kuluçkaya ° C. Kaldır tek kullanımlık 10 mL pipet kullanarak soruşturma. 
	Not: Eğer bir dolaba saklanan sonda kullanılabilmesinden.</li>
	<li>Hibridizasyon tüpte membran 0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS oda sıcaklığında 50 mL kısa bir süre içinde yıkayın. 
	Not: Bu ilk yıkama çok ilişkisiz sonda içerir ve son derece olarak radyoaktif işlenmeli.</li>
	<li>Tekrar bir kez 9,4 adım, o zaman bir düz plastik konteyner veya bir kapak dahil olmak üzere tepsi membran taşıma. Yıkama solüsyonu (0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS) membran kapak ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama çözüm değiştirin ve çamaşır kadar tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı (, çözüm yıkama kez 3-4 değişiklikleri) elde etti. Nasıl boş bir alanı radyasyondan membran ölçerek gürültü oranı sinyal değişiklikleri algılamak ve nerede sonda özellikle tRNA melezleşmiştir alanına karşılaştırmak için bir Geiger-Müller tüpü kullanın.</li>
	Sonda zar maruz kaldıktan sonra şerit edebilmek için <li>emin olun (önemli) membran önce striptiz yordamı kurumasına olduğunu. Membran bir ince plastik torba veya sıkıca plastik kullanarak sarın ve hava-teyp veya kaynak tarafından sıkı sıkıya bağlanmanızı mühür şal yerleştirin. Mühürlü membran phosphorimaging ekrana koyun. 
	Not: Phosphorimaging ekrandaki gerekli çekim hızı belirlenir sonda, özel faaliyetin tarafından RNA miktarı fo probedr ve sonda ve can hibridizasyon etkinliğini büyük ölçüde değişir; birkaç gün için bir kaç dakika uzaklıktadır. Deneyimi ile membran Geiger-Müller tüpü ile algılanan radyasyon şiddetini gerekli çekim hızı iyi bir gösterge sağlar. Güvenilir miktar için ekran değil pozlanmış önemli.</li>
	<li>Bir lazer tarayıcı kullanarak phosphorimaging ekran tarama ve dosyaya kaydetmek &#34; .gel &#34; biçimi. 
	Not: Bir yüksek sinyal gürültü oranı güvenilir miktar için gereklidir. Bir tRNA sondalama iki bantlarında sonuçlanmalıdır; bir içeren aminoacylated tRNA (daha yavaş geçiş) ve bir içeren deacylated tRNA (daha hızlı geçiş). Bkz: Şekil 2.</li>
</ol> 10. Membran sıyırma Not: membran için başka bir tRNA probed önce önceki sonda ilk membran sıyırma tarafından kaldırılmalıdır.
Membran kapak ve membran dökmek için <ol><li>ısı yeterince sıyırma arabellek (15 mM NaCl, 1.5 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS). 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Tekrarlama adım 10.1 radyasyon yok kadar bir Geiger-Müller tüpü ile tespit; membran-ebilmek şimdi var olmak bölüm 9 açıklanan adımları izleyerek yeniden melezleşmiştir.</li>
</ol> 11. TRNA miktarının ve düzeyleri şarj <ol><li>yükü görüntüleme .gel dosyasına yazılım (Tablo reçetesi görmek). Nereye sinyal 3A rakam gösterildiği gibi düzensiz, olabilir bu yolun genişliğini çoğunu yayılmıştır ancak bantları kenarları hariç böyle bir şekilde her örnek yolları boyunca dikey bir çizgi çizmek.</li>
	<li>Visualize'ı tıklatarak her şeritli gelen sayar &#34; analiz &#34;-&#62; &#34; grafik oluşturmak &#34;. Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA her şeritli gelen temsil eden iki doruklarına şekil 3B ' gösterildiği gibi tanımlarken.</li>
	<li>Edinmek sayıları her ayında en yüksek tıklatarak &#34; analiz &#34;-&#62; &#34; alan rapor &#34; ve her iki doruklarına altına alan kayıt.</li>
	Ne zaman leke tRNA selC ve en az bir tRNA ilgi için probed <li>tRNA tRNA selC ilgi düzeyleri normale.
	<ol><li>Her şeritte spike hücreler kaynaklanan tRNA oranını hesaplamak ve toplam sinyal denklemi kullanarak bu şeritte değerden çıkarmak: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> Not: Burada, Örnek tRNA bir tek şeritli bir membran için istenen tRNA; probed elde edilen sinyal = Örnek selC tRNA selC için; probed aynı membran aynı lane elde edilen sinyal = Ref tRNA için istenen tRNA; probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal = Ref selC tRNA selC için probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal =.</li>
		Normalize etmek <li>tRNA selC sinyal aynı Lane tarafından düzeltilen tRNA değeri her Lane bölmek. 
		Not: tRNA selC sinyal katkısı örneklenen hücrelerden ihmal edilebilir düzeydedir (bkz: Şekil 2, lane etiketli &#34;-selC &#34;).</li>
	</ol></li> <li>Her iki zirveleri sinyal toplamı ile dolu tRNA temsil eden en yüksek sinyal bölerek düzeyinde her lane için şarj oluyor tRNA hesaplamak (ücret + doldurulmamış).</li></ol>

<ol><li>Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li>
<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Krüger, M. K., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li>
<li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li>
<li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li>
<li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li>
<li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global%2C+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).</li>
<li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li>
<li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+codon+bias%3A+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li>
<li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+%28Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li>
<li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation%3A+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).</li>
<li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li>
<li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0926655062903456">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li>
<li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li>
<li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21460796">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li>
<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmaktadır.
tRNA arıtma
<p ...

Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.
tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA'ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA'lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.
E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.
Bu yöntem, aynı zamanda "mischarging"; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA'ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.
Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA'ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA'ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir "temizlik" RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA'ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.
E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane "selC" etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.

<table><tbody><tr><td>Üre</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Saflık >% 99</td></tr> <tr><td>Poliakrilamid</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N, N'-Metilen-bis-akrilamid)</td> <td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit (TCA)</td> <td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringa Balığı Sperm DNA</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirolidon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 & gama; ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligoları (problar)</td><td>TAG Kopenhag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ membran</td><td>GE Sağlık</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Çapraz Bağlayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektro Kurutma Makinesi</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Tarayıcı</td><td>GE Sağlık 28955809</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidridizasyon fırını</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geiger-M&uuml; ller tüp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfor görüntüleme ekranı</td><td>GE Sağlık</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon tüpü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kültür Şişeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

miktar bolluk ve escherichia coli olarak transfer rna'ların düzeyde şarj

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA'lar ek avantajı vardır.

Yordamı kullanarak burada, bereket ve üç tRNA düzeyde E. coli K-12 öncesi ve amino asit açlık sırasında ölçüldü şarj açıklanır.
Arginin auxotroph süzün NF9154 (thr Leyi onun argH thi mtl supE44) BEZLERİ en az orta % 0,4 gliserol, 50 µg/mL treonin, lösin, arginin ve 5 µg/mL histidin, sallayarak 37 ° C'de ile takıma en az on nesiller için yetiştirilen oldu 160 d/dak. Arginin açlık filtrasy...

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Bu deneyin genel amacı, Escherichia coli'deki transfer RNA'larının bolluğunu ve şarj seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, tRNA şarj seviyelerinin farklı büyüme durumlarında nasıl değiştiği gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, RNA seviyelerinin, hücrelerdeki RNA'nın bileşimini büyük ölçüde değiştiren büyüme durumları arasında bile kantitatif olarak karşılaştırılabilmesidir.Bu deneye, metin protokolüne göre deneysel ve spike-in E.coli kültürlerini büyüterek başlayın. Spike-in kültürünü 37 santigrat derecede büyütürken, 160 RPM'de sallayın. Spike-in kültürü yaklaşık 0.1'lik bir OD436'ya ulaştığında, IPTG ekleyerek tRNA hücresi C'nin ekspresyonunu indükleyin.Kültürü, yaklaşık 0,5'lik bir OD436'ya ulaşana kadar büyütün. Ardından, tüm numuneler hasat edilene kadar kültürü buza taşıyın. Bundan sonra, 37 santigrat derecelik bir su banyosunda her numune için dört mililitre% 10 TCA içeren 100 mililitrelik kapaklı bir kültür şişesini önceden ısıtın.Deney kültürlerinin OD436'sını hücre hasadından hemen önce ölçün ve kaydedin. Daha sonra, dört mililitre kültürü önceden ısıtılmış bir TCA içeren şişeye aktarın. Numuneyi, şişeyi beş saniye boyunca döndürerek elle karıştırın, bu, tRNA'ların şarj seviyelerini koruyarak tüm enzimatik aktiviteleri hemen devre dışı bırakacaktır.Tüm numuneler toplandığında, her numuneye %5 oranında ani giriş yapan hücreler ekleyin. Ayrıca, metin protokolünde açıklandığı gibi yalnızca spike-in hücrelerinden oluşan bir kontrol numunesi hazırlayın. RNA ekstraksiyonunu başlatmak için, kontroller de dahil olmak üzere her numuneden sekiz mililitreyi buzla soğutulmuş bir santrifüj tüpüne dökün.Numuneleri 9, 500 x G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkardıktan sonra, peleti 10 milimimolar EDTA içeren 0.3 mililitre soğuk sodyum asetat içinde tekrar süspanse edin. Her numuneyi soğuk 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve peleti yeniden süspanse etmek için kullanılan tamponla dengelenmiş 0.3 mililitre fenol ekleyin.Ardından, her numuneyi her seferinde 15 saniye boyunca 10 kez girdaplayın. Numuneleri soğuk tutmak için her girdap arasında sıfır santigrat derecede en az bir dakika ile. Daha sonra, numuneleri 20.000 x G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.Üst veya su yüzeyini yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Su yüzeyine 0.3 mililitre soğuk fenol ekleyin ve numuneleri daha önce tarif edildiği gibi her biri 15 saniye olmak üzere dört kez girdaplayın. Ardından, numuneleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 x G'de santrifüjleyin.Su yüzeyini yeni bir soğuk 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.5 hacim soğuk% 96 etanol ekleyin. Ardından, RNA'yı çökeltmek için tüpleri bir saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri 20.000 x G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin.Süpernatanı çıkardıktan sonra, RNA peletine dikkatlice bir mililitre soğuk %70 etanol ekleyin ve onu rahatsız etmemeye dikkat edin. Etanol ile yıkamak için tüpü bir kez hafifçe ters çevirin. Son olarak, 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 x G'de santrifüjleyin.Süpernatanı tamamen çıkarın ve etanol tamamen çıkana kadar peleti havayla kurutun. 1 milimolar EDTA içeren 20 mikrolitre soğuk sodyum asetatta, peleti yeniden süspanse etmek için kuvvetlice girdap. Elektroforezi başlatmak için, her numunenin dört mikrolitresini altı mikrolitre yükleme tamponu ile karıştırın.Numuneleri, kontroller dahil olmak üzere, sekiz molar ureal ve 0.1 molar sodyum asetat tamponu içeren 0.4 milimetre kalınlığında 6.5 poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Daha sonra, bromofenol mavisi boya jelin dibine ulaşana kadar yaklaşık 20 saat boyunca dört santigrat derecede jelin santimetresi başına 10 voltta elektroforezi çalıştırarak RNA'yı ayırın. İki cam plakayı, jel bunlardan birinde kalacak şekilde dikkatlice ayırın.Lekeleme için ksilen siyanol boyasından jel alanını ve bromofenol boyasına doğru 20 santimetre aşağı doğru kullanın. İstenilen lekeleme alanının boyutuna göre ince bir filtre kağıdı parçası kesin. Filtre kağıdını, jelin lekeleme için kullanılacak kısmının üzerine yerleştirin.Jelin filtre kağıdı ile kaplanmamış kısımlarını kesin ve atın. Ardından jeli cam plakadan dikkatlice kaldırmak için filtre kağıdını kullanın. Jelin üzerine pozitif yüklü bir naylon membran yerleştirin ve 90 dakika boyunca 20 voltta transfer tamponunda elektroblot yapın.UV ışığı kullanarak RNA'yı zara çapraz bağlayarak bitirin. Daha sonra, çapraz bağlı zarı bir hibridizasyon tüpüne yerleştirin ve altı mililitre hibridizasyon çözeltisi ekleyin. Membranı önceden hibritlemek için tüpü bir saat boyunca 42 santigrat derecede döndürün.Daha sonra, beş asal ve P32 ile etiketlenmiş 30 tepe molar radyoaktif oligo DNA probu ekleyin. Membranı prob ile gece boyunca 42 santigrat derecede inkübe etmek için döndürün. İnkübasyondan sonra, probu çıkarmak için tek kullanımlık 10 mililitrelik bir pipet kullanın.Daha sonra, zarı hibridizasyon tüpünde iki kez, oda sıcaklığında 15 mililitre yıkama solüsyonunda hızlı bir şekilde yıkayın. Membranı düz plastik bir kaba koyun, yıkama solüsyonu ile örtün ve kapağı kapatın. Membranı oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin.Solüsyonu değiştirin ve tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde edene kadar yıkamaya devam edin. Probun tRNA'ya hibritlendiği alandan gelen radyasyonu boş bir alandan gelen radyasyonla karşılaştırarak sinyal-gürültü oranını elde etmek için bir geiger muller tüpü kullanın. Bundan sonra, zarı streç filmle sıkıca sarın ve kaynak yaparak hava geçirmez şekilde kapatın.Bu zarı bir fosfor görüntüleme ekranına yerleştirin. Yeterli pozlama süresinden sonra, bir lazer tarayıcı kullanarak ekranı tarayın ve dosyayı jel formatında kaydedin. Ardından, jel dosyasını görüntüleme yazılımına yükleyin.Örnek şeritlerin her biri boyunca dikey bir çizgi çizin, böylece şeridin genişliğinin çoğunu kaplar ve sinyalin düzensiz olabileceği bantların kenarlarını hariç tutun. Her şeritteki sayıları görselleştirmek için analiz'e tıklayın ve ardından grafik oluştur'a tıklayın. Her şeritten yüklü ve yüksüz tRNA'yı temsil eden iki tepe noktasını manuel olarak tanımlayın.Bundan sonra, her zirveden sayımlar almak için analize ve ardından alan raporuna tıklayın. Son olarak, iki zirvenin her birinin altındaki alanı kaydedin. Metin protokolünde açıklandığı gibi tRNA seviyelerini hesaplayın.Bu yöntem, arginin açlığımız öncesinde ve sırasında çeşitli tRNA'ların ve E.Coli nf915'in bolluğunu ölçmek için kullanıldı. Farklı tRNA probları ile hibritleştirilmiş kuzey arsasında, yüklü tRNA'yı temsil eden bantlar ile yüksüz tRNA'yı temsil eden bantlar arasında net bir ayrım vardır. Her şerit boyunca radyasyon profili, görüntüleme yazılımı kullanılarak kuzey lekelerinden elde edildi.Her şeritten gelen radyasyon sinyali, her biri lekeden izole edilerek ölçüldü. Tek bir şeritten gelen sinyalin nicelleştirilmesini temsil eden bir grafik, iki tepe noktasını gösterir. Sol tepe aminoasillenmiş tRNA'dan ve sağ tepe deasillenmiş tRNA'dan gelir.Her zirvenin altındaki alan, daha fazla analiz için dışa aktarılır. Kuzey blotundan gelen bantların nicelleştirilmesi, test edilen tüm tRNA türlerinin nispi bolluğunun, amino asit açlığı sırasında hızlı ve önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Öte yandan, arginin kabul eden tRNA'nın tRNA şarj seviyeleri, arginin uzaklaştırıldıktan sonra hızla düştü ve daha sonra açlık döneminde hafifçe arttı.Bununla birlikte, diğer tRNA'ların şarj seviyeleri açlıktan sonra hafifçe arttı ve daha sonra neredeyse açlık öncesi seviyelere düştü. Bu videoyu izledikten sonra, RNA'yı tRNA şarjının ve bolluğunun ölçülebileceği şekilde nasıl saflaştıracağınızı ve normalizasyon için spike-in hücrelerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür boyunca, RNA'nın hidrolizini önlemek için RNA'yı soğuk ve asidik tutmayı unutmamak önemlidir.

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz tüm tRNAs göreceli aminoacylation düzeylerini belirlemek için mikroarray analizi için bir yöntem...

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

Kaynak: Stenum, T. S. ve diğerleri. Escherichia coli'de transfer RNA'larının bolluğu ve şarj seviyelerinin nicelendirilmesi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, E. coli'de transfer RNA'larının şarj seviyelerini tespit etmek ve karşılaştırmak için jel elektroforezi ve kuzey blotlama kullanımını göstermektedir; aminoasillenmiş ve deasillenmiş formları ayırarak karşılaştırılır.

E. coli'de tRNA şarj seviyelerini tespit etmek için jel elektroforezi ve kuzey blotlama ile

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Bu protokol, mRNA sentezi ve bozulmasının in vivo kinetiklerini ölçmek için yerinde hibridizasyonda (smFISH) tek moleküllü floresan uygulamasını açıklar.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Bu protokol, pks+ Escherichia coli farelerinin inflamatuar olmayan koşullarda kolonileşmesi için gerekli adımları, ayrıca kolonizasyonun doğrulanması ve dışkıda pks+ E. coli genişlemesinin değerlendirilmesi için invaziv olmayan yöntemleri tanımlar.

Murine pks+ Escherichia coli ile İltihap Olmayan Koşullarda Kolonizasyon

Öğrenin, Escherichia coli'de transfer RNA şarj seviyelerini miktar olarak nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, farklı büyüme koşullarında RNA dinamiklerini karşılaştırmalı analiz etmeyi sağlar.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Daha fazla video keşfet