Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Bu deneyin genel amacı, Escherichia coli'deki transfer RNA'larının bolluğunu ve şarj seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, tRNA şarj seviyelerinin farklı büyüme durumlarında nasıl değiştiği gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, RNA seviyelerinin, hücrelerdeki RNA'nın bileşimini büyük ölçüde değiştiren büyüme durumları arasında bile kantitatif olarak karşılaştırılabilmesidir.

Bu deneye, metin protokolüne göre deneysel ve spike-in E.coli kültürlerini büyüterek başlayın. Spike-in kültürünü 37 santigrat derecede büyütürken, 160 RPM'de sallayın. Spike-in kültürü yaklaşık 0.1'lik bir OD436'ya ulaştığında, IPTG ekleyerek tRNA hücresi C'nin ekspresyonunu indükleyin.

Kültürü, yaklaşık 0,5'lik bir OD436'ya ulaşana kadar büyütün. Ardından, tüm numuneler hasat edilene kadar kültürü buza taşıyın. Bundan sonra, 37 santigrat derecelik bir su banyosunda her numune için dört mililitre% 10 TCA içeren 100 mililitrelik kapaklı bir kültür şişesini önceden ısıtın.

Deney kültürlerinin OD436'sını hücre hasadından hemen önce ölçün ve kaydedin. Daha sonra, dört mililitre kültürü önceden ısıtılmış bir TCA içeren şişeye aktarın. Numuneyi, şişeyi beş saniye boyunca döndürerek elle karıştırın, bu, tRNA'ların şarj seviyelerini koruyarak tüm enzimatik aktiviteleri hemen devre dışı bırakacaktır.

Tüm numuneler toplandığında, her numuneye %5 oranında ani giriş yapan hücreler ekleyin. Ayrıca, metin protokolünde açıklandığı gibi yalnızca spike-in hücrelerinden oluşan bir kontrol numunesi hazırlayın. RNA ekstraksiyonunu başlatmak için, kontroller de dahil olmak üzere her numuneden sekiz mililitreyi buzla soğutulmuş bir santrifüj tüpüne dökün.

Numuneleri 9, 500 x G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkardıktan sonra, peleti 10 milimimolar EDTA içeren 0.3 mililitre soğuk sodyum asetat içinde tekrar süspanse edin. Her numuneyi soğuk 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve peleti yeniden süspanse etmek için kullanılan tamponla dengelenmiş 0.3 mililitre fenol ekleyin.

Ardından, her numuneyi her seferinde 15 saniye boyunca 10 kez girdaplayın. Numuneleri soğuk tutmak için her girdap arasında sıfır santigrat derecede en az bir dakika ile. Daha sonra, numuneleri 20.000 x G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Üst veya su yüzeyini yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Su yüzeyine 0.3 mililitre soğuk fenol ekleyin ve numuneleri daha önce tarif edildiği gibi her biri 15 saniye olmak üzere dört kez girdaplayın. Ardından, numuneleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 x G'de santrifüjleyin.

Su yüzeyini yeni bir soğuk 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.5 hacim soğuk% 96 etanol ekleyin. Ardından, RNA'yı çökeltmek için tüpleri bir saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri 20.000 x G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, RNA peletine dikkatlice bir mililitre soğuk %70 etanol ekleyin ve onu rahatsız etmemeye dikkat edin. Etanol ile yıkamak için tüpü bir kez hafifçe ters çevirin. Son olarak, 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 x G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı tamamen çıkarın ve etanol tamamen çıkana kadar peleti havayla kurutun. 1 milimolar EDTA içeren 20 mikrolitre soğuk sodyum asetatta, peleti yeniden süspanse etmek için kuvvetlice girdap. Elektroforezi başlatmak için, her numunenin dört mikrolitresini altı mikrolitre yükleme tamponu ile karıştırın.

Numuneleri, kontroller dahil olmak üzere, sekiz molar ureal ve 0.1 molar sodyum asetat tamponu içeren 0.4 milimetre kalınlığında 6.5 poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Daha sonra, bromofenol mavisi boya jelin dibine ulaşana kadar yaklaşık 20 saat boyunca dört santigrat derecede jelin santimetresi başına 10 voltta elektroforezi çalıştırarak RNA'yı ayırın. İki cam plakayı, jel bunlardan birinde kalacak şekilde dikkatlice ayırın.

Lekeleme için ksilen siyanol boyasından jel alanını ve bromofenol boyasına doğru 20 santimetre aşağı doğru kullanın. İstenilen lekeleme alanının boyutuna göre ince bir filtre kağıdı parçası kesin. Filtre kağıdını, jelin lekeleme için kullanılacak kısmının üzerine yerleştirin.

Jelin filtre kağıdı ile kaplanmamış kısımlarını kesin ve atın. Ardından jeli cam plakadan dikkatlice kaldırmak için filtre kağıdını kullanın. Jelin üzerine pozitif yüklü bir naylon membran yerleştirin ve 90 dakika boyunca 20 voltta transfer tamponunda elektroblot yapın.

UV ışığı kullanarak RNA'yı zara çapraz bağlayarak bitirin. Daha sonra, çapraz bağlı zarı bir hibridizasyon tüpüne yerleştirin ve altı mililitre hibridizasyon çözeltisi ekleyin. Membranı önceden hibritlemek için tüpü bir saat boyunca 42 santigrat derecede döndürün.

Daha sonra, beş asal ve P32 ile etiketlenmiş 30 tepe molar radyoaktif oligo DNA probu ekleyin. Membranı prob ile gece boyunca 42 santigrat derecede inkübe etmek için döndürün. İnkübasyondan sonra, probu çıkarmak için tek kullanımlık 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Daha sonra, zarı hibridizasyon tüpünde iki kez, oda sıcaklığında 15 mililitre yıkama solüsyonunda hızlı bir şekilde yıkayın. Membranı düz plastik bir kaba koyun, yıkama solüsyonu ile örtün ve kapağı kapatın. Membranı oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin.

Solüsyonu değiştirin ve tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde edene kadar yıkamaya devam edin. Probun tRNA'ya hibritlendiği alandan gelen radyasyonu boş bir alandan gelen radyasyonla karşılaştırarak sinyal-gürültü oranını elde etmek için bir geiger muller tüpü kullanın. Bundan sonra, zarı streç filmle sıkıca sarın ve kaynak yaparak hava geçirmez şekilde kapatın.

Bu zarı bir fosfor görüntüleme ekranına yerleştirin. Yeterli pozlama süresinden sonra, bir lazer tarayıcı kullanarak ekranı tarayın ve dosyayı jel formatında kaydedin. Ardından, jel dosyasını görüntüleme yazılımına yükleyin.

Örnek şeritlerin her biri boyunca dikey bir çizgi çizin, böylece şeridin genişliğinin çoğunu kaplar ve sinyalin düzensiz olabileceği bantların kenarlarını hariç tutun. Her şeritteki sayıları görselleştirmek için analiz'e tıklayın ve ardından grafik oluştur'a tıklayın. Her şeritten yüklü ve yüksüz tRNA'yı temsil eden iki tepe noktasını manuel olarak tanımlayın.

Bundan sonra, her zirveden sayımlar almak için analize ve ardından alan raporuna tıklayın. Son olarak, iki zirvenin her birinin altındaki alanı kaydedin. Metin protokolünde açıklandığı gibi tRNA seviyelerini hesaplayın.

Bu yöntem, arginin açlığımız öncesinde ve sırasında çeşitli tRNA'ların ve E.Coli nf915'in bolluğunu ölçmek için kullanıldı. Farklı tRNA probları ile hibritleştirilmiş kuzey arsasında, yüklü tRNA'yı temsil eden bantlar ile yüksüz tRNA'yı temsil eden bantlar arasında net bir ayrım vardır. Her şerit boyunca radyasyon profili, görüntüleme yazılımı kullanılarak kuzey lekelerinden elde edildi.

Her şeritten gelen radyasyon sinyali, her biri lekeden izole edilerek ölçüldü. Tek bir şeritten gelen sinyalin nicelleştirilmesini temsil eden bir grafik, iki tepe noktasını gösterir. Sol tepe aminoasillenmiş tRNA'dan ve sağ tepe deasillenmiş tRNA'dan gelir.

Her zirvenin altındaki alan, daha fazla analiz için dışa aktarılır. Kuzey blotundan gelen bantların nicelleştirilmesi, test edilen tüm tRNA türlerinin nispi bolluğunun, amino asit açlığı sırasında hızlı ve önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Öte yandan, arginin kabul eden tRNA'nın tRNA şarj seviyeleri, arginin uzaklaştırıldıktan sonra hızla düştü ve daha sonra açlık döneminde hafifçe arttı.

Bununla birlikte, diğer tRNA'ların şarj seviyeleri açlıktan sonra hafifçe arttı ve daha sonra neredeyse açlık öncesi seviyelere düştü. Bu videoyu izledikten sonra, RNA'yı tRNA şarjının ve bolluğunun ölçülebileceği şekilde nasıl saflaştıracağınızı ve normalizasyon için spike-in hücrelerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür boyunca, RNA'nın hidrolizini önlemek için RNA'yı soğuk ve asidik tutmayı unutmamak önemlidir.