Name: Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin lazer mikroirradyasyon ile basit ve kompleks DNA hasarını in vivo hücresel yanıtları incelemek için. Bu yöntem onarım faktörü dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Akira Yasui Tohoku Üniversitesi, Japonya için GFP-NTH1 ifade Plazmid ve Dr Eros Lazzerini Denchi Scripps Araştırma Enstitüsü, La Jolla, Kaliforniya TRF2-YFP ve EGFP-53BP11220-1711 ifade plazmid için teşekkür ederiz. Bu eser Hava Kuvvetleri Office bilimsel araştırma (FA9550-04-1-0101) ve Beckman lazer Enstitüsü A.ş. Vakfı (için M.W.B), Ford Vakfı Bursu ve NSF MCB-1615701 ve CRCC Bilimleri (için B.A.S), ulusal Akademisi tarafından desteklenmiştir CRR-17-426665 (için K. Y.).

Yazarlar ifşa gerek yok.

Lazer microirradiation DDR araştırma için kullanmanın yararları şunlardır:
1. bu farklı teşvik için uygun ve DNA'ın tutarları basit kırılmalara karmaşık DNA hasar zarar ve algılamak için farklı onarım faktörler DNA, siteleri lazer ışınlama parametreleri ayarlayarak zarar. Hasar birden çok kez aynı hücre çekirdeği içinde trans etkileri ( şekil 3) olduğu gibi değerlendirmek için mümkündür.
2. önemli, hasar siteleri ve başka bir y...

Vivo DNA hasarı sinyal de anlaşılmadı mı Vivo, DNA Histon ve diğer faktörler formu Kromatin iplikler için complexed olduğunu. Düzenleme Kromatin yapısı, DNA metabolizması için büyük önem taşımaktadır. Örneğin, Histon değişken H2AX mutasyona uğramış ataksi-Telanjiektazi (ATM) ve aşağıdaki iki iplikçikli (DSB) indüksiyon tatili ve yerleştirme bir site için diğer sağlamak olarak DSB hasar sinyal güçlendirme için önemli diğer kinazlar tarafından fosforile etkenler. Hasar sinyal ve onarım yolu seçimi yayılan görünür eleştirel yerel Kromatin yapısı hasar siteleri1tarafından etkilendiği için. Faktörler, Histon chaperones ve enzimler değiştirme Histon remodeling Kromatin birkaç siteleri zarar için gerçekten işe ve DDR yönetmelikte Kromatin önemini vurgulayarak verimli DNA tamiri için önemlidir ve2 onarım , 3 , 4. Ayrıca, kümeleme veya yeniden konumlandırma hasar sitesi Maya ve drosophila5,6,7,8, gen loci relocalization anımsatan gözlenmiştir gerçekliğimizin bölme gen Yönetmeliği9,10ile ilişkili. Fare ve insan hücreleri son araştırmaları Ayrıca seferberlik hangi etkileri sadakat ve yol seçim11,12onarmak DSB sitelerin saptandı. Bu DDR/onarım da yakından nükleer mimarisi, üst düzey Kromatin organizasyon ve kromozom ile hücre çekirdeği dinamiklerini bağlantılı olabilir ki olasılığını yükseltir. Böylece, DDR çalışma ve onarma işlemlerinde canlı hücrede endojen nükleer çevre bağlamında kısa ve uzun vadeli sonuçları DNA hasarı anlamak için yüksek çözünürlüklü yöntemleri geliştirmek için önemlidir.
Ölçüde ve hasar türünü ölçme ve Protein derleme hasar sitesinde düzenleyen PAR polimeraz (PARP) kritik rolü PARP1 hızla DNA onarım13' te kritik bir rol oynamaktadır DNA hasarının aktif bir DNA nick sensör olduğunu. PARP1 x-ışını onarmak çapraz tamamlayan baz eksizyon tamir (BER) kolaylaştırmak için 1 ile birlikte (XRCC1) çalışması için Aslında düşündüm fakat DSB onarım14dahil olmak üzere diğer DNA onarım yolları rolü son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya koyuyor. PARP1 kullandığı Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD+) ADP-ribosylate için bir substrat olarak kendisi de dahil olmak üzere birden çok hedef proteinler aktif. PARP inhibitörleri olarak umut verici tedavi ilaçlar kanser için ortaya çıktı gibi bu enzim ve diğer aile üyeleri son yıllarda çok dikkat çekmiştir. PARP inhibitörleri başlangıçta meme kanser geni (BRCA1) etkili olduğu bulundu rağmen-mutasyona meme kanseri hücreleri, şimdi kanıt etkileri ajanlar/ışınlama karşı zarar DNA ile birlikte mono - ve kombinasyonu tedaviler için bir bolluk olduğunu Kanser için BRCA115,16,17,18,19,20sınırlı değildir mutasyonlar ile geniş bir yelpazede.
Moleküler seviyede PARP etkinleştirme yerel Kromatin yapısı hasar sitelerdeki organize kritik rol oynamak için gösterildi. Kromatin modifikasyon enzimleri alımı PAR-bağımlı DSB onarım kolaylaştırır ve baskıları yolu seçimler, PAR değişiklik hasar sitelerdeki önemli iskele rolü düşündüren onarmak. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 biz son zamanlarda gösterdi p53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) dışlanması zararlardan siteleri homolog olmayan endjoining () 53BP1 bağlı hyperactivation için alternatif bir açıklama sağlayan PAR 32tarafından NHEJ) tarafından PARP onarım inhibitörü ve DSB PARP önemini vurgulayarak yolu seçim33,34. Onarım faaliyetin birden fazla DNA'ın PARylates ve etkileri doğrudan PARP1 de14faktörler.
Lazer Microirradiation DDR/onarım Vivo içinde çalışmak için bir araç olarak kullanarak Alt mikron değişiklikler üzerinde bireysel kromozomlar üretmek için lazer microirradiation ilk 196935 içinde açıklanan ve ayrıntılı olarak 198136gözden. Birkaç yıl sonra lazer microirradiation, hücre çekirdeği tanımlanmış submicrometer bölgede, DNA hasar ikna etmek için gösterildi ve işe alım veya DNA lezyonlar içinde vivo çeşitli faktörlerin değişiklikleri incelemek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. bu yöntem farklı ışınlama kaynaklı foci (IRIF) oluşturmaz bu faktörlerin tespiti hasar siteleri39,42, sağlar. Kromatin yapısal değişiklikler hasar siteleri hem çekirdeği geri kalanında kronolojik zamanmekansal dinamiklerini incelemek mümkündür. Biz dikkatle farklı lazer sistemleri tarafından indüklenen DDR'lar göre ve giriş yetkileri DNA hasar türünü ve microirradiation koşulları32,43,44, arasındaki ilişki değerlendirmek için 45. Anormal işe alım kalıpları 53BP1 ve telomeric bağlayıcı faktör 2 (TRF2) lazer kaynaklı hasar46 "fizyolojik olmayan" doğası için yinelenen endişe için temel sağlanan önceki lazer hasar çalışmaları, gözlendi tekrar ,47,48,49. Bu belirgin farklılıklar şimdi fark PARP tarafından açıklanabilir hangi indüklenen zarar32karmaşıklığını ve miktarını ölçer sinyal bulduk. Biz doğruladı: 1) lazer-microirradiated hücreleri (yüksek giriş güç ışınlama) sonra bile Interphase içinde bir hasar denetim noktası denetim bağlı şekilde tutuklandı ve geçerli kalır (en az en fazla 48 saat)32,50; ve 2) onarım faktör işe alım/değişiklikler sadakatle bu geleneksel DNA zararlı ajanlar ile tedavi ve DSB indüksiyon ile endonucleases32,39,42tarafından, gözlenen özetlemek 44,50,51,52. Bu sonuçlar güçlü lazer zarar indüklenen hücresel yanıt eğitimi fizyolojik alaka destek.

<table><tbody><tr><td>Ti: Safir NIR darbeli femtosaniye lazer Mira-900</td><td>Tutarlı Inc.</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M 63X</td><td></td></tr><tr><td>/1.4 NA objektif</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Rotasyon Aşaması&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Sistemi</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Gaz İnkübasyon Sistemi</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Güç ve Enerji Ölçer (RoHS)</td> <td>Uyumlu</td><td>FieldMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Dijital CCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Lazer Tarama Mikroskopları</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Izgaralı Tabaklar&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 böbrek epitel hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Bağımsız Ortam&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>İleri MEM&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12492-013</td><td>L-Glutamin,% 4 FBS</td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td> ile desteklenmiş <td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Timidin ve nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>serum free media&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Azaltılmış Serum Besiyeri)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cycolbutance pirimidin dimer (CPD) (fare)</td><td>Kamiya Biyomedikal Şirketi</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (fare)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (tavşan)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (tavşan)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR polimerler (fare)</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (tavşan)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (fare)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (fare)</td><td>Kamiya Biyomedikal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Tavşan)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (kohezin tespiti için)</td><td>Yokomori (KY) laboratuvarında</td><td></td><td></td>üretilen</tr><tr><td>Anti-Rad51 (Tavşan)</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (fare)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oksiguanin&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Tavşan)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>KY laboratuvarında</td><td></td> oluşturuldu <td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-hCAPG (Tavşan)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (kondensin tespiti için)</td><td>KY laboratuvarında</td><td></td> üretilen, <td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Fare Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 kararlı hücre hattı&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>KY laboratuvarında</td><td></td> oluşturuldu <td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>KY laboratuvarında üretilen</td> <td>GFP-NEIL2 kararlı hücre hattı</td><td>ref 54</td>KY laboratuvarında <td></td></tr><tr><td></td><td>üretilen</td><td>GFP-NTH1 kararlı hücre hattı</td><td>ref 32</td></tr><tr><td>KY laboratuvarında</td><td></td><td></td>üretilen<td>GFP-SMC1 plazmidi</td></tr><tr><td>KY laboratuvarında</td><td></td><td></td>üretilen<td>GFP-Ku plazmidi</td></tr><tr><td>Anti-MDC1 (tavşan)</td><td>&nbsp; Novus Biyolojikler</td><td>NB100 ve ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (tavşan)</td><td>&nbsp; Kırlangıç</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1 (1220-1711) Berns laboratuvarında üretilen PtK2 kararlı hücre hattı</td><td>ref 32</td>TRF2-YFP <td>Berns laboratuvarında</td><td></td></tr><tr><td></td><td>üretilen</td><td>PtK2 kararlı hücre hattı</td><td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PARG inhibitörü</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; PKcs inhibitörü ve nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>ATM inhibitörü KU55933</td> <td>ve nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Teknolojisi</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>ELEKTRON MİKROSKOPİSİ SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr> <tr><td>Miktar Bir 1-D Analiz Yazılımı Sürümü 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>Görüntü Analiz Programı</td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td></td><td>elektronik tablo programı</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>deterjan</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) 10X kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>1X&nbsp'ye seyreltin;</td></tr></tbody></table>

vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık dna hasarı incelemek için lazer microirradiation

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA hasarı genom bütünlüğünün korunması için önemlidir hücredeki belirli sinyal ve onarım yanıt neden olmaktadır. Lazer microirradiation DNA hasarı yanıt (DDR) vivoaraştırmak için değerli bir deneysel araç oldu. Hücre çekirdeği submicrometer bölgede sınırlı lazer kaynaklı hasara cevaben makromoleküllerin dynamics gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü tek hücreli analiz sağlar. Ancak, çeşitli lazer koşullar indüklenen zarar türleri farklılıkları takdir olmadan kullanılmaktadır. Sonuç olarak, çoğu zaman hasar doğası değildir belirgin tutarsızlıkları işe alım veya değişiklik profillerindeki neden karakterize veya kontrollü, iyi. Biz farklı ışınlama koşulları (örneğin, farklı dalga boylarında gibi farklı giriş (irradiances) güçlerin femtosecond (fs) yakın kızılötesi (Nur) lazer) farklı DDR ve onarım protein derlemeler indüklenen gösterdi. Bu üretilen DNA hasar türünü yansıtır. Bu protokolü nasıl farklı tutarlarda indüksiyon ve kolayca Bankası ve crosslinking zararlar, fark Poli (ADP-riboz) (PAR) sinyal, algılama tarafından takip edilebilir DNA hasarı karmaşıklığı titrasyon lazer giriş güç sağlar açıklar ve yol özgü onarım faktör derlemeler hasar sitelerde. Bir kez hasar koşulları belirlenir, farklı zarar karmaşıklık ve diferansiyel hasar sinyal etkileri yanı sıra ilgi herhangi bir faktör üzerinde ters yönde factor(s) tükenmesi araştırmak mümkündür.

Stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade PtK2 hücreleri kullanarak, lazer giriş gücü titrasyon onların işe alım (şekil 1)32için en uygun koşul belirlemek için gerçekleştirilmiştir.
Yüksek giriş güç lazer hasar siteler, önemli CPD (genellikle ultraviyole (UV) hasar tarafından oluşturulan crosslinking hasar), özellikle baz hasarı tanır GFP-NTH1 DNA glycosylase yanı sıra kümeleme gözlendi. Buna ek olarak, daha yüksek XRCC1 ve ...

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Bu protokolün genel amacı, DNA hasar sinyallemesini ve onarım faktörü oluşumunu in vivo olarak incelemek için basit zincir kırılmaları ve kompleks hasarlar dahil olmak üzere farklı DNA hasarı türlerini indüklemek amacıyla lazer mikroiradyasyonun nasıl kullanılacağını açıklamaktır. 1960'lar ve 70'lerde, arkamda görebileceğiniz bir mikroskop aracılığıyla bir lazer ışınını odakladık ve bir kromozomun küçük bir bölgesine hasar vermeyi başardık. Hücre bölündü, hayatta kaldı ve biz bunun nedenini anlayamadık.40 yıl sonra, bugün DNA onarımını seçici olarak incelemek için bu yöntemi kullanıyoruz ve bugün göreceğiniz şey de bu olacak. Bu yöntem, DNA hasarının nasıl tanındığı ve işlendiği ile hasar sinyalinin hücre içinde nasıl yayıldığı gibi DNA onarımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Lazer mikro-iradyasyon, hücre çekirdeği içindeki birkaç mikrometrelik bir bölgeyle sınırlandırılmış DNA hasarına yanıt olarak makromoleküler dinamiklerin gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü ve tek hücre düzeyinde analiz edilmesine olanak tanır.Buna rağmen, çeşitli lazer koşulları, oluşturulan hasar türleri arasındaki farklar gözetilmeden kullanılmıştır ve bu durum hücresel yanıtlarda, faktörlerin hücreye çağrılmasında ve modifikasyonlarda tutarsızlıklara yol açmıştır. HeLa hücrelerinde floresan işaretli proteinlerin ekspresyonu için, birinci günde, 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna 0,5 mL kültür ortamı içerisinde 6 ila 8 x 10⁴ hücre ekleyin. Ardından plakayı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.İkinci günde, floresan işaretli bir DNA onarım faktörünü kodlayan 0,3 µg memeli ekspresyon plazmid DNA'sını 25 µL serumsuz kültür ortamında seyrelterek lipozom aracılı DNA transfeksiyonunu gerçekleştirin. Burada, çift zincir kırıkları hasarı için GFP ile birleştirilmiş 53BP1 hasar bölgesi hedefleme domenini veya baz hasarı için GFP ile birleştirilmiş DNA glikozilaz NTH1'i kullanıyoruz. Başka bir 1,5 mL tüpte, 1 µL lipozom bazlı DNA transfeksiyon reaktifini 25 µL serumsuz kültür ortamında seyreltin; ardından iki tüpün içeriğini, yani seyreltilmiş DNA ile transfeksiyon reaktifini birbirine karıştırın ve DNA-lipid komplekslerinin oluşması için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Hücreleri bir kez 0.5 mililitre kültür ortamı ile durulayın, ardından ortamı uzaklaştırın ve hücrelere 0.5 mililitre taze kültür ortamı ekleyin. DNA-lipid komplekslerini hücrelere ekleyin ve plakayı birkaç kez sallayarak nazikçe karıştırın. Ardından hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.Dört ila altı saat sonra, kültür ortamını hücrelerden uzaklaştırın ve 300 µL %0,5 Trypsin-EDTA ekleyin. Çözeltiyi uzaklaştırın, ardından 200 µL Trypsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 °C'de üç ila dört dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrıldığını onayladıktan sonra, 800 µL kültür ortamı ekleyin ve hücre kümelerini dağıtmak için nazikçe pipetleyerek hücreleri yeniden süspande edin.Hücre süspansiyonunu, ızgaralı bir lam lameli bulunan 35 milimetrelik bir kültür kabına aktarın ve son hacim iki mililitre olacak şekilde kültür medyumu ekleyin. 48 saat sonra, hücreler %30 ila %60 konfluens seviyesine ulaşacak, floresan protein ekspres edecek ve lazer hasarı indüksiyonu için hazır hale gelecektir. NIR lazerini açın ve lazer sisteminin kullanımdan önce bir saat boyunca ısınmasını sağlayın.Hücrelerin bulunduğu bir kabı, karbondioksit ve nem kontrolüne izin veren bir bölmede, 37 °C'ye ısıtılmış bir sahne üzerine yerleştirin. Floresan işaretli proteinlerin canlı hücre analizi için, yüksek büyütmeli bir yağ daldırma objektifi ve işarete göre uygun bir floresan filtre kombinasyonu kullanın. Benzer floresan protein ekspresyonuna sahip hücreleri arayın.Floresans ölçümlerindeki hücreler arası değişkenliği azaltmak için ekspresyonu çok zayıf veya çok güçlü olan hücrelerden kaçının. Konfokal mikroskopi için, 100x 1.3 sayısal açıklıklı yağ daldırmalı objektif lens ve hücre çekirdeği içindeki doğrusal izleri hedeflemek için yazılımın bleach fonksiyonunu kullanın. Diğer ayarları değiştirmeden lazer iletim yüzdesini %5'e ayarlayın.Ardından, görüntünün merkezine bir hücre yerleştirin. İlgi alanına tıklayın ve fareyi kullanarak çekirdek içinde yaklaşık 50 x 4 piksel boyutunda bir çizgi veya kutu çizin. Çekirdek zarına veya nukleollere temas etmekten kaçının.Ardından, DNA hasarını başlatmak için bleach düğmesine tıklayın. Burada, GFP-53BP1 ve GFP-NTH1'in pikyleme düzeyleri arasındaki fark belirgindir. Konfokal mikroskop ile canlı hücrelerin kantitatif floresan analizini gerçekleştirmek için 1x büyütme ve GFP FITC için bir argon lazer kullanın.Çözünürlüğü 512 x 512 piksel, tarama hızını beş ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için hızlı tarama için bir veya birden fazla tarama üzerinden ortalama almak için iki veya daha fazla olarak ayarlayın. Ardından görüntüleri yakalayın. Hasar indüksiyonu için bleach ROY'yi çizin, ardından edinilen Time Series alt menüsünü seçin, sayıyı 20 ve döngü gecikmesini 30 saniye olarak ayarlayın.İlk taramadan sonra bir kez bleach seçeneğini belirleyin ve ardından start B'ye tıklayın. Bu durumda, ilk görüntü hasar indüksiyonundan hemen önce alınır ve ardından 30 saniyelik aralıklarla 19 ek görüntü daha alınır. Burada, GFP-NTH1'in hasar bölgelerine hızla ve geçici olarak toplandığı, buna karşın GFP-53BP1'in yavaşça biriktiği ve hasar bölgelerinde kalıcı olduğu görülmektedir. Bazı onarım faktörleri, hücre döngüsüne özgü bir şekilde hasar bölgelerine toplanabilir.Hasar indüksiyonu için G1 fazındaki hücreleri belirlemek amacıyla; ters bir mikroskop altında, 10x objektif ve 10x oküler lensler kullanarak, hafifçe yükselmiş ve yuvarlak yapıda olan metafaz hücrelerini tanımlayın. Izgaralı lam üzerindeki metafaz hücrelerinin konumunu kaydetmek için görüntüler alın. Üç ila dört saat sonra, hücre bölünmesinin gerçekleştiğini ve kaydedilen konumda hasar indüksiyonuna hazır iki kız hücrenin oluştuğunu doğrulayın.SG2 fazı hücrelerini hazırlamak için çift timidin bloklama protokolü uygulayın. Senkronizasyon verimliliğini DNA profillemesi ve/veya hasar bölgelerinde Rad51 tespiti ile doğrulayın. Yüksek giriş güçlü lazer hasarında, CPD UV hasarının ve baz hasarını spesifik olarak tanıyan GFP-NTH1 DNA glikozilazın kümelenmesi, düşük giriş gücüne kıyasla daha net gözlemlenmiştir.Ek olarak, tek ve çift zincir kırılmalarındaki artışı yansıtan ve böylece kompleks DNA hasarının oluştuğunu gösteren daha yüksek XRCC1 ve CtIP seviyeleri gözlemlenmiştir. Burada gösterildiği üzere, lazer giriş gücündeki varyasyon, hasar sinyalizasyonunda değişikliklere yol açmaktadır. PARP1, hasar bölgelerindeki hedef proteinlerin poli ADP-ribozilasyonunu veya PAR'ını aracılar ki bu durum yüksek giriş güçlü lazer tarafından önemli ölçüde, düşük lazer gücü tarafından ise sadece zayıf bir şekilde indüklenir.53BP1, düşük giriş gücüyle oluşan hasar bölgelerine yönlendirilirken, yüksek giriş gücüyle oluşan hasar bölgelerine yönlendirilmemektedir. İlginç bir şekilde, düşük giriş gücüyle oluşan hasara yönlendirme, aynı hücre çekirdeğinde ikinci bir yüksek giriş gücüyle oluşan hasarın varlığıyla baskılanmıştır. Bu inhibisyon, PARP inhibitörü ile hafifletilmiştir.Aksine, PAR'ı yıkan PARP inhibitörü, PAR sinyalini artırmış ve düşük giriş gücündeki hasar bölgelerinde bile 53BP1 alımını etkili bir şekilde baskılamıştır. Bu durum, 53BP1 alımını belirleyenin hasarın doğası değil, PARP sinyalleşmesi olduğunu göstermektedir. Bu, lazer titrasyonunun, DNA hasarının miktarını ve karmaşıklığını ölçen PARP1'in farklı aktivasyonlarını ortaya çıkardığı ve hasar bölgesinin erişilebilirliğini kontrol ettiği bir örnektir.Bu teknik bir kez kavrandığında; hücre hazırlığı, lazer sistemi kurulumu, DNA hasarı indüksiyonu, canlı veya immünosessiz hücrelerin görüntülenmesi ve veri analizi dahil olmak üzere yaklaşık beş günde tamamlanabilir. Hücre senkronizasyonu veya zaman maliyeti analizi yapıldığında bu süreç daha uzun sürebilir. Bu prosedürü uygularken, lazer giriş gücünün titrasyonunun, aynı lazer sisteminde bile, özellikle sistem yeniden hizalandıktan sonra zamanla sapabileceğini unutmamak önemlidir; bu nedenle onarım faktörü seçilme paternini periyodik olarak kontrol etmek gereklidir.Bu prosedürün ardından, sonuçların lazere özgü artefaktlardan kaynaklanmadığını doğrulamak amacıyla; ışınlama analizi, kimyasal ajanlar veya endonükleaz ekspresyonu gibi diğer DNA hasarı yöntemlerinden elde edilen sonuçlar gerçekleştirilebilir ve karşılaştırılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, DNA onarımı alanındaki araştırmacıların nükleer kromatin açısından DNA hasar yanıtını keşfetmelerine ve DNA hasarının tanınması, işlenmesi ve sinyalleşmesine yönelik yeni faktörleri ve yolakları tanımlamalarına ön ayak olmuştur.

laser-microirradiation-to-study-vivo-cellular-responses-to-simple

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Bu protokol, lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteini alımını ölçmek gibi aşağı akış mikroskopi çalışmaları için S faz hücrelerini verimli bir şekilde tanımlamak için invaziv olmayan bir yöntemi açıklar.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Hedeflenen DNA hasarı, DNA'ya zarar veren bir ajanın tripleks oluşturan bir oligonükleotite (TFO) bağlanmasıyla elde edilebilir. Modifiye TFO'lar kullanılarak, DNA hasarına özgü protein ilişkisi ve DNA topolojisi modifikasyonu, burada açıklanan modifiye kromatin immünopresipitasyon testleri ve DNA süper sarma testlerinin kullanılmasıyla insan hücrelerinde incelenebilir.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Bitkilerin modifikasyonu için mevcut yöntemlerin uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada önerilen yeni peptit türevi teknoloji, eksojen protein veya genlerin bozulmamış bitkilerin istenen hücre içi bölmelerine sokulmasında hem basitlik hem de verimlilik vaat ediyor.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

Burada, fizyolojik oksijen koşulları sırasında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan translasyon başlatma faktörlerini analiz etmek için insan hücre kültürü protokollerini sunuyoruz. Bu yöntem, Agaroz bağlantılı bir m7GTP başlık analoğu kullanır ve kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için uygundur.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Öğrenin lazer mikroirradyasyon ile basit ve kompleks DNA hasarını in vivo hücresel yanıtları incelemek için. Bu yöntem onarım faktörü dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etmenizi sağlar.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

Daha fazla video keşfet