Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Çoklu foton zaman atlamalı görüntülemenin genel amacı, göçmen hücre popülasyonlarının yüksek çözünürlüklü üç boyutlu gerçek zamanlı görüntülerini yakalamaktır. Bu yöntem, farklı hücre popülasyonlarının göç yollarının haritalanması gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin geleneksel konfokal mikroskopiye göre ana avantajı, çoklu foton lazerlerin daha derin doku penetrasyonuna ve azalmış fototoksisiteye sahip olmasıdır.

Bu, daha kalın dokularda kullanılabilirliği artırır ve daha uzun süre görüntü elde edilmesine izin verir. Saat 15:00 ile 21:00 arasında embriyo toplama için kurulum yapmak için üreme tanklarını birleştirin ve bunları ters ozmoz veya RO suyu ile doldurun.

Bölünmüş tankın karşı taraflarına en fazla üç dişi ve üç erkek aktarın. Ertesi sabah, vivaryumda ışıklar açıldıktan kısa bir süre sonra bölücüyü çıkarın. 20 dakika boyunca veya yeterli sayıda embriyo üretilene kadar rahatsız edilmeden çiftleşmeye izin verin.

Embriyolar üreme tankının dibinde olacaktır. Yumurtalar görüldüğünde, oluklu iç tankı balıkla birlikte kaldırın ve hızlı bir şekilde RO suyuyla dolu temiz, sağlam bir dış tanka yerleştirin. Dış tanktan yumurtaları toplamak için bir yumurta toplama süzgeci kullanın ve yumurtaları 30 mililitre 1X embriyo ortamı içeren Petri kaplarına aktarın.

Toplanan yumurtaları 28,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Transgenik embriyolar için, döllenmeden 24 saat sonra veya HPF'de, ölü yumurtaları çıkarın ve embriyoların gelişim aşamasını değerlendirin. Forseps kullanarak, GFP'yi ifade eden üç ila dört embriyodan koryonları çıkarın.

Standart 460 ila 490 nanometre bant geçiren uyarma filtresine sahip bir diseksiyon floresan stereo mikroskobu altında, GFP pozitif embriyoları tarayın. Bu embriyoları 30 mililitre taze 1X embriyo ortamı içeren ayrı bir Petri kabına aktarın. 20 HPF'den sonra, pigmentasyonu inhibe etmek için taranmış ve dekoryonlanmış GFP pozitif embriyoları% 0.003 PTU çözeltisine yerleştirin.

Nöral krest ve nöroepitel gelişimi üzerinde olumsuz etkileri olabileceğinden tedaviye daha erken başlamaktan kaçının. 20 mL 1x embriyo ortamına 0.4 gram LowMelt Agaroz tozu ekleyin. Karışımı bir ila iki dakika veya çözelti berraklaşana ve tüm parçacıklar çözülene kadar ısıtın.

Depolama için yaklaşık 1 mL Agaroz solüsyonunu taze 1.5 mL santrifüj tüplerine alın. Açık banyo haznesini kurmak için, açık banyo haznesinin tabanına az miktarda yüksek vakumlu gres koyun. Tabana dairesel bir cam kapak kayışı yerleştirin ve açık banyo odasının üst kısmını sıkı olana kadar tabana vidalayın.

Yaklaşık 500-700 mikrolitre %2 Agaroz solüsyonunu, taban yaklaşık 3/4 saniye dolana kadar açık banyo odasına pipetleyin. Agarozun tamamen polimerize olmadan hafifçe soğumasını sağlamak için 30 saniye bekleyin ve ardından tek bir embriyoyu tabanın merkezine aktarın. Floresan stereo mikroskop altında, embriyoyu yönlendirmek için 10 mikrolitrelik bir mikro pipet ucu kullanın ve embriyo ortamı eklendiğinde uçup gitmemesi için Agarozun dibine yakın bir yere yerleştirin.

Kritik bir adım, embriyonun Agaroz'da doğru şekilde konumlandırıldığından emin olmaktır. Bu deneylerde embriyoyu yanal olarak yönlendiriyoruz ancak embriyo aynı zamanda sırt ve ventral bölgelere odaklanacak şekilde de konumlandırılabiliyor. Agaroz sertleşene kadar embriyoyu izleyin ve yeniden konumlandırın.

Ardından, monte edilmiş açık hazneyi hızlandırılmış embriyo ortamı ile tamamen doldurmak için bir transfer pipeti kullanın. Tüm kurulumu mikroskop sahnesine yerleştirdikten sonra, metin protokolüne göre, embriyoyu bulmak için beş kez objektifi kullanın. Daha sonra sahneyi manuel olarak en yüksek konuma kaldırın ve embriyoyu mikroskop aralığının ortasına yerleştirmek için ince odağı kullanın.

Sahneyi manuel olarak indirin ve beş zaman hedefini 25 zaman suya daldırma hedefine değiştirin. Embriyoyu tekrar odak noktasına getirmek için sahneyi dikkatlice yükseltin. Yazılımda, Z derinliği boyunca XY düzleminde zaman veya T aralıklarla birden fazla görüntü elde etmek için XYTZ moduna tıklayın.Z-yığınını sınırlayacak ilgi alanındaki odak derinliğini bulmak için epifloresan veya parlak alan görünümünü kullanın.

Bu deneyler için, gözün yan kenarı z-yığınının başlangıcıdır. Buraya odaklandığınızda, yazılımda başlat düğmesine tıklayın. Z yığınının sonu olan embriyonun orta çizgisine odaklandıktan sonra sonlandır düğmesine tıklayın.

Kritik bir adım, Z adımının ilgi alanını kapsadığından emin olmaktır. Bizim durumumuzda, gözün genişliğini lateral kenarlardan medial kenarlara kadar yakalamak istiyoruz. Çekim süresini ve görüntüleme frekansını ayarlamak için menüye tıklayın.

Florun4 yeterli şekilde geri kazanılması ve embriyonun hayatta kalması için, lazer gücü açıkken z-yığını alımı ile lazer gücü kapalıyken iyileşme süresi arasında en az bir ila üç oranına izin verin. Embriyo iyileşmesi için uygun zaman ile, belirlenen pencerede z-yığınları arasındaki süreyi ayarlayın. Ardından, uygun pencerede deneme için toplam süreyi ayarlayın.

Şimdi, lazer ayarlarında son ayarlamaları yapmak için canlı görüntü ayarını açın. Floresan görüntüsünü optimize etmek için yazılım içinde lazer iletimini, kazancı ve ofset kaydırma çubuklarını ayarlayın. Ayrıca, deneyin uzunluğuna, embriyonun beklenen büyümesine vb. bağlı olarak embriyonun yönünü gerektiği gibi ayarlayın.

İlgi alanının, deney süresi boyunca çerçeve içinde kaldığından emin olun. Hızlandırılmış çekim sırasında, epifloresan ışık kaynağını kapatın, sahneyi arka plan ışığına karşı koruma için yeterli olan lazer güvenlik kutusuyla kapatın, ardından başlat düğmesine basın. Her 8-12 saatte bir hızlandırılmış embriyo ortamı ile doldurmak için lazer güvenlik kutusundaki sürgülü kapılardan açık banyo odasına erişin.

Görüntüleme alımını takiben, dosyaları görüntü işleme yazılımında açın, doğru görüntü serisini vurgulayın. Yazılımda, işlem menüsünü seçin, 3D evrişim gidermeye tıklayın ve her bir z-yığınını çözmek için uygulayın. Tek tek tif dosyalarını video işleme yazılımına aktarın, ardından tüm tif dosyalarını seçin ve bunları video düzenleyiciye sürükleyin.

Videodaki her görüntünün uzunluğunu 0,1 saniye olarak ayarlayın. Son olarak, videoyu bir mov veya mp4 dosyası olarak dışa aktarın. Burada çoklu foton floresan görüntüleme ile görülen, transgenik sox10:EGFP ve foxd3:GFP zebrabalığı hatlarında kraniyal yüz yapılarına ve gözün ön segmentine yol açan kraniyal nöral krest hücrelerinin göç modelleridir.

12 ila 30 hpf arasındaki Sox 10 pozitif nöral krest hücreleri, nöral tüpün kenarından kraniyal yüz bölgesine göç eder. Prosensefalon ve mezensefalondan gelen hücreler, perioküler mezensini doldurmak için gelişmekte olan göze dorsal ve ventral olarak göç eder. Burada belirtildiği gibi, sox10 pozitif hücreler frontal nazal süreci oluşturur.

Eşkenar dörtgenden gelen nöral krest hücreleri ventral olarak göç eder ve faringeal kemerlere yol açar. 30 ila 60 hpf arasındaki foxd3 pozitif nöral krest hücrelerinin hızlandırılmış görüntülemesi, bu hücrelerin optik kap ile yüzey ektodermi arasında göç ettiğini ve okla işaretlenmiş oküler fissür ve iris stromasını oluşturan yıldız işareti ile işaretlenmiş lensin etrafında birleştiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik baştan sona düzgün bir şekilde uygulanırsa dört gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, yüksek miktarda floresan içeren embriyoları seçmeyi unutmamak önemlidir. Yazılımı kurmak başlangıçta zor olabilir, ancak parametreler belirlendikten sonra, ek değişiklikler genellikle minimum düzeydedir. Bu videoyu izledikten sonra, embriyodaki göç eden hücreleri görüntülemek için çoklu fotonlu hızlandırılmış mikroskopinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.