Name: İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Keşfedin insan monosit kemotaksisinin in vitro ve in vivo izlenmesi için nicel yöntemleri. Bu protokoller, immünoloji araştırmalarında hücre göçü dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Bernard L. Schwartz Program tarafından Rockefeller Üniversitesi, Robertson terapötik geliştirme Fonu, Rockefeller Üniversitesi ve Sackler Merkezi'nde hekim bilim adamları için Biyomedikal ve beslenme araştırmaları için desteklenen Rockefeller Üniversitesi.

tüm yordamları Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır &#39; s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza.
 1. In Vitro kemotaksisi <ol><li>kültür THP-1 hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve 4-(2-hydroxyethyl) -1 ile 6 ' Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640)- piperazineethanesulfonic asit (HEPES; 25 mM) (tamamlamak medya), 0.5-1.0 x 10 6 hücre/mL arasında yoğunluk bakımı.</li>
	<li>İçinde bir 35 mm hücre kültürü çanağı, koşulu ile calcein acetoxymethyl (calcein-AM; 2.5 µM) veya diğer uygun floresan boya tam medya 37 ° C'de 30 dakika süreyle başına etiket 3.5 x 10 5 THP-1 hücre 
	Not: Boyalar hücre membran geçirgen ve canlı hücre etiketleme ile uyumlu olmalıdır.</li>
	<li>Öncesi sıcak plaka okuyucu 37 ° c 
	Not: sıcaklık kontrolü yanı sıra, alt-okuma işlevi de gereklidir. Geçiş adım 1.10.2 plaka okuyucu miktar için bir alternatif için bkz: hücre.</li>
	<li>Hücreleri etiketleme iken, tahlil plaka ve alt odası hazırlamak.
	<ol><li>Kullanım 24-iyi doku kültürü plakalı iyi başına tek bir şartla. Her koşul nüsha gerçekleştirmek.</li>
		<li>Ekleyin 750 µL Hank, &#39; s 25 mM HEPES ve % 0.1 sığır serum albümin ile (BSA) 24-şey plakasına arabelleğe Buffered tuz solüsyonu (HBSS). Bu Bazal denetim koşulu olarak hizmet vermektedir.
		<ol><li>Kullanımı diğer kuyular karşılaştırıcı koşullar, her zaman toplam 750 µL adlı alt Kamara hacmindeki sürdürmek için. 
			Not: Bu örnekte, insan monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) kemotaksisi 7 için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
			<ol><li>Araya reaktif karışımı ile birleştirerek 25 mM HEPES ile HBSS, BSA (% 0,1) ve MCP-1 (75 ng/mL). Yetişkin sığır serum kullanın (% 2.7 v / v) MCP-1 ek bir olumlu denetim olarak. 
				Not: Kemokin ve Kemokin konsantrasyon kemotaktik ekseni altında eğitim bağlı olacaktır. Liyofilize MCP-1 50 μg/mL nihai bir konsantrasyon ile hisse senedi bir çözüm sağlamak için BSA (%0.1) ile distile suda resuspended. Bunun için çalışan bir çözüm olarak 10 μg/mL suda seyreltilmiş. Bu çözümün 5.6 μL alt odasına ekleyin.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Alt chambers bileşimi tamamlandıktan sonra her şey sekmeler ekleme plaka çentikler ile hizalamak sağlanması, gözenekli bir INSERT yerleştirin. 
		Not: için ekler uygun gözenek boyutu seçin. 3 mikron gözenek boyutunu monosit ve lenfositler için iyi bir performans sergiliyor. Bazı hücre tipleri ve/veya Kemokin sistemleri bir matris kaplı yüzey en iyi geçiş için gerekebilir. Örneğin, THP-1 monosit kemotaksisi MCP-1 doğru ölçmek için fibronektin veya ekler kolajen kaplı önerilir. Nefelometri için plaka okuyucu için ekleme, polietilen tereftalat gibi bir ışık impermeant kaplama sigara geçiş olarak algılanmasını önlemek için olması gerekir hücrelerin üst odası 8.</li>
	</ol></li> <li>Hücreler ile calcein-AM 30 dk için kuluçka sonra hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak. 1000 x g 2 dakika süreyle santrifüj hücreleri kontrol edin calcein-AM ( şekil 1) alımını onaylamak için hücreleri.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant çıkarın. Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 etiketli hücreleri yıkayın. Santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
	<li>Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 hücrelerde resuspend. Say hücreleri ve böylece hücreleri 1.0-1.5 x 10 6 hücre/mL nihai bir konsantrasyon, ses seviyesini.</li>
	<li>Hücre süspansiyon Ekle (üst Kamara) içine dağıtmak 250 μL.</li>
	Sonra tüm üst odaları doldurulmuş, yavaşça plaka kaldırın ve alt geçiş ve algılama ile girişime neden olabilir hava kabarcıkları varlığı için kontrol edin <li>. Bir kabarcık kaldırmak için ilk önce Ekle yeniden konumlandırma kaldırmayı deneyin. İşlem başarısız olursa, kabarcık ponksiyon ve ekleme yeniden konumlandırmak için 27 G iğne kullanın.</li>
	<li>Plaka Önceden ısıtılmış 37 ° C plaka okuyucuya yerleştirin.
	<ol><li>Edinme Floresans okuma 1-3 dk aralıklarla alttan. Calcein-AM kullanırken, Floresans 485 uyarma ve emisyon dalga boylarında ayarla nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Hücre türü ve Kemokin sistemine bağlı olarak, kemotaksis genellikle 1-4 h ( şekil 2A) üzerinden ortaya çıkar.</li>
		<li>Sürekli ölçümler alternatif olarak plaka okuyucu kullanarak görüntü bir ters floresan mikroskop ( şekil 2B) uyarma ve ışık algılama yeteneğine sahip 485 kullanarak wells nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Düşük bir büyütme alt ucun çoğunluğu yakalamak için kullanın. Hücreleri ImageJ veya benzer yazılım 9 görüntülerle işleyerek ölçmek.</li>
	</ol></li></ol> 2. Evlat edinen Transfer, fare lenfosit <ol><li>donör hücreleri hazırlanması <ol><li>Anesthetize 8-12 hafta-bir Buharlaştırıcı kullanarak isoflurane anestezi (% 1-3) ile eski C57BL/6J erkek donör fareler. Toe-çimdik tarafından uygun anestezi derinliği onaylayın.</li>
		<li>, Sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Bir ensizyon bir neşter ile yapmak ve dalak üst sol Periton boşluğu bulun. Bütün dalak tüketim ve buz üzerinde tam medya (%10 FBS ve 25 mM HEPES RPMI; 1 mL/dalak) yerleştirin. İmzalat donör hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi.</li>
		<li>Komple medya (1 mL /spleen) bir tek hücre süspansiyon ve transfer 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak içine grind dalak doku 40 µm naylon mesh hafifçe ile.</li>
		<li>Amonyum klorür potasyum (ACK) lizis eklemek 4 hacimleri tampon ve eritrositler koşullar için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2 min için 1000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Eritrositler Pelet içinde kalırsanız, ACK lizis arabellekte resuspend, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya, santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>2-5 x 10 7 hücre/mL bir konsantrasyon, komple medya hücrelerde resuspend, daha sonra hücre süspansiyon hücre artıkları kaldırmak için 40 µm naylon mesh ile süzün.</li>
		5-chloromethylfluorescein diacetate (son konsantrasyonu 2 mikron) 10 gibi sonraki fiksasyon üzerine korunur ve <li>Etiket 1 x 10 7 hücreler/alıcı fare ile floresan boya ile uyumlu hücreleri canlı . 30 dakika süreyle 37 ° C'de kuluçkaya 
		Not: birden fazla hücre nüfus izlemek için ek hücre popülasyonlarının ile diğer floresan boyalar kullanın. Donör hücreleri bir kısmını 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoil ile şekillendirebilir etiketlenir) amino) tetramethylrhodamine (son konsantrasyonu 2 mikron) 11.</li>
		<li>Eklemek 4 birimleri ile HBSS takıma 25 mM HEPES, sonra 2 dk ve atma süpernatant için 1000 x g, santrifüj. Pelet HEPES 25 mM için 1 x 10 8 hücre/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma HBSS resuspend.
		<ol><li>Birden fazla floresan boya kullanıyorsanız, hemen önce enjeksiyon kadar ayrılmış hücre popülasyonlarının devam.</li>
			<li>Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi tazminat için bir sabitleştirici çözüm (1 mL) her renk hücrelerinin transfer.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Lenfositler transfer <ol><li>8-12 hafta anestezi-eski C57BL/6J erkek alıcı fareler bir Buharlaştırıcı; kullanarak isoflurane (% 1-3) ile ayak-çimdik tarafından anestezi derinliği onaylayın. Hayvan veteriner merhem uygulamak &#39; kurutma önlemek için gözleri.</li>
		<li>Kısaca girdap donör hücreleri (1 s) ve 1 mL enjeksiyon şırınga ile 27 G, iğne, 0.5 differentially etiketli hücre popülasyonlarının, varsa birleştirerek aktarmak.
		<ol><li>Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi Analizi için sabitleştirici çözüm (1 mL) karışık hücrelerinin transfer.</li>
		</ol></li> <li>Yüzükoyun sígara donör hayvanlar koyun. Biraz çıkıntı gözün neden göze dorsal cilt hafif Kaudal basınç uygulamak.</li>
		<li>İğne da doğrudan ve donör hücre süspansiyon, 100 µL retro-orbitally her alıcı fare enjekte. Hücre-de var enjekte kuyruk damar yolu ile.</li>
		<li>Yavaş yavaş enjeksiyon iğne geri çekilin ve fare kurtarma kafeste tek başına yerleştirin. Bilinci yerine geldi kadar hayvan izlemek; bir kez tam olarak kurtarılan dönüş hayvan sosyal konut.</li>
	</ol></li> <li>Toplama ve analiz <ol><li>sonra 1 h, isoflurane anestezi (1-%3) ile alıcı fareler bir Buharlaştırıcı kullanarak anestezi; anestezi derinliği toe-çimdik tarafından onaylamak. Dalak (ya da diğer doku ilgi) hasat (Adım 2.1.2.) her alıcı fare ve komple medya (1 mL/alıcı) yerine. İmzalat hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi. 
		Not: Doku hasat öncesinde daha uzun aralıklarla en az 24 h ile doku birikimi artacak</li>
		<li>Eziyet dalak doku 40 µm naylon mesh ile yavaşça içine bir tek hücre süspansiyon ve transfer için 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak komple medya.</li>
		ACK lizis <li>eklemek 4 hacimleri tampon ve oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya. 1000 x g oda sıcaklığında 2 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Boyama resuspend hücreler arabellek (fosfat tamponlu tuz %1 ile desteklenmiş FBS). Hücreleri saymak ve 3 x 10 7 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için ayarlayın. Bir 96-kuyu alt plaka yuvarlak hücre süspansiyon, 100 µL transfer.</li>
		<li>Leke hücreler için istediğiniz işaretçileri (malzemeleri tablo görmek) göre Akış Sitometresi Analizi için. Fluorophore-Birleşik antikorlar (malzemeleri tablo görmek) karşı istediğiniz işaretleyicileri ekleyin ve 20 dakika içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de kuluçkaya. 100 µL eklemek arabellek boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Pelet 200 µL resuspend tampon boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Resuspend 125 µL boyama içinde Pelet tampon ve Standart prosedürler kullanarak Akış Sitometresi kullanarak örnekleri elde. 
		Not: Yeşil boya 488 nm lazer tarafından heyecan ve emisyon 505 ve 530/30 dikroik filtreleriyle algılanır. Turuncu boya tarafından 561 heyecanlı nm ve emisyon 582/15 dikroik filtre tarafından algılandı.
		<ol><li>Kaydedilmiş hücreleri floresan her boya için telafi etmek için 2.1.8.2 gelen. 
			Not: boncuk tabanlı tazminat eşleme uyarma ve emisyon spectra etiketleme boyalar, fluorophores ile kullanılması olarak suboptimal tazminat sonuçlanır.</li>
			<li>Adım 2.2.2.1 kaydedilen giriş hücrelerden doğru oranını belirlemek için birden fazla etiketli nüfus ( şekil 3) kullanıyorsanız giriş hücresi differentially etiketli kullanın. Etiketlenmemiş hücrelere ( şekil 4) etiketli doku belirli geçiş oranı üzerinde dayalı hesaplamak.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2186747">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li>
<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Miktar bağışıklık hücre göç basit kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hızlı içinde in vitro ve in vivodeneyleri. Serum tarafından bir MCP-1 degrade ve büyütme karşısında insan monosit vitro kemotaksisi göstermektedir. Vivo, donör fare splenocytes differentially etiketli ve evlat edinen transferi alıcı hayvanlardan ele geçmiştir.
Bir plaka okuyucu kullanarak birkaç zaman Puan örnekleme avantajı vardır (her 30 olarak sık s) ve geçiş Nefelometri otomatikleştir...

Güçlü bağışıklık uygun şekilde karşılık vermek için yaralanma, enfeksiyon ve self-tolerance oluşturmak için hücre tiplerinin sayısız karmaşık zamansal ve mekansal koordinasyon gerektirir. Birkaç düzine Kemokin reseptörleri ve onların karşılık gelen ligandlar keşfettim ve belirli hücreleri tarafından karakterize sağlayan moleküler mekanizmaları belirli bir zamanda belirli bir doku yönlendirilebilir. Böylece, kemotaksis ve geçiş eğitim İmmünoloji araştırma vazgeçilmez bir bileşendir. Nitekim, açıklanan vitro tahlil son zamanlarda T-hücrelerin kemotaksis C-C kemokinler 19. ve 213doğru hızlandırır kemotaktik kofaktör tanımlamak için bir tarama aracı olarak kullanıldı. Yöntem tanımlamak burada amacı olan bağışıklık hücre kemotaksisi vitro ve içinde vivonicel Değerlendirmeler izin vermek için.
Boyden (hücre göç ve işgali) odası tahlil hücre geçiş4,5değerlendirmek için ucuz, tekrarlanabilir ve hızlı bir yöntemdir. Standart tahlil üst odası hücrelerle tohumlari ve içine hücrelerin göç daha düşük bir odası den gözenekli bir ekleme tarafından ayrılmış. İstediğiniz saatte ekleme alt geçiş hücreleri sabit ve Nefelometri için ışık mikroskobu ile lekeli. Ancak, bu tür ölçümleri veri toplama dinamik veri toplama engellemektedir tek bir bitiş noktası için sınırlamak ve geniş en iyi duruma getirme analizi için en uygun zaman noktayı belirlemek için gerektirebilir. Burada, çeşitli uyarlamalar gerçek zamanlı, nicel ve çoğaltılmış ölçümlerinin kemotaksisi vitroizin açıklanmıştır.
Vivo çalışmalar için işlevsel bir bitiş noktası kullanılır, yani belirli birikimi hücre içinde verilen doku bölme. Önceden etiketli donör hücreleri evlat edinen transferi yoluyla alıcı hayvanların içine tanıtıldı. Bu donör hücreleri daha sonra alıcı doku Hasattan sonra Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir. Ayrıca farklı hücre türleri içinde tek bir alıcı hayvan kaçakçılığı belirlenmesi için izin veren co etiketleme bir stratejidir. Bu yöntem hücre enjeksiyon ve fizyolojik arası hayvan değişkenlik hesaplarında arası hayvan varyasyon ortadan kaldırır.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Uyarma: 485nm, Emisyon: 520nm</td></tr><tr><td>Hücre kültür kabı</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Floroblok Fibronektin Ekle</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Rekombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr> Kalsiyum ve magnezyum içeren <tr><td>yetişkin sığır Serumu</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS; fenol kırmızısı içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 ters floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein hayvan sağlığı</td><td>11695-6776-2</td><td>İzofloran anestezisi</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 40um naylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK parçalama tamponu</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Turuncu CMTMR Boya</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Uyarma: 541nm, Emisyon: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Yeşil CMFDA Boya</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Uyarma: 485nm, Emisyon: 520nm</td></tr><tr><td>5ml şırınga</td><td>BD Şırınga</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB şırınga</td><td>BD Şırınga</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Menekşe 421 anti-fare CD3 Antikor</td><td>Biyoefsane</td><td>100228</td><td>Uyarma: 405nm, Emisyon: 421nm</td></tr><tr><td>Parlak Menekşe 605 anti-fare CD19 Antikor</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Uyarma: 405nm, Emisyon: 603nm</td></tr><tr><td>96 oyuklu yuvarlak alt plaka</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td>Akış sitometresi</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan monosit kemotaksisi vitro ve in vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kemotaksis geçiş boyunca belirli bir kimyasal degrade1değil. Kemokinler hücresel anatomik ve temporal özgüllük2ile ticareti teşvik kemotaktik sitokinler vardır. Kemotaksis lenfositler kritik bir fonksiyonudur ve kantitatif olabilir diğer bağışıklık hücreleri içinde vitrodeğerlendirildi. Bu el yazması Kemotaksis, değerlendirilmesi izin yöntemleri açıklar vitro ve in vivo, hücre satırları ve yerel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri için. Vitro, plaka tabanlı biçimi çeşitli koşullar aynı anda içinde karşılaştırma izin verir gerçek zamanlı, 1-4 h. vitro tahlil koşullar olarak tanıtmak agonistleri ve antagonistleri, manipüle içinde tamamlandı ve su kuyusu aynı derecede kemotaksis rasgele hareket olduğu chemokinesis ayırt etmek. Vivo kaçakçılığı değerlendirmeler için bağışıklık hücreleri birden çok floresan boyalar ile etiketli ve evlat edinen transfer için kullanılan. Fark hücrelerinin etiketleme karma hücre popülasyonlarının böylece varyans azaltmak ve hayvanlar için yeterince güçlü bir deney gerekli sayısını azaltarak aynı hayvan içine sunulmasına olanak sağlar. Az 1 h olarak geçiş içine lenfoid doku oluşur ve birden fazla doku bölmeleri tatmak mümkündür. Akış Sitometresi doku hasat takip birden çok hücre tipleri göçmen kalıpları hızlı ve nicel analiz için sağlar.

Calcein-AM boya kullanırken, hücre görsel muayene etiketi alımı (şekil 1) onaylayın. Otomatik floresan okuma zaman içinde ucun alt üzerine hücreleri transit olarak geçiş izler. Bu veriler, serum (şekil 2A) tarafından bir indüksiyon hücre göç MCP-1 doğru hem de bu yanıt bir büyütme açıkça gösteriyor. Göçmen uyarıcı gücüne bağlı olarak, en az 15 dk önce sinyal artışı bir gecikme yoktur. Floresan sinyal zirve ve sonra yavaş yavaş dü...

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Bu analizlerin genel amaçları, monosit kemotaksisini in vitro ortamda gerçek zamanlı olarak nicelleştirmek ve lenfosit migrasyonunu in vivo olarak takip etmektir. In vitro yöntem, serum faktörlerinin bağışıklık hücresi kemotaksisi üzerindeki etkileri gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. In vitro tekniğinin temel avantajı, gerçek zamanlı olarak kantitatif ve multipleks ölçümlere olanak tanımasıdır.In vivo yöntem, immünoloji alanında belirli hücre tiplerinin alıcı bir hayvan içinde nasıl göç ettiğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. In vivo tekniği, özellikle aynı hayvan içindeki birden fazla hücre tipinin göçünün kantitatif değerlendirmesi için kullanışlıdır. Deneye başlamadan önce, THP-1 hücrelerini 35 milimetrelik bir hücre kültür kabında, tam besiyerinde, 37 °C'de 30 dakika boyunca floresan bir boya ile işaretleyin.Hücreler inkübe olurken, 24 kuyucuklu bir plakanın arka plan ve pozitif kontrol kuyucuklarına 25 millimolar HEPES ve %0,1 BSA ile tamponlanmış 750 microliters HBSS ekleyin. Deney ve pozitif kontrol kuyucuklarına, BSA ile tamamlanmış su içerisinde uygun konsantrasyonda MCP-1 ekleyin. Ardından, insert sekmeler

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu video, bir kan-beyin bariyeri (BBB) endotel modeli boyunca lenfosit transgöçünün deneysel bir araştırmasını göstermektedir. İnsan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin (HBMEC'ler) tek tabakası in vitro olarak üretilir ve lenfositleri içeren periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) monotabakaya eklenir. Hücreler daha sonra lenfosit transgöçüne izin vermek için inkübe edilir ve göç eden hücreler akış sitometrisi kullanılarak ölçülür.

Mikrovasküler Endotel Hücre Tek Tabakası Boyunca Lenfosit Transgrasyonunun İncelenmesi

Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Burada fare modellerinde kan monositlerinin kemotaktik aktivitesini ölçmek, beslenme, farmakolojik ve genetik müdahalelerin kan monositi üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve kan monositlerinden elde edilen makrofajları karakterize etmek için bir protokol sıyoruz. monosit-kemoattractant protein-1 (MCP-1) yüklü bazal membran kaynaklı jel fişleri kullanarak fare modelleri.

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Burada, kemotaktik kompleman C5a gradientinde fare yerleşik periton makrofajlarını görüntülemek için zaman atlamalı, faz-kontrast mikroskobu kullanan yöntemleri açıklıyoruz. Protokoller diğer bağışıklık hücrelerine genişletilebilir.

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Keşfedin insan monosit kemotaksisinin in vitro ve in vivo izlenmesi için nicel yöntemleri. Bu protokoller, immünoloji araştırmalarında hücre göçü dinamiklerini gerçek zamanlı analiz etmeye yardımcı olur.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Daha fazla video keşfet