İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Bu testlerin genel hedefleri, monosit kemotaksisini in vitro olarak gerçek zamanlı olarak ölçmek ve lenfosit göçünü in vivo olarak izlemektir. İn vitro yöntem, serum faktörlerinin bağışıklık hücresi kemotaksisi üzerindeki etkileri gibi immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İn vitro tekniğin temel avantajı, gerçek zamanlı olarak kantitatif ve multipleks ölçümlere izin vermesidir.

İn vivo yöntem, immünoloji alanındaki belirli hücre tiplerinin bir alıcı hayvan içinde nasıl göç ettiğine dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İn vivo teknik, aynı hayvan içinde birden fazla hücre tipinin göçünün kantitatif değerlendirmesi için özellikle yararlıdır. Deneye başlamadan önce, THP-1 hücrelerini 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabında 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca floresan boya ile etiketleyin.

Hücreler inkübe edilirken, 24 oyuklu bir plakanın arka planına ve pozitif kontrol kuyularına 25 milimolar HEPES ve% 0.1 BSA ile tamponlanmış 750 mikrolitre HBSS ekleyin. Deneysel ve pozitif kontrol kuyularına BSA ile takviye edilmiş suya uygun MCP-1 konsantrasyonunu ekleyin. Ve her bir oyuğa gözenekli ekler yerleştirin, eklerin tırnaklarının plakanın çentikleriyle aynı hizada olmasına dikkat edin.

Kabarcıklar floresan ölçümlerini engelleyeceğinden, ekleri yerleştirdikten sonra alt kuyucuklardan herhangi bir kabarcık çıkarmak çok önemlidir. İnkübasyonun sonunda, etiketli hücreleri santrifüjleme ile toplanmaları için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ve boyanın alımını doğrulamak için elde edilen peleti görsel olarak inceleyin.

Daha sonra, süpernatanı dikkatlice vakumla aspire edin ve hücreleri aynı santrifüj koşulları altında 25 milimolar HEPES ile desteklenmiş serumsuz RPMI-1640 ortamında yıkayın. Saymak için peleti HEPES ile taze serum içermeyen ortamda yeniden süspanse edin. Ve hacmi bir ila 1.5 çarpı, 10 ila mililitre başına altı hücre arasındaki son konsantrasyona ayarlayın.

Her kuyucuğun üst odasına 250 mikrolitre hücre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecelik bir plaka okuyucuya yerleştirin. Daha sonra, boya için uygun floresan uyarma ve emisyon dalga boylarında bir ila üç dakikalık aralıklarla alt odaların floresan okumalarını elde edin. Donör hücreleri evlat edinme transferlerine hazırlamak için, önce anestezi uygulanmış bir erkek sekiz ila 12 haftalık C57 siyah altı farenin tüm dalağını, buz üzerinde tam ortam içeren bir hücre kültürü kabında 40 mikrometrelik bir naylon ağ filtreye toplayın.

Bir şırınga pistonunun ucunu kullanarak, dalağı ağ boyunca nazikçe yumuşatın. Tek hücreli bir süspansiyon elde edildiğinde, hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve kırmızı kan hücrelerini tüketmek için dört hacim amonyum klorür potasyum lizis tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti tam ortamda iki ila beş kez mililitre konsantrasyonda 10 ila yedinci hücrelerde yeniden süspanse edin.

Hücre kalıntılarını gidermek için hücreleri yeni bir 40 mikrometre naylon ağdan süzün. Ve alıcı fare başına 10 ila yedi hücreyi bir kez etiketleyin, bu da 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca sonraki fiksasyondan sonra tutulacak canlı hücre uyumlu bir floresan boya ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri HEPES ile takviye edilmiş dört hacim HBSS'de yıkayın.

Ve peleti taze HBSS artı HEPES içinde mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila sekizinci hücreye kadar yeniden süspanse edin. Daha sonra, donör hücreleri kısaca girdaplayın ve bunları 27 gauge 0.5 inçlik bir iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Anestezi uygulanmış sekiz ila 12 haftalık C57 siyah altı alıcı fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve ilk hayvanın gözünün dorsalindeki deriye hafif kaudal basınç uygulayın, bu da göz küresinin hafifçe çıkıntı yapmasına neden olur.

100 mikrolitre donör hücrenin retro-orbital enjeksiyonu için iğneyi medial olarak yönlendirin. Ardından, iğneyi yavaş yavaş geri çekin ve fareyi tam iyileşmeye kadar izleme ile ayrı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Hayvanların uygun şekilde uyuşturulması ve hayvanlar arasında ve deneyler arasında tutarlı hücre iletimini sağlamak için enjeksiyon prosedürünün iyi bir şekilde uygulanmış olması çok önemlidir.

Evlat edinme transferinden 24 saat sonrasına kadar, dalakları alıcı başına bir mililitre tam ortama hasat edin. Ve az önce gösterildiği gibi kırmızı kan hücresi içermeyen tek hücreli bir süspansiyon oluşturun. Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu boyama tamponunda mililitre başına yedi hücre konsantrasyonuna üç kez 10 ila yedi hücreye ayarlayın.

Ve 100 mikrolitre hücreyi, 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın. Standart akış sitometrik analiz protokollerine göre ilgilenilen belirteçler için hücreleri boyayın. Işıktan korunan buz üzerinde 20 dakika sonra, hücreleri 100 mikrolitre boyama tamponunda yıkayın ve ikinci bir santrifüjleme için peletleri 200 mikrolitre taze boyama tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra peleti 125 mikrolitre taze boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre örneklerini standart protokollere göre bir akış sitometresinde analiz edin. Migrasyonu izlemek için otomatik floresan okumaları, serum varlığında artan MCP-1'e doğru hücre göçünün indüksiyonunu açıkça göstermektedir. Göç uyaranının gücüne bağlı olarak, floresan sinyalindeki bir artıştan önce en az 15 dakikalık bir gecikme olur ve hücreler, üst odadan göç eden hücrelerinkinden daha hızlı bir şekilde ekin altından alt odaya çözelti içine geçerken zirve yapabilir ve kademeli olarak azalabilir.

Birden fazla floresan etiketli hücre popülasyonu evlat edinilmiş olarak aktarılırsa, hücre popülasyonlarının karıştırılmasındaki herhangi bir varyansı hesaba katmak için girdi materyali içindeki hücre popülasyonlarının nispi oranını ölçmek önemlidir. Örneğin, bu deneyde, yeşil ve turuncu floresan hücrelerin oranı 0.97'ye bir idi. Trafik işlemi, kurtarılan etiketli hücrelerin sayısının, kurtarılan toplam hücre sayısına bölünmesiyle ölçüldü.

Hayvanlar arasında geri kazanılan hücrelerin sayısında önemli farklılıklar olsa da, herhangi bir hayvan için yeşil ve turuncu floresan hücrelerin oranı tipik olarak yaklaşık olarak eşittir. Bir kez ustalaştıktan sonra, in vitro teknik dört saat içinde tamamlanabilir ve in vivo teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, deney odalarında kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmayı ve evlat edinilen hücrelerin retro-orbital enjeksiyonu sırasında tutarlılık için çaba göstermeyi unutmamak önemlidir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların in vitro ve in vivo olarak kemotaksisi keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir in vitro kemotaksis testinin gerçek zamanlı olarak nasıl yürütüleceğini ve izleneceğini ve doğal lenfositlerin evlat edinme transferleri ve in vivo göçlerini izlemek için nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.