Name: Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Keşfedin çapraz reaksiyonsuz çoklu sandviç immunoassay yöntemini. Bu teknik, kanser araştırmalarında protein biyobelirteçlerinin keşfi ve doğrulanması için kantitatif proteomik alanında önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Rob Sladek mürekkep püskürtmeli gözcü kullanım için teşekkür ederim. Sağlık Araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC), Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü ve Kanada Vakfı için son destek için yenilik (CFI) Kanadalı Enstitüleri üzerinden anıyoruz. DJ teşekkürler bir Kanada araştırma sandalyeden destekler.

1. imalat ve depolanmasını snap cips <ol><li>tek transfer yöntemi ( Şekil 1a) <ol><li>400 µg/mL antikorlar içeren Spot taksi çözümleri ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi % 20 gliserol (PBS) bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) üzerine tahlil slayt ile bağıl nem oranı % 60, bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü 13 (1.2 nL her nokta için) 800 µm Merkezden merkeze boşluğu ile. Slaydı bir köşe göre gözcü güvertede sabit olduğundan emin olun (burada, sol alt köşedeki kullanılmıştır).</li>
		<li>%60 bağıl nem ile 1 h için oda sıcaklığında benekli tahlil slayt kuluçkaya.</li>
		<li>Bir slayt modülü conta 16 kuyu bölmek için tahlil slayt üzerinde 16 bölmeleri ile kelepçe. 80 µL % 0,1 içeren PBS ekleyerek üç kez sürgüyü durulama ara-20 (PBST) her iyi ve titreyen bir shaker, 5 min her zaman üzerinde 450 rpm'de.</li>
		<li>Her şey ve 450 rpm'de 1 h için sallamak için çözümler engelleme eklemek 80 µL.</li>
		<li>Conta kaldırmak ve tahlil slaydı bir akımı azot ile kuru.</li>
		<li>Bir transfer slayt gözcü güvertede düzeltmek ve slayt sol alt köşesinde gözcü güverte karşı sol alt köşesinde itin. Mürekkep püskürtmeli spot hizalama işaretlerini (polistiren mikro-boncuk bir çözüm) oluşan bir dizi ile bu aynı düzeninde kabinler için.</li>
		<li>Kuru hizalama işaretlerini izin. Transfer slayt flip ve belgili tanımlık dip sol köşe karşı sabitleme gözcü güverte üzerine oturtacak.</li>
		<li>20 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve % 1 BSA içeren çözümler lekelenme dAb hazırlayın.</li>
		<li>Gözcü kullanarak &#39; s kamera, resim hizalama işareti bir. Bu resmi bir indirgeme olarak edindiği programa uygulamak ve görüntü tanıma sisteminin en üst sol işareti tanımlamak için mürekkep püskürtmeli gözcü olsun. Onun koordinat dAb dizi ilk spot kullanın. Nokta 8 nL damlacık ile 800 µm Merkezden merkeze aralığını başına.</li>
	</ol></li> <li>Çift Kişilik aktarma yöntemi ( Şekil 1b) <ol><li>sol alt köşedeki karşı mürekkep püskürtmeli gözcü güvertede bir transfer Slayt 1 yerleştirin. Spot 400 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA ile bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü bağıl nem oranı % 60, slayda içeren kabinler Çözümleri (0,4 nL her nokta için ve ~ çapı 200 µm). Merkezden merkeze boşluk 400 µm olabilir.</li>
		<li>Taksi damlacıkları tahlil slayt üzerine aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak transfer slayt ile kaplı bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) tahlil slayt çekin.
		<ol><li>Dönüş tüm altı düğmeleri tarafında ek aparat çekin ve tüm itici açık konumda kilitlemek için 90 derece. Transfer Slayt Slayt tutucu, kabın içinde kırpılmış köşesi sabit pogo PIN bakacak ekleyin. Üç düğme itici altın pogo iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için ilk kümesi açmak.</li>
			<li>Ek aparat ters 4 pogo çivi üzerine oturan nitroselüloz kaplı bir slayt ekleyin. İtici gümüş iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için üç düğme ikinci kümesi açmak.</li>
			<li>Ek aparat hizalama sütunlar ve delik bir hassas konumlandırma için kullanarak slayt kutusunda üst kabuk koyarak kapatın.</li>
			<li>Kapalı ek aparat onun kafes yerleştirin ve kapatma sekmesinde tamamen microarrays uygun basınç uygularken yüz yüze getirmek için aşağı doğru itin. 1 dk. için kapalı tutmak</li>
		</ol></li> <li>Slaytları ayırın. Bağıl nem oranı % 60 ile 1 h için oda sıcaklığında tahlil slayt kuluçkaya. Yıkama, engellemek ve tahlil slayt adımlarda 1.1.3 - 1.1.5 açıklandığı gibi kuru.</li>
		<li>Başka bir transfer slayt mürekkep püskürtmeli gözcü güverte ve sol alt köşedeki karşı itme üzerine koyun. 50 ya da 100 µg/mL (bkz. Tablo 1) antikorları, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA içeren spot dAb çözümleri. Her spot 0,8 olduğundan emin nL ve noktalar arasındaki Merkezden merkeze boşluğu olduğunu 400 µm.</li>
		<li>Tahlil ve transfer slayt saklayın. Mühür nem içeren hava geçirmez bir torbada tahlil ve transfer slaytlar ve -20 ° C dondurucuya koydu.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexed ek fiş ile uzun <ol><li>Al dondurucu tahlil slayttan. Çantayı slayt oda sıcaklığına gelene için 30 dk kapalı bırakın.</li>
	<li>Hazırla 7 uçlu seri seyreltilmiş örnek çözümler proteinlerin % 0.05 içeren PBS spiking tarafından ara-20. 
	Not: Burada, bir 5-fold seyreltme faktörü kullanılır. Başlangıç konsantrasyonları her protein için tablo 1'de listelenen.</li>
	<li>Uygun olarak Prepare örnek çözümler. Örneğin, 4 kez içinde PBST tampon insan serumu sulandırmak.</li>
	<li>16-bölme conta tahlil slayt üzerinde kelepçe.</li>
	<li>Pipetting tarafından bir sütunun 8 wells 7 protein seyreltme çözümleri ve protein-Alerjik PBST arabellek çözüm ile doldurun. Aynı slaytta yer alan diğer 8 Wells örnek çözümler pipette. 
	Not: 80 µL çözümler her birinde uygun olabilir iyi. Daha fazla slayt ek örnekler gerektiğinde ölçmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Örnekleri bir shaker gecede üç kez ile shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman üzerinde PBST 4 ° c yıkama slayt veya oda sıcaklığında 1 h için 450 devirde üzerinde kuluçkaya. Conta kaldırmak ve azot gazı akışı altında slayt kuru.</li>
	<li>Parmak izleri ile transfer slayt dondurucudan almak. Çantayı, oda sıcaklığında 30 dakika kapalı tutun. Ardından, % 60 nem sabitleme boncuk rehidrasyon için 20 dk için içeren slayt kapalı Odası (örneğin boş ipuçları kutu) içinde kuluçkaya.</li>
	<li>Transfer slayt dAb damlacıkları aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak tahlil slayt ile snap. 1.2.2 ek aparat çalışması için bkz.</li>
	<li>Slaytları ayırın. Tahlil slayt % 60 nem sabitleme boncuk 1 h. kelepçe bir 16 yuvası conta ile tahlil slayt içeren bir kapalı odasında kuluçkaya ve 4 kez sürgüyü durulama PBST bir shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman kullanma.</li>
	<li>Pipet 80 µL PBS içinde her kuyuya 2,5 µg/mL streptavidin fluorophore içeren çözümler. Bir shaker 450 devirde üzerinde 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>450 devirde shaker üzerinde slayt 3 kez ile PBST ve bir kez distile su ile durulayın. Conta kaldırmak ve azot gazı kullanarak slayt kuru.</li>
</ol> 3. Slayt tarama ve veri analizi <ol><li>635 nm lazer kullanarak Floresans Mikroarray tarayıcıyla tahlil slayt tarama.</li>
	<li>Bir analiz yazılımı (örneğin dizi-pro Çözümleyicisi) 16 kullanarak her nokta net yoğunluğunu ayıklamak.</li>
	<li>Bir istatistik yazılım kullanarak her protein algılama (lod olarak) sınırını hesaplamak ve protein konsantrasyonları örneklerde belirlemek. 
	Not: Y-kesişim noktası standart cu LOD tanımlanırüç kez standart sapmasını tarafından üç bağımsız deneyleri için artan lezzetli.</li>
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
<li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers%3A+CEA%2C+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li>
<li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li>
<li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-analyte+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li>
<li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera%3A+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li>
<li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li>
<li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays%3A+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li>
<li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-chip+protein+arrays%3A+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%3A+A+Programmable+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li>
<li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Colocalization+Microarray%3A+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li>
<li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688(2015).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li>
<li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li>
<li>Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+%28MetaChip%29+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li>
<li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li>
<li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li>
</ol>

McGill Üniversitesi bir patent başvurusu bu iş Huiyan Li ve David Juncker ile bazı yönleri üzerinde mucitler şikayetçi oldu.

Bu çalışmada, araştırmacılar ile temel deneysel kurulum için çapraz-reactivity ücretsiz multiplex uzun yaygın olarak kullanılabilir duruma getirir bir ek çip teknolojisi sunulmuştur. Varolan antikor microarrays farklı, hiçbir Mikroarray gözcü son kullanıcılar için gereklidir. Hem tek hem de çift transfer yöntemleri gösterdi ve Çift Kişilik transfer affords üstün hizalama doğruluğu aşağı ~ % 98'i lekeli 63 µm14en büyük kayma için 40 mikron. Bir roman ek aparatı elverişli bir konuma sahip bu teknolo...

Birden fazla protein oluşan biyolojik bir panel daha yüksek duyarlılık ve özgüllük kanserleri1,2gibi karmaşık hastalıkların tanısında tek bir biyomarker daha sağlayabilir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) klinik laboratuvarlar bir limit düşük pg/mL plazma, algılama, ama sınırları tahlil3,4,5başına bir hedefe ulaşmada kullanılan altın standart teknoloji olmuştur. Paralel bir tek mikroskop slayt6,7,8bin-in küçültülmüş deneyleri accomodating yürütülen için antikor microarrays geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemin çoğullama yeteneği parmak izleri, karışımı uygulamadan kaynaklanan reaktif tahrik olan ile sınırlıdır ve hedefleri9,10 giderek artan sayıda daha sorunlu hale gelir , 11. Pla ve ark. Sonuçta ortaya çıkan güvenlik açığı bir multiplex sandviç testin hedefleri12numarası N olan 4N(N-1) ölçekler belirttiler.
Antikor microarrays, antikor colocalization Mikroarray olan etkisini azaltmak için (ACM) bizim laboratuvar multiplex sandviç tahlil12için geliştirilmiştir. Yakalama antikorlar (taksi) bir substrat Mikroarray gözcü ile tespit. Sonra engelleme örnekleri yüzeye uygulanır ve sonunda bireysel dAbs taksi-antijen kompleksi aynı noktalar üzerinde gördü. Antikorlar antijenleri arasındaki tüm olan senaryoları ACM ile azaltılabilir ve algılama pg/mL, sınırlarını elde ettik. Ancak, tahlil Protokolü hazırlama ve bir yerinde Mikroarray gözcü yüksek hassasiyetle pahalı ve zaman alıcı hizalama amaç için kullanarak, bu teknoloji içinde geniş uygulama sınırlama deneyler sırasında parmak izleri tespit gerekir diğer laboratuvarlar. Ek çip adında bir el ACM için çapraz-reactivity ücretsiz geliştirilmiştir ve gözcü-Alerjik multiplex sandviç uzun13,14,15. Kabinler ve parmak izleri bir tahlil slayt ve sırasıyla Mikroarray biçiminde bir transfer slayt üzerine önceden tespit ve depolanır. Tahlil sırasında slaytlar alınır ve dAbs Mikroarray aktarılır topluca tahlil slayt sadece birlikte iki fiş şaklatarak. Bir ek aparatı güvenilir reaktif aktarımı için kullanılır. Nispeten büyük antikor Bağlama kapasitesi ile kaplı nitroselüloz slaytlar sıvı damlacıkları emmek için tahlil slaytlar olarak kullanılmış ve böylece reaktif transfer kolaylaştırıcı, ancak, slaytları normal cam slaytlar ve Mikroarray daha daha pahalıdır saydam olmayan slaytlar ile uyumlu tarayıcılar sinyal alımı için ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada, multiplex sandviç immunoassay ek çip ile gerçekleştirme Protokolü göstermektedir. Bir roman ek aparatı Mikroarray Mikroarray daha rahat ve güvenilir reaktif transferi için geliştirilmiştir. Önemlisi, burada reaktif aktarma yöntemi ek çip ile normal cam slaytlar üzerine kurduk. 1024 noktalar başarıyla transfer ve bu teknolojinin en laboratuarlarında kullanımı önemli ölçüde genişleyen bir cam slayt üzerine hizalanmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tableti</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin konjuge Cy5</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Engelleme çözümü: BSA içermeyen StabilGuard Choice Microarray Stabilizatör</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz kaplı slaytlar</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilan kaplı slaytlar</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cihazı</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Mürekkep Püskürtmeli mikrodizi gözcü</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü modül contası</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Nem Stabilizasyon Boncukları</td><td>Parallex BioAstests Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer yazılımı</td><td>Medya Sibernetik</td><td>Sürüm 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikrodizi tarayıcı</td><td>Agilent</td><td>SureScan Mikrodizi Tarayıcı Biyoistatistik</td><td></td></tr><tr><td>yazılımı</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin yakalama antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin proteini</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin saptama antikoru</td><td>R& IL-6</td><td></td>a BAF1097 <td></td>D Sistemleri</tr><tr><td>(bkz. Tablo 1)</td><td>R& D Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b (bakınız Tablo 1)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Çoğaltılmış protein analizi üstün tanılama hassasiyet ve doğruluk için tek proteinler karşılaştırıldığında göstermiştir. Antikor microarrays aynı anda tek bir yonga üzerinde gerçekleştirilen mikro ölçekli uzun binlerce sağlar. Sandviç tahlil biçimi her hedef iki antikorlar ile tespit ederek tahlil özgüllük artırır, ancak böylece çoğullama yeteneklerini sınırlayan reaktifler arasında olan muzdarip. Antikor colocalization Mikroarray (ACM) çoğaltılmış protein çapraz-reactivity ücretsiz algılama için geliştirilmiştir, ancak pahalı bir gözcü yerinde Mikroarray imalat deneyleri sırasında için gerektirir. Bu çalışmada, biz sadece dayama iki fiş birlikte, böylece hiçbir gözcü örnek kuluçka ve algılama antikor (dAbs) sonraki uygulama sırasında gerekli tarafından Mikroarray Mikroarray reaktif aktarır bir ek çip teknolojisi göstermek depolama öncesi benekli slayt, slayt hazırlama tahlil yürütme dissociating. Her iki tek ve Çift Kişilik transfer yöntemleri iki microarrays arasında doğru uyum elde etmek için sunulmaktadır ve slayt imalat yöntemleri açıklanmıştır. Sonuçları gösteriyor ki &#60; 40 mikron hizalama 625 noktalar/cm2bir dizi yoğunluğu ulaşan Çift Kişilik transferi ile elde. 50-plexed immunoassay çoğaltılmış protein analizi ek yongasında kullanılabilirlik göstermek için yapılmıştır. Sınırlar 35 proteinlerin algılama aralığı pg/mL vardır.

Hem tek hem de çift transfer yöntemleri için tahlil yordamı şekil 1' de gösterilen. Tek transfer, kabinler doğrudan tahlil slaytta lekeli ve dAbs kabinler (Şekil 1a) bir ayna model kullanımda üzerine tahlil slayda aktarılır. Tek bir aktarım yordam gereklidir, ancak esas olarak slaytla mürekkep püskürtmeli makas köprüsü (Şekil 2) arasındaki açısal kayma nedeniyle iki microarrays arasında kayma bu yönt...

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

Bu prosedürün genel amacı, reaktifler arasında çapraz reaksiyon olmadan, nokta basımı gerektirmeyen bir yöntemle sandviç immünosayımlar kullanarak çip üzerindeki birden fazla proteini eş zamanlı olarak nicelendirmektir. Bu yöntem, kanserde aday protein biyobelirteçlerin keşfi ve doğrulanması gibi kantitatif proteomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, çoklu sandviç analizlerinde antikorlar ve antijen arasında çapraz reaksiyonun olmaması ve kullanıcıların karmaşık bir mikroarray nokta basma cihazına ihtiyaç duymamasıdır.Prosedürü, Parallex BioAssays'de bilimsel direktör olan Heidi Larkin gerçekleştirecektir. Tek transfer yöntemi için lamları hazırlamaya başlamak için, yeni bir transfer lamını ink jet mikroarray spotter platformuna sabitleyin. Polistiren mikroboncuk çözeltisi veya %30 glycerol kullanarak, lamın kenarına hizalama işaretlerinden oluşan bir dizi noktalaましょう.Cihaz yazılımını ve spotter kamerasını kullanarak, kalite kontrol için hizalama işaretlerinin fotoğrafını çekin. Ardından, bir ink jet mikro dizi spotter platformunda, transfer slaydının soluna bir nitrocellüloz veya fonksiyonelleştirilmiş cam analiz slaydı sabitleyin. Hizalama işaretlerini kullanarak, 400 µm merkezden merkeze aralıklarla 24 yakalama antikoru çözeltisi dizisi spotlayın.Deney lamını oda sıcaklığında, %60 bağıl nem içeren bir atmosferde bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, dizilerle hizalayarak lama 24 kuyucuklu bir silikon conta takın. Her kuyucuğa, PBS içinde %0,1'lik polisorbat 20 çözeltisinden 80 µL pipetleyin.Slaytı beş dakika boyunca 450 rpm hızda sallayın ve çözeltiyi dökün. Slaytı bu şekilde üç kez yıkayın. Ardından, durulanan her bir kuyuya 80 µL BSA serbest bloklama çözeltisi yükleyin.Slaytı bir saat boyunca 450 rpm hızda sallayın. Ardından solüsyonu boşaltın, silikon contayı çıkarın ve analiz slaytını azot gazı veya bir santrifüj kullanarak kurutun. Analiz slaytını, silika jel veya başka bir kurutucu madde içeren hava sızdırmaz bir torbaya yerleştirip kapatın ve eksi 20 derece Celsius'ta saklayın.Aynı hizalama işaretlerini kullanarak, merkezler arası 400 mikrometre aralıkla, nokta başına 3,2 nanolitre olacak şekilde 24 tespit antikoru çözeltisi dizisi damlatın. Transfer lamını, kurutucu madde içeren sızdırmaz bir poşet içinde eksi 20 derece santigrat sıcaklıkta saklayın. Çift transfer yöntemi için lam hazırlamaya başlamak için, bir transfer lamını inkjet mikro-dizi damlatıcı platformuna sabitleyin.Yakalama antikor çözeltilerinden oluşan 24'lü dizileri, merkezden merkeze 400 micrometers ara boşlukla damlatın. Ardından, pistonları açık konumda kilitlemek için snap düzeneği piston şalterlerini 90 derece döndürün. Yakalama transfer lamını, kırpılmış köşesi sabit pogo pime gelecek şekilde düzeneğe yerleştirin.İlgili piston anahtarlarını 90 derece geri çevirerek pogo pinlerini serbest bırakın. Transfer lamının pogo pinleri tarafından sıkıca tutulduğundan ve sabit hizalama pinleriyle aynı hizada olduğundan emin olun. Ardından, yeni bir nitroselüloz veya fonksiyonelleştirilmiş cam lamı, kaplı tarafı aşağı bakacak şekilde pogo pinlerinin üzerine yerleştirin.Düz pimleri serbest bırakmak için diğer üç şalteri çevirin. Her iki sürgünün de sabit hizalama pimlerine karşı sabitlendiğini doğrulayın. Ardından, sütunun hizalama deliklerine oturduğundan emin olarak üst kabuğu sürgü tutucuya yerleştirin.Kapalı düzeneği çıtçıtlı kafese yerleştirin ve kapatma sekmesini tamamen aşağı bastırın. Düzeneği bir dakika boyunca kapalı tutun. Ardından, düzeneği kafesten çıkarmak için kapatma sekmesini yukarı çekin.Üst kabuğu çıkarın ve analiz ile transfer lamlarını birbirinden ayırın. Analiz lamını bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, lama 24 kuyucuklu bir silikon conta takın ve lamı üç kez yıkayın.Ardından lamı, BSA içermeyen bloklama çözeltisi ile bir saat boyunca çalkalayın. Contayı çıkarın ve analiz lamını bir nitrojen gazı akımı veya santrifüj altında kurutun. Sonrasında, mürekkep püskürtmeli spotter tablasına başka bir transfer lamı sabitleyin.Transfer lamını hazırlamak için, her bir noktaya 3,2 nanolitre gelecek şekilde, merkezden merkeze 400 mikrometre aralıklarla lam üzerine 24'lü diziler halinde saptama antikor çözeltileri damlatın. Saptama transfer lamını -20 °C'de saklayın. İmmünanalize başlamak için, hazırlanmış analiz lamını dondurucudan çıkarın ve kapalı poşeti içinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.PBS içinde %0,05 polysorbate 20 ile proteinlerin yedi seri dilüsyonlu çözeltisini hazırlayın. Aynı tampon çözeltide uygun şekilde dilüye edilmiş örnek çözeltileri hazırlayın. Oda sıcaklığındaki analiz slaydına 24 kuyucuklu bir silikon contayı sabitleyin.Yedi protein dilüsyonunu bir sütundaki sekiz kuyucuktan yedisine yükleyin. %0,05 polisorbat 20 içeren protein içermeyen PBS'yi bu sütunun son kuyucuğuna yükleyin. Örnek çözeltilerini geri kalan kuyucuklara yükleyin.Slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca 450 rpm hızda sallayın. Ardından slaytı üç kez yıkayın. Contayı çıkarın ve slaytı nitrojen gazı akışı altında kurutun.Ardından, deteksiyon antikoru transfer lamının kapalı poşetinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Daha sonra, dizileri yeniden hidrate etmek için lamları bağıl nemi %60 olan kapalı bir bölmede 20 dakika inkübe edin. Deteksiyon transfer lamını snap aparatına yüzü yukarı bakacak şekilde sabitlemek için pogo pinlerini kullanın.Analiz slaytını pogo pinlerinin üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve slaytı düz pinlerle hizalayın. Cihazı kapatın ve tespit antikorlarını analiz slaytına hızlı transfer (snap transfer) yöntemiyle aktarın. Slaytları cihazdan çıkarın ve analiz slaytını bir saat boyunca inkübe edin.24 kuyucuklu silikon contayı lamataçla sabitleyin ve lamataçı üç kez yıkayın. Ardından, her kuyucuğa PBS içinde hazırlanmış 2,5 µg/mL streptavidin fluoro-4 çözeltisinden 80 µL yükleyin. Lamataçı 450 rpm hızda 20 dakika boyunca sallayın.Lamı üç kez PBS içinde %0,1'lik polisorbate 20 çözeltisiyle ve bir kez distile su ile yıkayın. Ardından contayı çıkarın ve lamı kurutun. Lamı floresan bir tarayıcı ile tarayın ve spot yoğunluklarını ölçün.Protein konsantrasyonlarındaki saptama limitlerini belirleyin. İki floresan protein, 16 kuyucuklu bir şablonla çift transfer yöntemi kullanılarak nitrocellüloz kaplı bir lam üzerine ardışık olarak desenlendirilmiştir. İkinci floresan protein transfer edildiğinde herhangi bir çapraz kontaminasyon gözlemlenmemiştir.Noktalar arası mesafesi azaltılmış daha küçük noktalar, yüksek derecede hidrofobik bir yüzeye sahip cam slayta aktarılabilir. Çift transfer yöntemi, dizilerin minimum açısal hizalama hatasıyla sonuçlanmasını sağlamıştır. Çift transfer yöntemi, sandviç assay formatında meme kanseri ile ilişkili proteinlerin 50-plex immünassay analizini gerçekleştirmek için kullanılmıştır.Herhangi bir çapraz reaksiyon gözlemlenmediğinden, her antikor çifti bağımsız olarak optimize edilebildi. Analizlerden hesaplanan standart eğriler, 50 proteinin 35'inin pikogram/mililitre düzeyinde tespit sınırlarına sahip olduğunu gösterdi. Bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra yaklaşık üç saatte tamamlanabilir.Bu teknik, bilim insanlarının mikroarray tabanlı analizler gerçekleştirmesine ve reaktifleri nano damlacıklar halinde sunmasına olanak tanır. Bu prosedürü uygularken, slaytları spotting platformuna ve snap aparatına uygun şekilde sabitlediğinizden emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, çapraz reaksiyon içermeyen çoklu sandviç immün analizler için snap aparatının nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein,...

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Bir ELISA kolayca Luminex xMAP assay dönüştürülebilir ve, çoğullama, çeşitli antikorların avantajları ile tahlil maliyet düşürürken, artan duyarlılık ve dinamik aralığı ile sonuçlanan, optimum bir antikor çifti tanımlamak için eşzamanlı taranabilir.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

Video, çapraz reaktivite içermeyen çoğullanmış sandviç immünolojik testler için çıtçıtlı çip teknolojisinin uygulanmasını göstermektedir. Her biri farklı reaktifler içeren iki mikrodizi slaytını koparmanın basit eylemi, çapraz kontaminasyon olmadan reaktif transferini sağlar ve sandviç immünolojik test kullanılarak birden fazla proteinin tespit edilmesine yardımcı olur.

Çapraz Reaktivitesiz Çoklanmış Sandviç İmmünoassay için Bir Snap Chip Teknolojisi

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Mevcut kıt kaynak ortamında, araştırmacıların çalışmaları daha ucuz, daha hızlı ve daha hassas bir şekilde yürütmelerine olanak tanıyan yeni teknolojiler ortaya çıkıyor. Burada, insanların aynı anda birden fazla çevresel patojene maruz kalmasını ölçmek için boncuk bazlı bir tükürük antikoru multipleks immünolojik testin geliştirilmesini açıklıyoruz.

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

İnsan tüketimine yönelik tatlı su rezervuarlarında siyanobakteriyel toksinlerin varlığı, su yönetimi yetkilileri için büyük bir endişe kaynağıdır. Su kontaminasyonu riskini değerlendirmek için bu makale, bir antikor mikrodizi çipi kullanılarak sıvı ve katı numunelerdeki siyanobakteri suşlarının sahada tespiti için bir protokol açıklamaktadır.

Saptamak için deneysel protokol Siyanobakteri Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

SARS-CoV-2 için nötralize IgG ve IgM antikorlarını aynı anda ölçebilen multipleks serolojik ve antikor nötralizasyon tahlillerinin geliştirilmesi için iki muhabirli okuma sağlayan boncuk bazlı çok katlı tahliller için bir akış analiz sistemi kullanılmıştır.

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Keşfedin çapraz reaksiyonsuz çoklu sandviç immunoassay yöntemini. Bu teknik, kanser araştırmalarında protein biyobelirteçlerinin keşfi ve doğrulanması için kantitatif proteomik alanında önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olur.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Daha fazla video keşfet