Transmisyon elektron mikroskobu mikroorganizmaların seri Ultrathin bölümler elde etmek için bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, seri ultra ince kesitleri güvenli ve kolay bir şekilde yapmaktır. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve elektron mikroskobik düzeyde bütün bir hücrenin nicel ve üç boyutlu yapısal bilgilerini sağlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, pahalı bir makine olmadan seri ultra ince kesit alma işleminin yapılabilmesi ve bu yöntemle yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edilebilmesidir.

Bu işleme başlamak için, bir cam slaytın yüzeyini temizleyin. Daha sonra, cam sürgünün yarısını, bir lastik top kullanarak üç vanadan çözeltiyi hava ile bastırarak, Formvar destek film yapım aparatının üst sütununda% 1.5 Formvar çözeltisine batırın. Basıncı azaltmak için üç vanayı açarak ve havayı serbest bırakarak çözeltiyi kolondan boşaltın.

Daha sonra cam sürgünü cihazdan çıkarın ve cam sürgünün yüzeyinde bir film oluşturmak için havada kurutun. Filmin dört kenarını bir tıraş bıçağıyla cam sürgü üzerine kazıyın. Filmin slayttan ayrılmasını kolaylaştırmak için lam üzerine nefes aldıktan sonra, cam slaytı düşük bir yatay açıyla yavaşça suya batırarak filmi yüzdürün.

Ardından, delikli bir alüminyum raf kullanarak Formvar filmini sudan alın. Numune bloğunu ultrasonik bir düzeltme bıçağı ve stereo mikroskop altında bir tıraş bıçağı ile kesmek için, önce bloğun ucunu bir ışık mikroskobu ile gözlemleyerek bloğun yüzeyinde hücreler olduğundan emin olun. Ardından numune bloğunu aynaya monte edin ve aynayı bir düzeltme aşamasına monte edin.

Blokları 0,7 x 1,0 milimetre boyutunda kesin. Epoksi reçine çok sertse, önce ultrasonik bir düzeltme bıçağı kullanarak kutuyu kesin, ardından bloğu bir tıraş bıçağıyla daha da kesin. Kesme yönünü işaretlemek için bir omzunu kesin.

Numune bloğunu mikrotom kullanarak bir elmas bıçakla kesmek için, numune bloğu mandrenini ultra mikrotomun numune tutucusuna yerleştirin. Bloğun yüzeyini bir elmas düzeltme bıçağıyla kesin. Elmas bıçak kenarını numune bloğu yüzüne paralel olarak ayarlayın ve herhangi bir numuneyi kaybetmemek için minimum miktarda numune yüzeyini kesin.

Bıçak aşamasını 30 derece sola çevirerek düzeltme bıçağını kullanarak bloğun sol kenarını kesin. Bu kenar, seri kesitlemede numunenin üst tarafı haline gelir. Ardından, bıçak aşamasını 30 derece sağa döndürerek blok yüzünü numunenin sol kenarından yaklaşık 100 mikron uzunluğunda kesin.

Bu kenar, seri kesitlemede numunenin alt tarafı haline gelir. Düzeltme bıçağını çıkarın ve numune bloğunu saat yönünde 90 derece döndürün. Bıçak aşamasına ultra ince bir kesit bıçağı ayarlayın.

Numune yüzeyini ve bıçak kenarını, numune yüzeyinin büyük bir kısmını kullanarak birbirine paralel bakacak şekilde ayarlayın. Ardından, aynaya ve mikrotomun ayna tutucusuna bant uygulayın ve bandı sınırda kesin. Numune aynasını mikrotomdan çıkarın ve stereo mikroskobun altına yerleştirin.

Numunenin büyük bir kısmını bir tıraş bıçağı ile kesin, seri kesitlerin elde edileceği ince kısmı bırakın Seri kesitleme için kullanılacak numunenin üzerine yaklaşık% 0.5 Neopren çözeltisinin yaklaşık bir mikrolitresini damlatmak için bir Pasteur pipeti kullanarak kesit kenarlarını yapışkan hale getirin. Daha sonra tüm numuneyi Neopren çözeltisi ile kaplayın. Fazla Neopren çözeltisini, numunenin yanına yerleştirilmiş bir parça filtre kağıdı ile hemen emdirin.

Ardından, seri bölümleri almak için üç yarık ızgara hazırlayın. Bunu yapmak için, ızgaraların tutamağını 60 dereceye kadar bükün ve ızgaralara% 0,5 Neopren çözeltisi uygulayın. Daha sonra ızgaraları kızdırma deşarjı ile hidrofilik hale getirin.

Bantlanmış parçaları hizalayarak numune blok aynasını mikrotomun içine aynı konumda geri yerleştirin. Bu, blok yüzünü ve bıçak kenarını birbirine mükemmel şekilde paralel tutar. Ardından bıçağı numuneye yaklaştırın.

Bıçaklı tekneyi su ile doldurduktan sonra, hava akışını önlemek için mikrotomun üzerini plastik bir örtü ile kapatın. Numuneyi 200 nanometrelik bir kesit kalınlığında kesmeye başlayın. İlk bölüm kesildikten sonra, kesit kalınlığını 70 nanometre olarak ayarlayın.

Seri kesit sayısı 20'ye ulaştığında, kesit kalınlığını 10 nanometre olarak ayarlayın. Mikrotom 10 nanometre kalınlığındaki kesitleri kesemediği için yeni bir kesit çıkmaz ve daha önce kesilen kesitler bıçak sırtından ayrılır. Ardından, kesit kalınlığını 60 nanometre olarak ayarlayın.

Bu, 70 nanometre kesitler üretecektir çünkü makine önceki 10 nanometre kalınlığını ekleyecektir. Son olarak, kesit kalınlığını tekrar 70 nanometreye ayarlayın ve 1,8 milimetre uzunluğunda kesitler elde edilene kadar kesmeye devam edin. Seri bölümleri almak için önce bölüm tutma halkasını üçüncü bölüm grubuna yerleştirin.

Ardından su yüzeyi yükseltme halkasını bıçak aşamasına yerleştirin. WSRL'nin halkasını, milini ve kolunu hareket ettirerek seri bölümlerin hemen üzerine yerleştirin. WSRL'nin halkasını su yüzeyine indirin, böylece döngü bölümleri çevreler.

Su yüzeyi yüzey gerilimi ile yükselecek şekilde vidayı aşağı doğru çevirerek halkayı aşağı doğru itin. Bölümü döngünün ortasına taşıyın. Suyun tepesine yerleştirin ve bir saç teli kullanarak bölümün yönünü ayarlayın.

Cımbızla yardım edilen ve su yüzeyine paralel tutulan çıplak yarık bir ızgara ile dokunarak bölüm gruplarını alın. Formvar destek filminin üzerine küçük bir damla su ile birlikte ızgaraları bölümlerle birlikte yerleştirin. Filtre kağıdı kullanarak fazla suyu alın.

Bölümler tamamen kuruduktan sonra, Formvar filmini ızgaraların etrafına yırtın; ve bölümleri taşıyan ızgaraları çıkarın. Boyama tüpünün oluğundaki ızgaraları uygun sırayla ayarlayın ve bölümleri uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyayın. Izgara yarığının uzun eksenini numune tutucu eksenine dik olarak yönlendirerek çoklu numune tutucudaki beş ızgarayı uygun sırayla ayarlayın.

Izgarayı ızgara sabitleyicilerle sabitleyin ve numune tutucuyu transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin. Hedef hücrelerin ve tüm hücre bölümlerinin yüksek büyütme oranıyla fotoğraflarını çekmeye devam edin. Burada, seri kesitler taşıyan beş ızgaranın düşük büyütmeli bir görünümü gösterilmektedir.

Bir ızgara üzerine 18-25 bölüm monte edildi. Bölümlerin birbirine bağlı olduğunu ve aynı kalınlığa sahip olduğunu unutmayın. Perikarion miyogenezinin seri kesitleri burada gösterilmiştir.

Şekil, 67 tam bölümden 12'sini göstermektedir. Bu hücrenin, tek bir nükleoid zarı olan çıplak DNA liflerinden ve bakterilere benzeyen ancak mitokondri içermeyen endosimbiyontlardan oluşan büyük bir nükleoide sahip olduğu bulundu. Böylece, bu organizma prokaryottan ökaryota evrimleşen bir ara yaşam formu gibi görünmektedir.

Burada Escherichia coli'nin seri bölümleri gösterilmiştir. Şekil 12 tam bölümü göstermektedir. İlginç bir şekilde, bu hücrenin 21.700 ribozom içerdiği bulundu.

Bu videoyu izledikten sonra, seri ultra ince kesitlerin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir.