Mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasitesi tahlil ve Ca^{2 +}-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Bu deneyin genel amacı, kalsiyumun neden olduğu mitokondriyal şişmede mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini belirlemektir. Bu yöntem, anormal enerji metabolizması gibi mitokondriyal disfonksiyon çalışmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, çok basit ve etkili olmasıdır.

Başlamak için, 10 santimetrelik hücre kültürü kabı başına yaklaşık üç milyon SH-SY5Y hücresi tohumlayın. Ortamı çıkarın ve hücreleri 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabında yaklaşık bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. 10 santimetrelik hücre kültürü kabına bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve yapışan hücreleri yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe kazıyın.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 50 mikrolitre proteaz inhibitörü stok çözeltisi ile desteklenmiş beş mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu hazırlayın. Süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın.

1.5 mililitrelik tüpü 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, asılı hücreleri bir cam homojenizatör ile buz üzerinde manuel olarak yukarı ve aşağı parçalayın. Homojenatı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından, kalıntıları temizlemek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjlemeden önce süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Süpernatanı yeni bir tüpe aktardıktan sonra, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve pelet içeren mitokondri bir mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın. Daha sonra mitokondriyi çökeltmek için çözeltiyi 14.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Elde edilen mitokondri peleti buz üzerinde tutulmalı ve herhangi bir tahlilden önce pelet hacmine göre 50 ila 100 mikrolitre potasyum klorür ortamında yeniden süspanse edilmelidir.

Son olarak, standart BCA testi ile mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçmek için beş mikrolitre mitokondriyal çözelti kullanın ve bir plaka okuyucu kullanarak OD562'yi ölçün. Potasyum klorür ortamını hazırlayın ve deneyden önce kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boyayı 0.5 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin. Mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini belirlemek için, önce altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 0.5 mikromolar kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boya içeren potasyum klorür ortamında bir mililitre izole mitokondri aktarın.

Mitokondriyi ve kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boyayı, bir dakika boyunca ortam ışığından korunarak oda sıcaklığında altı oyuklu plakada inkübe edin. İnkübasyonun ardından, miligram mitokondriyal protein başına 200 nanomol kalsiyum eklemek için otomatik dağıtım ayarını kullanarak altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna 20 milimolar kalsiyum klorür çözeltisinde dört mikrolitre alikot ekleyin. 506 nanometre uyarma dalga boyu ve 531 nanometre emisyon dalga boyu ile iki dakika boyunca her üç saniyede bir floresan değişikliklerini izlemek için floresan spektrometresini kullanın.

Plaka, yazılım tarafından kontrol edilen okumalar arasında üç saniye boyunca 600 rpm'de sallama ile donatılmıştır. Her oyuğa 20 milimolar kalsiyum klorür çözeltisinden oluşan dört mikrolitrelik bir alikot ekleyin, ardından floresan değişikliklerini her üç saniyede bir iki dakika boyunca izleyin. Kalsiyumun neden olduğu mitokondriyal şişmeyi belirlemek için, potasyum klorür ortamında bir mililitre izole mitokondriyi altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın.

Ardından, mitokondriyal şişmeyi tetiklemek için mitokondriyal proteine 10 mikrolitre 20 milimolar kalsiyum klorür sulu çözeltisi ekleyin. Yazılım tarafından kontrol edilen bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 540 nanometrede 10 dakika boyunca her üç saniyede bir absorbanstaki düşüşü kaydedin. Kalsiyumun neden olduğu mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneğinin bir inhibitörü olan bongkrekic'in veya MPTP'nin, kalsiyumun neden olduğu MPTP açıklığının bir aktivatörü olan atractyloside açma ve boş bir kontrolün mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir.

Bongkrekik tedavideki kapasite, beklendiği gibi atractyloside grubundan çok daha yüksektir. Kalsiyumun neden olduğu bongkrekik, atractylosid'in mitokondriyal şişmesinin temsili sonuçları ve tedavi kontrolü yok burada gösterilmiştir. 540 nanometrede izlenen azalmış absorbans, mitokondriyal şişlikleri gösterir.

Sonuçlar, BKA'nın MPTP açılmasını engelleyebileceğini, ATR'nin ise MPTP açılmasını kolaylaştırabileceğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm çözeltileri buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir.