Name: Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Öğrenin mitokondrial Ca²⁺ saklama kapasitesi ve Ca²⁺-mitokondrial şişme tahlillerini SH-SY5Y hücrelerinden izole edilmiş mitokondri kullanarak. Bu yöntem, mitokondrial disfonksiyon ve anormal enerji metabolizmasını araştırmak için basit ve etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Shandong seçkin bilim adamı (JQ201421) ve NSFC (81371226) hibe verilmesi gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. mitokondri yalıtım
Not: Tüm çözümleri ve ekipman olmalı 0 - 4 ° C olarak precooled ve buz tuttu.
<ol><li>10 cm hücre kültür çanak başına tohum yaklaşık 3 x 106 SH-SY5Y hücreleri. Yüksek glikoz Dulbecco hücrelerde Kültür'ın kartal orta % 10 fetal sığır serum, penisilin (100 U/mL) ile modifiye-streptomisin (100 µg/mL). Gecede %5 CO2 içeren bir kuluçka 37 ° C'de korumak. Not: en az 1-2 x 107 SH-SY5Y hücreleri her yalıtım tahlil için ihtiyaç vardır.</li>
	<li>Orta kaldırmak ve yaklaşık 1 mL 10 cm hücre kültür tabak içinde buz soğuk PBS hücrelerle 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Buz soğuk PBS yeni 1 mL 10 cm hücre kültür çanak içine ekleyin ve yeni bir 1,5 mL tüp içine yapışık hücreleri kazımak. 4 ° C'de 10 dakika 800 x g, santrifüj</li>
	<li>Santrifüjü sırasında proteaz inhibitörleri hisse senedi 50 μL ile takıma 5 mL mitokondrial yalıtım arabellek (250 mM Sükroz, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin ethanesulfonic asit), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) hazırlamak çözüm (100 x konsantrasyon; 1 EDTA ücretsiz tablet GKD2O 500 µL içinde çözünmüş).</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet mitokondrial yalıtım arabelleği 1 mL ile resuspend. Buz 30 dk için 1,5 mL tüp kuluçkaya.</li>
	<li>Bir cam homogenizer (15-25 vuruş) askıya alınan hücrelerle yukarı ve aşağı el ile buzda parçalayıcı. Not: hava kabarcığı yok hücreleri homojen olduğundan emin olun. Sağlam hücreleri ve hücre çekirdeği bared tarafından mikroskop görsel olarak saymak ve bunu teyit > % 90 hücre kırılma oluştu.</li>
	<li>Homogenate 1.5 mL tüp ve 4 ° C'de (çekirdek ve kalan sağlam hücreleri) enkaz kaldırmak için 5 min için 1000 x g, santrifüj içine aktarın.</li>
	<li>Yeni 1,5 mL tüp ve 5 min için 1000 x g, santrifüj içine süpernatant transfer 4 ° C.</li>
	<li>Yeni tüp ve 15dk için 14.000 x g, santrifüj süpernatant transfer 4 ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve mitokondri 1 mL mitokondrial yalıtım arabelleği ile içeren Pelet resuspend.</li>
	<li>Çözüm 14.000 x g 4 ° C de 15 dakika santrifüj kapasitesi mitokondri çökelti.</li>
	<li>Elde edilen mitokondri Pelet buz tuttu ve 50-100 μL KCl medya (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malat ve 2 mikron rotenon, pH 7,4) herhangi bir eşek önce Pelet hacmine göre resuspended ay.</li>
	<li>Mitokondrial çözüm 5 μL standart BCA tahlil OD562 ölçme tarafından mitokondrial protein konsantrasyonu ölçmek için kullanın bir plaka okuyucu13kullanarak.</li>
</ol>2. mitokondrial Ca2 + saklama kapasite tayini
<ol><li>KCl ortam hazırlamak ve Ca2 +Ekle-0.5 mikron deneme önce son bir konsantrasyon yeşil flüoresan boya bağlama.</li>
	<li>1 mL izole mitokondri (0.4 mg/mL) 0.5 mikron Ca2 +içeren KCl medya aktarma-her 6-şey tabak içine yeşil flüoresan boya de bağlama.</li>
	<li>Mitokondri ve Ca2 +kuluçkaya-yeşil flüoresan boya oda sıcaklığında 1 dk. eklemek 4 μL aliquots 20 mm CaCl2 çözüm (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 için ortam ışığı korunuyorsunuz 6-şey plaka bağlama 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM malat, pH 7,4) her 6-şey plakasına iyi otomatik kullanarak dağıtmak 200 nmol Ca2 +mitokondriyal /mg protein tanıtmak için ayarlama.</li>
	<li>Floresans Spektrometre Floresans değişiklikleri izlemek için her 3 kullanın s 506 bir uyarma dalga boyu ile 2 min için nm ve emisyon dalga boyu 531 nm. Plaka için 3 600 RPM sallayarak ile donatılmış s yazılım (şekil 1) tarafından kontrol edilen kaynaklar arasında.</li>
	<li>Her şey için bir ek 4 μL aliquot 20 mM CaCl2 çözüm ekleyin ve her 3 Floresans değişiklikleri izlemek s 2 dakika süreyle Floresans zamanla artar kadar bu adımı yineleyin. Not: Mitokondri ile artan kayıt Floresans tarafından belirtilen ek Ca2 + zorlanmaktadır. MPTP açıldığında, Floresans zamanla artar.</li>
	<li>Toplam miktarı mPTP Ca2 + saklama kapasitesi açana kadar eklendi Ca2 + yorumlamak.</li>
</ol>3. tespiti Ca 2 +-mitokondrial şişme indüklenen
<ol><li>Deneme önce KCl ortam hazırlamak.<ol>
<li>İzole mitokondri (0.4 mg/mL) 1 mL KCl medyada de her 6-şey plaka aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mm CaCl2 sulu çözüm (500 nmol/mg mitokondrial protein) 10 μL mitokondrial şişme tetiklemek için mitokondrial protein ekleyin.</li>
	<li>540 Absorbans azalma kaydetmek nm her 3 s 10 dk (Şekil 2) için yazılım tarafından kontrol Mikroplaka okuyucu. Floresans değişiklikleri arasında mitokondri iç zar solutes bir akını tarafından kaynaklanır. Not: 540 azalmış Absorbans nm karşılık gelen şişmiş mitokondri. Eğer okuyucu bir düşüş Absorbans gözlemleme, bir daha uzun aralığı okuma veya okuma zamanı kabul edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. güneş deneyler denetlenir. Wei Li deneyler yapılır. Chen Zhang ve X. güneş kağıt yazdı.

Burada, mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +için basit ve etkili iletişim kuralı açıklanan-mitokondrial şişme tahlil tetikledi.
Mitokondrial yalıtım için tüm malzeme ve tüpler buza, özellikle hücreleri homojenizasyon zaman olduğundan emin olun. % 0.25 tripsin-EDTA yemek 37 ° C'de 5 min için hücrelerden ayırmak için de kullanılabilir. 15-25 vuruş sonra mikroskop altında sağlam hücre zarı gözlemlemek ve mitokondri zar kırılma önlemek gereklidir. Ancak, biz ...

Mitokondri memeli hücrelerinde oksidatif fosforilasyon tarafından kullanılan ATP yaklaşık % 95'i üretmek için ana hücresel organlar vardır. Bu münzevi micromolar konsantrasyonu Ca2 + mitokondri tarafından ADP ve inorganik fosfat varlığı ADP sentez ATP1' e fazdan için kullanılabilir bildirilmektedir. Konsantrasyonu sitozolik Ca2 + bir eşiğin gittiğinde, mitokondri alımını Ca2 + hızla olabilir ve sızma bu yavaş yavaş. Böylece, işleyen mitokondri akını artan sitozolik Ca2 +olabilir. Oksidatif fosforilasyon katılımı için alakasız, mitokondrial Ca2 + Ayrıca sitozolik kalsiyum sinyaller de katılmak ve mitokondriyal iç mPTP açılış inducing tarafından mitokondrial apoptotik mekanizması harekete geçirmek membran2. Bu çok anormal yükselmesine intrasellüler Ca2 + 3mPTP açarak mitokondrial büyük şişlik neden olabilir kabul edilmiştir. Böylece, mitokondriyal işlev mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +miktarının tarafından değerlendirmek için bu protokolü amaçlamaktadır-mitokondrial şişlik trigged.
CA2 + saklama kapasitesi alımı sitozolik kalsiyum mitokondri yeteneği ölçümdür. Mitokondri sitozolik bedava kalsiyumu tampon ve kalsiyum-bağımlı hücresel süreçler tarafından etkin olmayan precipitates şeklinde kalsiyum alımını düzenleyen. Engelli Ca2 + saklama kapasitesi enerji sınırlama ve hatta nörodejeneratif hastalıklar4,5ile ilgili stres olayları oluşur. İzole mitokondri veya hücreleri digitonin permeabilized Ca2 + saklama kapasitesi tanımlamak için kullanılabilir ve Ca2 + ek Glutamat ve malat ile izole mitokondri tarafından birikir yeteneği yükseltilmiş tarafından etkilenen değil Mitokondrial yalıtım yordamı6. Digitonin titrated bir miktar farklı hücre tipleri plazma zarı permeabilize için kullanılmalıdır. Ca2 +hexapotassium tuz-yeşil flüoresan boya, bir Ca2 +bağlama-hassas cep impermeant görünür ışık telaşlı göstergesi, yaygın olarak kullanılan7oldu. CA2 +-floresan boya düşük-benzeşme göstergesidir ve hücre içi ücretsiz Ca2 + konsantrasyonları sırasında yükselmeye devam göstermek için kullanılan yeşil bağlama uzun süreli (5 dk) elektrodlar8. Bu yöntem radyoaktif filtre tekniği daha az hassas ancak büyük ölçüde basitleştirilmiştir. Ek Ca2 + kalsiyum yeşil Floresans yükseltir ve Ca2 + alımı mitokondri tarafından Floresans taban çizgisine döndürür. Mitokondri alımı extramitochondrial Ca2 + 9başarısız kadar Ca2 + sıralı eklemeler yapıldı. Bir floresan Mikroplaka okuyucu sürekli kalsiyum yeşil Floresans bildirmek için kullanılabilir.
Mitokondri depolarized Ca2 + birikimi sonra yayımlanan Ca2 + orta ve şişmeye başladı. CA2 +-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Elektron mikroskobu ve Ca2 +ölçmek için kullanılan 540 nm can ışık Absorbans azalma-mitokondrial şişme10,11tetikledi. Mitokondri birim doğrudan nerede Absorbans düşüşler mitokondrial matris pasif şişmesi yansıtmak ileriye doğru açı ışık saçılma12' belirlenebilir.
Burada, mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için metodoloji göstermek-SH-SY5Y hücreleri izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi.

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y hücre hattı</td><td>ATCC (Küresel Biyokaynak Merkezi)</td> <td>ATCC Numarası: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum yeşili-5N</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>c-3737</td><td>Ca2 + bağlayıcı yeşil floresan boya</td></tr><tr><td>tam proteaz inhibitörleri</td><td>Roche Moleküler Biyokimyasallar</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>cam homojenizatör</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>malat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K 2 HP<O sub>4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan flaş cihazları</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>yüksek glikozlu Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı</td><td>Hiklon</td><td>SH30022</td><td>4.5 g / L glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat fetal</td></tr><tr><td>sığır serumu</td><td>Penisilin</td><td>SV30087</td><td></td>Hyclone</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA tahlil kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10 cm hücre kültürü kabı</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondrial ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

ATP üretimi oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri birincil işlevidir. Mitokondri daha yüksek ökaryotlarda da tampon sitozolik Ca2 + içinde katılmak ve mitokondriyal ATP üretiminde intramitochondrial ücretsiz Ca2 + konsantrasyon tarafından aracılık. CA2 + saklama kapasitesi mitokondri kalsiyum mitokondrial matris korumak yeteneği olarak kabul edilebilir. Birikmiş intrasellüler Ca2 + yol açan iç mitokondrial membran geçirgenliği molekülleri ile bir moleküler kaçağı neden daha az 1,5 kDa ağırlık mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış olarak adlandırdığı. CA2 +-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Burada, biz Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için iki deneyleri tarif-izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi. Ca2 + eklenir belirli miktarda sonra tüm adımları bir günde tamamladı ve Mikroplaka okuyucu tarafından kaydedildi. Böylece, bu iki basit ve etkili deneyleri Ca2 +değerlendirmek için kabul edilebilir-mitokondrial işlevleri ile ilgili.

Ca2 + saklama kapasitesi temsilcisi sonuçları: Sonuçlar floresan değerler olarak ifade edildi. Ve Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrial protein), yukarıda mPTP açılış temelle Kişilik artışla Floresans ek darbeleri ile. 5 mikron Bongkrekate (BKA), bir inhibitörü olan Ca2 +-indüklenen mPTP açılış veya 1 mikron atractyloside (ATR), Ca2 +bir aktivatör-mPTP açılış indüklenen, izole mitokondri içinde eklenmiştir. Miktarı kadar mPTP açılış Çift ...

Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.

Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Bu deneyin genel amacı, kalsiyumla indüklenen mitokondriyal şişmede mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini belirlemektir. Bu yöntem, anormal enerji metabolizması gibi mitokondriyal disfonksiyon çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, oldukça basit ve etkili olmasıdır.Başlamak için, her bir 10 cm'lik hücre kültürü kabına yaklaşık üç milyon SH-SY5Y hücresi ekleyin. Besiyerini uzaklaştırın ve 10 cm'lik hücre kültürü kabındaki hücreleri yaklaşık 1 mL buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. 10 cm'lik hücre kültürü kabına 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve yapışık hücreleri kazıyarak yeni bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın.4 °C'de 10 dakika boyunca 800 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 50 µL proteaz inhibitörü stok çözeltisi eklenmiş 5 mL mitokondri izolasyon tamponu hazırlayın. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 1 mL mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden süspanse edin.1,5 mililitrelik tüpü buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, süspansiyondaki hücreleri buz üzerinde cam bir homojenizatör ile manuel olarak yukarı aşağı hareketlerle lize edin. Homojenatı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Ardından, kalıntıları uzaklaştırmak için 4 °C'de beş dakika boyunca 1.000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjlemeden önce süpernatanı yeni bir 1,5 ml'lik tüpe aktarın. Süpernatan yeni bir tüpe aktarıldıktan sonra, 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 ×g'de santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve mitokondri içeren peleti bir mililitre mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden süspanse edin. Ardından, mitokondrileri çöktürmek için çözeltiyi 14,000 ×g'de ve dört °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Elde edilen mitokondri peleti buz üzerinde tutulmalı ve herhangi bir analizden önce pelet hacmine göre 50 ile 100 µL potasyum klorür ortamında yeniden süspanse edilmelidir.Son olarak, standart BCA testi ile mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçmek için beş µL mitokondri çözeltisi kullanın ve bir plaka okuyucu kullanarak OD562 değerini ölçün. Potasyum klorür besiyerini hazırlayın ve deneyden önce kalsiyum bağlayan yeşil floresan boyayı 0,5 µM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini belirlemek için, öncelikle 0,5 µM kalsiyum bağlayan yeşil floresan boya içeren potasyum klorür besiyerindeki izole mitokondrilerden bir mL'yi altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.Mitokondrileri ve kalsiyum bağlayan yeşil floresan boyayı, altı kuyucuklu plaka içinde oda sıcaklığında, ortam ışığından korunmuş şekilde bir dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, miligram başına 200 nanomol kalsiyum eklemek için otomatik dağıtım ayarını kullanarak altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 20 millimolar kalsiyum klorür çözeltisinden dört mikrolitrelik alikotlar ekleyin. Floresans değişimlerini 506 nanometre uyarılma dalga boyu ve 531 nanometre emisyon dalga boyu ile iki dakika boyunca her üç saniyede bir izlemek için floresan spektrometresini kullanın.Plaka, okumalar arasında yazılım tarafından kontrol edilen 600 rpm hızında üç saniyelik çalkalama özelliğine sahiptir. Her kuyucuğa ek olarak dört µL 20 mM kalsiyum klorür çözeltisi alikotu ekleyin, ardından floresans değişimlerini iki dakika boyunca her üç saniyede bir izleyin. Kalsiyum kaynaklı mitokondriyal şişmeyi belirlemek için, potasyum klorür ortamındaki izole mitokondrilerden birer mL'yi altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.Ardından, mitokondriyal şişmeyi tetiklemek için mitokondriyal proteine 10 µL 20 mM kalsiyum klorür sulu çözeltisi ekleyin. Yazılım kontrollü bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 540 nm'de 10 dakika boyunca her üç saniyede bir absorbanstaki azalmayı kaydedin. Kalsiyum kaynaklı mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin (MPTP) açılmasını inhibe eden bongkrekik, MPTP açılmasını aktive eden atractyloside ve bir boş kontrolün mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesine ait temsili sonuçları burada gösterilmiştir.Beklendiği üzere, bongkrekik uygulamasındaki kapasite, atractyloside grubundan çok daha yüksektir. Bongkrekik, atractyloside ve tedavi uygulanmayan kontrol grubunun kalsiyumla indüklenen mitokondriyal şişme sonuçlarının temsilci örnekleri burada gösterilmiştir. 540 nanometrede izlenen absorbanstaki azalma, mitokondriyal şişmeleri göstermektedir.Sonuçlar, BKA'nın MPTP açılımını inhibe edebileceğini, ATR'nin ise MPTP açılımını kolaylaştırabileceğini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde beş saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tüm solüsyonların buz üzerinde tutulmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu videoda, izole mitokondride mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için plaka okuyucu tabanlı bir test açıklanmaktadır. Tahlil, mitokondriyal kalsiyum alımının ve aşırı kalsiyum yükünün kinetiğini incelemek için kalsiyuma duyarlı bir floresan boyanın floresan sinyalini analiz eder.

Mitokondriyal Kalsiyum Alım Testi: İzole Mitokondride Kalsiyum Alımını Ölçmek İçin Plaka Okuyucu Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Bu video, mitokondri alımı kalsiyum olarak floresandaki gerçek zamanlı değişiklikleri izleyerek mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Bu test, apoptoz ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyon ve kalsiyumla ilgili süreçleri incelemek için yararlıdır.

İzole Mitokondrinin Kalsiyum Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + 'nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Öğrenin mitokondrial Ca²⁺ saklama kapasitesi ve Ca²⁺-mitokondrial şişme tahlillerini SH-SY5Y hücrelerinden izole edilmiş mitokondri kullanarak. Bu yöntem, mitokondrial disfonksiyon ve anormal enerji metabolizmasını araştırmak için basit ve etkilidir.

Mitokondrial Ca^{2 +} saklama kapasitesi tahlil ve Ca^{2 +}-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Daha fazla video keşfet