Name: Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Keşfedin, Trypanosoma cruzi hareketliliğini in vivo olarak araştırmak için şeffaf zebra balığı larvalarının nasıl kullanıldığını. Işık levhası floresan mikroskobisi ile parazitlerin canlı görüntülenmesi sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Convocatoria Interfacultades Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andesve USAID araştırma ve yenilik Fellowship programı tarafından desteklenmiştir. Biz Juan Rafael Buitrago ve Yeferzon Ardila balık bakım ve yardım için teşekkür ederiz.

aşağıdaki protokolleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Los Andes Üniversitesi (CICUAL) tarafından kabul edildi. Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) yönergeleri kesinlikle patojen ile kontaminasyonu önlemek için takip T. cruzi.
 Not: hayvan bakım ve Onarım: Casper Zebra balığı, Zebra balığı genetiği değiştirilmiş bir tür (Danio rerio) bu protokolü değerli optik saydamlıklarını nedeniyle tüm gelişim aşamalarında kullanılır. Balık en uygun bakım kontrollü koşullar türler için 14, döngüsünde bir 14 h ışık-10 s karanlık, 28 ± 1 ° C, pH (7.0-7,4) adlı çok tank dolaşım su sistemi kullanılarak işlenir. Hayvanlar günde iki kez canlı tuzlu karides (Artemia salina) ile beslenen ve gıda yetiştirme ile zenginleştirilmiş. Tüm iletişim kuralları Universidad de los Andes (C.FUA_14-017) CICUAL tarafından kabul edildi.
 1. hazırlık yumurta su <ol><li>hazırla 0,6 g/L akvaryum tuz Ters Ozmos (RO) veya deiyonize (DI) su ve 0.01 mg/L Metilen mavisi ekleyin. 
	Not: Ölçülen iletkenlik 400-500 µS/cm ve pH 7.2-7,9 düzey olmalıdır. PH düşürmek için yumurta su birkaç saat havalandırmak.</li>
</ol> 2. Tricaine hisse senedi çözüm hazırlanması <ol><li>hazırla 97,9 mL distile su (GKD 2 O) 400 mg tricaine (MS-222) eriterek tarafından tricaine hisse senedi çözüm % 0,4. Toz tamamen çözülmüş sonra pH 7.0 2.1 mL 1 M kullanarak ayarlayın Tris (pH 9.0) ve çözüm buzdolabına.</li>
</ol> 3. %1.0 hazırlanması düşük erime noktası özel son konsantrasyonu %1,0 <ol><li>erime düşük erime noktası özel toz yumurta içinde su. Karışımı bir mikrodalga veya özel çözüm homojen görünene kadar sürekli karıştırarak ile sıcak tabakta ısı.</li>
	<li>Aliquots en fazla bir hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol> 4. Tahlil ve embriyo koleksiyonu çiftleşme <ol><li>enjeksiyonu öncesinde üç gün içinde tank doğurmak erkek ve dişi balık sağlıklı çiftleri kullanılarak matings kurmak. Zenginleştirme cam mermerler ve yapay ağaçlar ile yumurtlama geliştirir. Matings öğleden sonra boyunca ayarlamak ve gecede yaptı.</li>
	<li>Ertesi sabah, tank bir süzgeç aracılığıyla boşaltma ve yumurta yumurta su ile yıkama tarafından oluşturulan yumurta toplamak. Bütün yumurtaları ters çevirme süzgeç ve süzgeç aracılığıyla bir Petri kabına yumurta su dökme çıkarın. Embriyo sağlıklı tutmak için onların herhangi bir enkaz ve ölü embriyo transferi plastik pipet ile kaldırarak temiz su.</li>
	<li>Bir kuluçka 28.5 ° c Zebra balığı hazırlama standartları 15 göre embriyo gelişimi sağlamak için istikrarlı bir sıcaklık embriyo transfer edin. Günde iki kez embriyoların incelemek ve debriyaj sağlıklı tutmak için inviable yumurta atın.</li>
</ol> 5. Embriyo Dechorionation Not: embriyo enjeksiyon zamanda yumurtadan değil, bu yordam gereklidir. Bu yordamda, &#34; larva &#34; hayvanlar onların koryon 48 h dışarı sonrası döllenme (hpf) itibaren vardır.
<ol><li>Deneme günü, diseksiyon stereoscope altında sağlıklı embriyoların içeren Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Koryon karşıt ucunda iki keskin forseps (Dumont #5) ile kapmak ve hafifçe açık gözyaşı ve çekme koryon. Yaklaşık 5-6 larva bir kerede enjekte ve genellikle 3-4 yansıma.</li>
	<li>Chorions transfer pipet kullanarak denizden çıkarmak.</li>
</ol> 6. Enjeksiyon malzemesi hazırlama <ol><li>hazırlamak 1.0 mm iğneler ince duvar cam kılcal damarlar ve micropipette çektirme cihazı aşağıdaki ayarlarla kullanarak: 2 hafif ağırlık + 1 ağır, 2 mm en iyi çekme + 5 mm alt çekme, 75.9 ° C (Adım 1) + 78.2 ° C () 2. adım). İğneler bir petri kil modelleme Las Vegas saklayın. İdeal iğne dar bahşiş olarak T. cruzi olmalıdır yaklaşık 20 x 1-3 µm ölçmek ve iğne ile kolayca geçecek. Ucu uzunluğu değişebilir: daha uzun bir ipucu daha derin yapıları ulaşmak yararlıdır, ama kısa bir ipucu daha sert enjeksiyon kullanıcı için daha kolay hale olacak. 
	Not: Kullanılan sıcaklık iğne ucu boyutunu bağlıdır: adım 2 için daha yüksek bir sıcaklık sonuç daha uzun ve daha ince bahşiş.</li>
	<li>GKD 2 O % 1.5 özel çözümde hazırlamak ve 10 cm Petri kabına dökün. Yaklaşık 1.0 cm derinliğe kapak.</li>
	<li>Üzerinde özel bir Prefabrik mikroenjeksiyon kalıp yerleştirin ve katılaşmaya sağlar.</li>
	<li>Prefabrik mikroenjeksiyon kalıp dışarı Asansör ve yumurta su depolama için 4 ° C'de ekleyin Bu özel kurumasını engeller.</li>
	<li>Ekle yumurta su tricaine hisse senedi çözüm için 150 mg/l mağaza son bir konsantrasyon 4 ° C.</li>
</ol> 7. Hücre kültür parazit büyüme için <ol><li>parazit Vargas-Zambrano vd tarafından açıklanan yöntemi kullanarak bir insan tümörü hücre satırı (CRL-1718) korunur 16</li> <li>T25 kültür şişeler içinde insan hücreleri kültürünü başlatın (yüzey alanı = 25 cm 2) bir yoğunluk 2 x 10 5 veya 4 x 10 5 hücrelerin RPMI-1640 orta 4 ml fetal buzağı serum (FCS) yüzde 10'u ile desteklenmiş 2 mM L-glutamin, 4,5 g/M glikoz, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate ve % 1 penisilin-streptomisin (adı verilen &#34; tamamlamak medya &#34;). Tümörü kültürleri % 5 CO 2 ortamında 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Bir monolayer Konfluent olduğunda, onları 3 dk 37 ° C. görsel olarak onay için hücre dekolmanı az için kuluçka tripsin-EDTA % 0.25 2 mL kullanarak hücre bağlantısını kesin ve RPMI-1640 3 mL % 10 FCS 15 mL tüp ile kullanarak tripsin çözüm engellemek.</li>
	<li>Santrifüj 1.350 x g., 5 min için hücre süspansiyon</li>
	<li>Elde edilen hücresel Pelet DMEM ortamda 15 mL tüp ve santrifüj 1.350 x g 22, 5 min için yıkayın ° C.</li>
	<li>Hücrelerde el ile Neubauer odası ve onay için 40 X büyütme, ışık mikroskop içinde canlılık saymak.</li>
	<li>Nazikçe yeniden askıya hücresel cips 4 mL tam medya ve yeni hücre kültürleri T25 kültür şişe 2 x 10 5 hücreleri kullanarak oluşturmak için kullanın.</li>
</ol> 8. T. cruzi kültür ve etiketleme <ol><li>parazit vardır aslında enfekte bir insandan alınan ve T. cruzi DA zorlanma (MHOM/CO/01/DA), karakterize bir zorlanma genotip ayrı yazarak birimi (DTU) MKE 16. Kültür, 3 ya da 4 gün topladıktan sonra hareketli parazitler insan tümörü hücre kültür süpernatant ve santrifüj 1.350 x g., 5 min için orta atın. 
	Not: Parazit tam ortamda yeniden kültür 1:1 oranında T25 kültür şişeler hücrelerde tümörü ile ne amaçla kullanılacağını.</li>
	<li>Yavaşça 10 ml steril 1 fosfat tampon serum (PBS) % 0,1 FCS ve 5 min için santrifüj x 1350 x g., pelet yeniden askıya alma</li>
	<li>Süpernatant atın ve 1 mL PBS yeniden askıya alma. Free-swimming parazitler Neubauer odasında sayımı için 10 µL alın.</li>
	<li>Yeniden askıya alınan parazitler (990 µL) dinlenmek ve Carboxyfluorescein Diacetate Succinimi 1 µL ekleyinDyl Ester (CFSE), nihai toplama 5.0 µM. Incubate oda sıcaklığında 10 dk için. 
	Not: Bölünmemeli ve bakımlı -20, 5 mM CFSE stok olmalıdır ° C.</li>
	<li>(1.350 x g, 5 min) parazitleri cips. Parazit Pelet tüp flicking tarafından yeniden oluşturmak ve yıkama PBS-0.1% FCS ardından bir sonraki tur tarafından (1.350 x g, 5 min) 1 x 10 ml.</li>
	<li>Süpernatant atmak ve yavaşça etiketli parazit Pelet yaklaşık son bir konsantrasyon elde etmek için 1 X PBS içinde uygun cilt ile yeniden askıya 10-20 parazitler/nL enjeksiyon için.</li>
	<li>Küçük bir birim kullanmak (&#8764; 10 µL, yaklaşık 1 x 10-4 -2 x 10 4 parazitler), canlılık ve etiketleme değerlendirmek için trypomastigotes. Bir ters Floresans mikroskobu parazitleri doğrudan görselleştirme için kullanılabilir. İletilen ışık modunda parazitleri hareket kontrol edin. Parazit etiketleme değerlendirmek için floresein Isothiocyanate (FITC) filtre Floresans modunda kullanın.</li>
</ol> 9. Zebra balığı larva enjekte <ol><li><ol>parazit yükleme <li>parazit resuspension (100 µL) üzerinden 10 µL alıp 10 µL microloader pipet ucu kullanarak mühürlü cam iğne yükleyin.</li>
		<li>Cam iğne micromanipulator iğne bağı yerleştirin, manyetik bir stand kullanma ve yer yanındaki stereoscope.</li>
		<li>Bir künt açık oluşturma iğne kesmek stereoscope altında kullanma iyi forseps sonlandırmak ve 1 bir enjeksiyon hacmi elde etmek için damla boyutu ölçmek nL (Bu mineral yağ 17 mm ölçülen zaman eşdeğer 0,12 0,13 boncuk çapı için). İğne yapıları erişebilmesi uzun bahşiş tercih edilir derin doku zarar olmadan balık içinde. Bu protokol için bir künt iğne kullanılır, ancak eğimli bir iğne de kullanılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Montaj <ol><li>48 larvaları anestezi hpf, 150 mg/L tricaine ile. Dokunmak, yanıt vermeyen onay ama emin olun kalp atıyor.</li>
		<li>Larvalar mikroenjeksiyon özel kalıp bir lateral pozisyonda yerleştirin.</li>
		<li>Stereoscope yanında iğne bağı yerleştirin ve iğne ucu görüş alanı merkezinde micromanipulator ayarlamak. Larva sarısı iğne ucu yakın olması adımları 6.2 - 6.4 için hazırlanmış Petri kabına taşıyın. Kalp dayak devam etmesini sağlamak için larva durumunu kontrol.</li>
		<li>Set microinjector değerleri aşağıdaki gibi: enjeksiyon 9,6 pound / inç (PSI) basınç; basınç tutun: 20 psi; perdeleme 100 ms aralığı; (10,9 ms için karşılık gelen) 1.9 dönem değeri. Enjeksiyon hacmi 1-3 nL, yaklaşık 10-20 parazitler/nL ile arasında olmalıdır.</li>
	</ol></li></ol> 10. Parazit enjeksiyon <ol><li>enjekte balık sarısı Cuvier kanalı, çift ön kısmında. Bu adımı enjeksiyon sonra hayvan hayatta kalmasını sağlamak için icra edilebilir. 5-6 larva başarıyla enjekte için yaklaşık 10 dakika sürer.</li>
	<li>Bir kontrol, 1-2 larva aynı araç birimle (1 x PBS) enjekte.</li>
	<li>Hemen taze yumurta suya larva transfer.</li>
</ol> 11. Larva enjekte, montaj LSFM <ol><li>parazit için boş bir Petri kabına enjekte larva Transfer ve çevresindeki su plastik pipet ve emici kağıt ile dikkatli bir şekilde çıkarın. Düşük erime noktası özel ısıtılmış %1.0 100 µL hemen ekleyin (Adım 3 için özel hazırlık bakın) larva kapsayacak. Özel 40 üzerinde olmadığından olun ° C.</li>
	<li>1.0 mm cam kılcal damar içinde düz bir tel takın ve bir dikey pozisyonda larva kadar emmek için bir dalgıç kullanın. Özel larva yukarıda küçük bir miktar bıraktığınızdan emin olun. (Bu bir kaç dakika gerektirir) larva açığa önce özel katılaşır kadar bekleyin. Gerekirse, larva aşağıda aşırı özel dışarı itmek ve kapalı kesim</li>
	<li>Kılcal yer içinde mikroskop örnek tutucu ve sonuna kadar ücretsiz kılcal asılı larva içeren dışarı itin. Numune odası tricaine çözüm (150 mg/L) ve 28, ayarla sıcaklık ile doldurulmalıdır ° C.</li>
	<li>Larva bir XYZ-micromanipulator sistemini kullanarak algılama amaç öğrencinin önünde konumlandırın. Dikey eksen hakkında rotasyonu için döndürme sahne alanı kullanın. Larva konumlandırma larva yapıları açık bir şekilde belirtmek için iletilen ışık modunda yapılmalı.</li>
</ol> 12. Parazitler enjekte, görüntüleme LSFM <ol><li>değişiklik floresan için modu ve aydınlatma yoğunluğu yanı sıra duyarlilik azaltmak ve zaman çözünürlüğü en iyi duruma getirmek için çekim hızı ayarlayın. Bu belirli deneyler için 2.8 3.0 mW güç örnek için kullanılan ve her çerçeve 200 6.45 µm piksel ve algılama dalga boylarında ~ %70 kuantum verimi ile bir kamera ile ms için maruz. Bu ayarları hakkında 5 kare/s bir amaç ile en yüksek olası sayısal diyafram kullandığınızdan emin olun yeterince maruz görüntülerde sonuçlanmalıdır.</li>
	<li>Bölge (ROI) ilgi video edinimi başlatın. Bizim durumumuzda, parazitler vanalar için bağlı ve serbestçe hareket kalp çevresinde gözlenir. Bu zaman içinde bir video tek bir uçak almak veya parazit hareket ederken farklı düzlemler odaklanmak için micromanipulator veya piezo-galvo sistemini kullanmak için tavsiye edilir. 
	Not: Bu yordam en fazla 2 saat kısa edinme zamanlar için yararlı olacaktır. Uzun vadeli edinmesinin larvalar alternatif yöntemler 20 kullanarak monte edilmelidir.</li>
</ol> 13. Görüntü işleme ve alınan veri analizi Not: görüntü işleme 2.90 GHz işlemci, 8.00 GB-in bellek ve 1.00 GB belleği olan bir ekran kartı olan bir kişisel bilgisayarda gerçekleştirilen.
Görüntü işleme yazılımı tercih <ol><li>Açık alınan veri kümesi. Açık Yazılım FiJi LSFM veri işleme ve analiz 21 için önerilir.</li>
	<li>Görüntü analizi yazılımı görüntüleri geliştirmek için parlaklık ve kontrast düzeyleri ayarlayın. 
	Not: Sabit parametre kullanılan bu durumda ama seçme &#34; otomatik &#34; seçeneği bir ilk donaným elde etmek yararlı olabilir.</li>
	<li>Yatırım Getirisi seçin. 
	Not: bireysel parazitler izlemek için FiJi her iki el ile ve otomatik izleme eklentileri mevcut vardır.</li>
</ol> 14. Larva yansıma kurtarma <ol><li>Kaldır dikkatle özel kullanarak üzerinden larva iyi forseps ve saç döngüsü aracı. 15 dk. döndükten sonra larva kuluçka 28 ± 0,5 ° c için balık geri taze yumurta su ve kurtarma için onay transfer</li>
	<li>Alternatif olarak, aşırı dozda tricaine ile görüntülü larva ötenazi için devam edin. O zaman, sodyum hipoklorit çözeltisi içinde larvalar tanıtmak (%6.15 NaClO) parazit öldürmek 5 min için. Kurum göre elden &#39; s standart protokolleri.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/</a> (2017).</li>
<li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1410150">Chagas's Disease.</a> New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).</li>
<li>Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+chemotherapy+with+benznidazole+in+children+in+the+indeterminate+phase+of+Chagas%E2%80%99+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).</li>
<li>Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosas%2C+F+%22Cardiomyopathies+-+From+Basic+Research+to+Clinical+Management%22">Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management</a>. , (2012).</li>
<li>Finkelsztein, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+motility+of+Trypanosoma+cruzi+with+rabbit+polyclonal+anti-peptide+antibodies+reduces+infection+to+susceptible+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells.</a> Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).</li>
<li>Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+L-Proline+and+ATP+Production+by+Trypanosoma+cruzi+Metacyclic+Forms+as+Requirements+for+Host+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).</li>
<li>Engstler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Uppaluri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Microscopic+Motility+on+the+Swimming+Behavior+of+Parasites%3A+Straighter+Trypanosomes+are+More+Directional%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional.</a> PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058(2011).</li>
<li>Heddergott, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+Motion+Represents+an+Adaptation+to+the+Crowded+Environment+of+the+Vertebrate+Bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023(2012).</li>
<li>Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+zebrafish+for+intravital+study+of+eukaryotic+pathogen%E2%80%93host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions.</a> Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).</li>
<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-Pathogen+Interactions+Made+Transparent+with+the+Zebrafish+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+Adult+Zebrafish+as+a+Tool+for+In+Vivo+Transplantation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+embryos+gently+with+laser+light+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Slicing embryos gently with laser light sheets.</a> BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. 
 <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+astrocytoma+cell+line+is+highly+susceptible+to+infection+with+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6, 22(2011).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+microscope+control+using+%CE%BCManager+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of microscope control using μManager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+Mounting+for+Long-term+Light+Sheet+Microscopy+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ng, A. N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li>
<li>Higuchi, M. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+Trypanosoma+cruzi+parasitism+and+myocardial+inflammatory+infiltrate+in+human+chronic+chagasic+myocarditis%3A+Light+microscopy+and+immunohistochemical+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).</li>
<li>Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Chagas+disease%3A+presence+of+parasite+DNA+in+the+oesophagus+of+patients+without+megaoesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).</li>
<li>Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. <a target="_blank" href="https://insights.ovid.com/developmental-comparative-immunology/devcmi/2005/09/000/parasite-infections-revisited/1/00114477">Parasite infections revisited.</a> Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).</li>
<li>De Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+biology+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Basic cell biology of Trypanosoma cruzi.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).</li>
<li>Langousis, G., Hill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+more%3A+the+flagellum+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei.</a> Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).</li>
<li>Johnson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+Trypanosoma+cruzi+infection+induces+secretion+of+defensin+%CE%B1-1%2C+which+damages+the+flagellum%2C+neutralizes+trypanosome+motility%2C+and+inhibits+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection.</a> Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).</li>
<li>Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Activation+of+Human+Monocytes+and+Lymphocytes+by+Distinct+Strains+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+neglected+tropical+diseases%22%5BJournal%5D)">Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi.</a> PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816(2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada patojen davranış vivo içindeçalışmak için hayvan bir model olarak Zebra balığı avantajları vurgular. Özellikle, bu çalışma onun doğal ortamda patojen T. cruzi görselleştirmek için bir yöntem öneriyor: hematic dolaşım. Dolaşım microenvironment balık çevre memeliler karşılaştırılabilir ve trypanosomatids seyahat, bağışıklık sistemi kaçırmak ve için o çevre25enfeksiyonunda hücrelere bağlama için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bu iletişim kuralı T. cruzi bir insan hücre satırı kültürünü ve floresan etiketleme için kamçı formları sonraki yalıtım için en uygun bir yordamın açıklaması sunmaktadır. Daha sonra daha sonra montaj ve LSFM kullanarak görselleştirme için şeffaf Zebra balığı içine parazit başarılı enjeksiyon için uygun ayarları gösterir. Son olarak, bu iletişim kuralı parazit konumu ve LSFM kullanarak dolaşım hareketinde etkin ve etkili vivo içinde görüntüleme için öneriler sunar.
Tripanozomlar kamçı hücre gövdesinden akan ve posterior bölgede çıkar ve asmak organizma26ön kısmında ücretsiz. T. cruzi kendisi kamçı asıl olayın asalağın tüm vücudu undulates vücut önünde sallayarak tarafından propels. Kamçı hareket sadece T. brucei27 (Afrika tripanozomiyasına sorumlu ajan) olduğu gibi parazit hareketliliği için vazgeçilmez değil ama aynı zamanda T. cruziiçinde5 gösterildiği hücresel enfeksiyon için kullanılır ,28. Zebra balığı olmamasına rağmen T. cruziiçin doğal ev sahibi, asıl olayın asalağın hareketliliği burada açıklanan protokolleri kullanarak gelişmekte olan bir kardiyovasküler dolaşım sisteminde okudu. Ayrıca, cyprinids, Zebra balığı, T. carassii ve T. borreli25. gibi sınıf bulaştırmak Tripanozomlar türü bulunmaktadır Bu parazit türler gerçek zamanlı olarak çalışma hareketleri ve bu trypanosomatids eki mekanizmaları için kullanılabilir; Bu tür çalışmalar memeli hücre enfeksiyon sürecine içgörü ödünç verebilirim.
Bu çalışmada, hareketli T. cruzi enjekte gözlenen aşısını balık kardiyovasküler dolaşım seyahat, opak eritrositler ile birlikte hareket ve kardiyovasküler sistem duvar yapıları yapıştırma parazitler vardı. Biz uzun çalışma mesafesi 10 X akromatik ile ev yapımı LSFM kullanılan hava amaç (17.6 mm) 0,25 sayısal bir diyafram ile aydınlatma kol için. 40 X apochromatic su daldırma amacı 0,8 sayısal bir diyafram ve 3.5 mm çalışma mesafesi ile algılama kol için kullanıldı. Aydınlatma amaç odası dışında iken algılama amaç örnek odasına dalmış. Bir coverslip ile mühürlü odası ve optik tutkal Lorenzo ve ark. içinde gösterildiği gibi aydınlatma ışını odası, girmek izin verilen bağlantı noktası 18 için aydınlatma, biz 50 mW DPSS laser 488 kullanılan nm olan güç bir Acousto optik Tunable filtre tarafından modüle. Algılama yol filtreleri yeşil flüoresan Protein (GFP) veya FITC ile uyumlu kullanılır. Bir kılcal örnek sahibi (ideal ile otomatik rotasyon) ve sıcaklık kontrolü örnek odası ile donatılmış hafif levha mikroskop bu uygulama için uygun olmalıdır. Mikroskop hizaladım ve üretici yönergelerine veya satın alma önce kullanıcının laboratuvar standart protokolleri göre gerekirse kalibre. Bu protokol için istenmeyen anlık ileti yazılımı19kullanma mikroskop kontrol.
Zebra balığı dolaşımda bulunan larvalar paraziter eki etkili olduğuna dikkat etmek önemlidir. Kardinal ven parazitler için kadar birkaç dakika bağlı kaldı; kalbinden, subaplar ve duvarlar, kalp kasılma ile salınan tutundu. Daha fazla çalışmaları olup olmadığını T. cruzi kan akımı yönde drift akan eritrositler etkileşim aydınlatmak için kalır. Önceki vitro çalışmalar sağlam yapılar (Yani, kan hücreleri) varlığı veya artmış viskozitesi kan vitrotaklit etmek için sıvı göstermiştir, hareketliliği ve parazit hızı üzerinde önemli bir etkisi vardır 9.
Fagositik hücreleri, başlangıçta enfekte hücre türü29amastigotes kaçış sonra T. cruzi enfeksiyon insanlarda seyri ile ilgili birçok soru vardır. Örneğin, hedef organları nasıl gelecekler mi? Kalp, sindirim ve merkez sinir sistemi gibi tercih edilen organlara tropism mekanizmaları nelerdir? O parazitleri en yüksek yoğunluğa sitenin olduğu ilginçtir, bu çalışmada parazitleri başlangıçta kalbinden görüntüsü. Ancak, CFSE sinyal daha sonra 7 gün sonrası enjeksiyonu ile gelişmekte olan bağırsaklarda biriken. Balık ve memeliler anatomisi farklı olsa da, bu çalışmanın sonuçları parazitler tropism bilinen tercih edilen hedef organları organizma farklılıklara rağmen doğru sergilenen gözlendi gibi tropism, bir tür göstermektedir. Bu çalışmanın önemli bir sınırlama ile ilgili deneylerde kullanılan sıcaklık. Zebra balığı larvaları yaklaşık 28 °C tüm işlem sırasında tutulmalıdır. Bu sıcaklık vektör konak (Triatominae alt familya böcekler) benzer olduğu halde, son ana bilgisayarlar (yaklaşık 37 ° C) oluşturan sıcak kanlı memeliler oldukça farklıdır. T. cruzi kamçılı yaşam formları her iki konaklarda sahip olduğu bilinmektedir; Ancak, bu faktör içinde vivohayvan davranışlarında bir etkisi olabilecek akıldan çıkarmamak önemlidir.
4 hafta fertilizasyon deftere nakletmeden fish´s edinilmiş bağışıklık sistemi olgun olmamasına rağmen doğuştan gelen bağışıklık sistemi içinde erken10geliştirme etkindir. Fagositlerlerce yuttu Tripanozomlar (veri gösterilmez) etiketli 48 veya 96 hpf, gibi erken tespit edildi. Bu parazit görselleştirme için zaman pencere sınırlar. Ancak, bir çalışma fish´s bağışıklık yanıtı değerlendirirken üzerinde odaklanmak için olsaydı, daha sonraki aşamalarında enjeksiyon önerilebilir. Ayrıca, parazitler ve enjeksiyon ile Etiketlenmiş makrofajlar transgenik balık satırlara veya diğer hücreleri bağışıklık sisteminin parazit eki ve olası endositoz mekanizmaları eğitim yararlı olabilir. Bu parazitler CFSE ile etiketlenir, transgenik hücre etiket-meli değil var olmak GFP ve bir işaretleyici sarı veya kırmızı sonunda spektrum gereklidir unutmamak önemlidir.
Parazit hareket detaylı yönü değerlendirmek için onların yörünge 3 boyutlu (3D) takip etmek yararlı olabilir. 3 boyutlu görselleştirme ve işlemi yeniden inşası için yüksek hızlı bir sistem gereklidir. Bu protokol için kullanılan ekipman ile sadece bir düzlemde parazitler görselleştirmek mümkündür. Bu durumda, parazit hareketi sırasında odak düzlemi istikrarı korumak ve onun yörünge bir düzlemde kayıt öncelik.
Burada önerilen metodoloji parazit davranış kardiyovasküler dolaşımda daha ayrıntılı araştırmaya yol açıyor. Özetle, Zebra balığı larva içinde canlı floresan parazitler görüntüleme için temel adımlar şunlardır:(i) erken taranmış embriyo (24-48 hpf) veya larva veya hayvanlar arasında 72-96 hpf yok pigmentasyon ile böylece bunlar şeffaf ve enjekte etmek kolay kullanımı; (ii) görüntü larva sonra en kısa zamanda enjeksiyon parazit izni Fagositik hücreleri tarafından önlemek için; ve (iii) LSFM (örneğin, Perikardiyal bölgesi) ilgi sitesi üzerinde odaklanmak ve odak korumak. Roman Bu yordam trypomastigotes görselleştirme bir ortamda ilk kez T. cruzi yaşayan bir organizma çalışma imkanı sağlamaktadır doğal enfeksiyon çevresinden karşılaştırılabilir verir.

Chagas hastalığı protozoon parazit tarafından neden T. cruzi. Yaklaşık 6-7 milyon kişi dünya çapında T. cruziile bulaşmış. Hastalık esas olarak Latin Amerika'da iletilir, ama Amerika Birleşik Devletleri, Kanada ve birçok Avrupa yanı sıra özellikle geçiş enfekte bireylerin1nedeniyle bazı batı Pasifik ülkeleri bildirilmiştir. Chagas büyük ölçüde vektör kaynaklı ve iletilen insanlara "kissing bugs" olarak bilinen Triatominae alt familya hematophagic böceklerin dışkı ile temas. Ancak, T. cruzi kan nakli, dikey anne çocuk veya parazitler2ile kontamine yiyeceklerin yenmesi için nakil yolu ile de bulaşabilir. Enfeksiyon genellikle asemptomatik veya yapısal semptomatik ve 6 ila 8 hafta sürer Akut Faz sonra hangi nişan bağışıklık sisteminin parazit yük kontrol eder, ama enfeksiyon3tamamen ortadan kaldırmaz. Çoğu kişiler sonra bir kronik asemptomatik dönem girin; Ancak, neredeyse hastaların % 30 kardiyak sistem ve daha az sıklıkla sindirim ve sinir sistemleri güvenliği aşılan4olan bir semptomatik kronik faz geliştirmek. Bu senaryo yana aşı yok ve sadece iki etkili ilaçlar için Chagas hastalığı tedavi ve kontrol için bir meydan okuma sunuyor: benznidazole ve nifurtimox. Her iki tedavi uzun süreli yönetim gerektirir ve ciddi yan etkileri2olabilir.
T. cruzi davranışını anlamak artan davranış vivo paraziter geçiş, hücresel eki ve işgal ev sahibi içinde belirleyen anahtar olduğunu; vivo modellerin eksikliği yeni tedavi yaklaşımları gelişimi sınırlar. Vitro çalışmalar T. cruzi enfeksiyon trypomastigotes hareket bağlama konak hücre zarlarında ve sonraki hücresel işgali5için önemli olduğunu göstermiştir. Trypomastigotes ortak kültür duyarlı hücre hattı ile enerji tükenmesi hücresel işgali6azaltmak için gösterilmiştir. İlginçtir, trypanosomatids, kamçı hareket de parazit özel antikorlar7karşı bir kaçırma mekanizması olarak karakterize.
Kamçı hareketliliği kapsamlı bir şekilde okudu vitro Trypanosoma brucei, Afrika tripanozomiyasına8neden yakından ilgili bir parazit olmuştur. Vitro çalışmalar bu Tripanozomlar hareketliliği, kan veya vücut sıvıları, viskozite ve engelleri kan hücrelerinin temsilcisi varlığı da dahil olmak üzere koşullarının simülasyonu parazit ileri hareketi9 önemli gösterdi . Derecede-in henüz bu parazitler ve kan dolaşımına vivo içindeiçinde hareket görselleştirmek mümkün olmamıştır.
Zebra balığı larva ana bilgisayar-patojen etkileşim içinde vivoeğitim için güçlü bir model vardır. Bunlar küçük, ucuz ve Chagas hastalığı için kurulan diğer omurgalı modellerle karşılaştırıldığında yükseltmek nispeten kolay. Zebra balığı var doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri insanlara benzer, ama onların edinilmiş bağışıklık sistemi 4 gün sonrası döllenme (dpf) geliştirmeye başlar ve başka bir birkaç hafta10için olgun değil. Erken geliştirme sırasında sadece makrofajlar bulunduğunda, parazit davranış hemen bağışıklık girişim10olmadan çalışmak için büyük bir pencere var. Ancak, Zebra balığı larva patojen davranış eğitimi omurgalı bir model olarak kullanan en büyük avantajı mikroskobik eleme ve11görüntüleme için mükellef geliştirmelerde optik saydamlıklarını yatıyor. Ayrıca, Balık genetik işlemek için birden çok araç vardır. Örneğin, Casper zorlanma ile pigmentasyon tamamen şeffaf ve yararlı görselleştirme bireysel organları ve gerçek zamanlı izleme enjekte hücreler12hayvan yapma, Zebra balığı mutant bir çizgidir.
Bir imkânsızlık görüntüleme, yüksek satın alma hızları ve büyük penetrasyon derinliklerinde iyi resim kalitesine sahip ve düşük hızla hareket eden parazitlerin canlı Zebra balığı confocal kullanarak veya epifluorescence mikroskobu boyuna gözlem bir anahtar sınırlaması yatıyor duyarlilik riski. Hafif levha floresan micsroscopy (LSFM) bu gözlemler izin vermek için bu sınırlamalar üstesinden gelir gelişmekte olan bir görüntüleme tekniğidir. Floresan ve sadece odak düzlemi algılama amacın aydınlatan ikinci bir dik aydınlatma hedefi tespit etmek için bir hedefi kullanarak, yüksek çözünürlüklü optik bölümleri olduğu gibi confocal mikroskop ama ile elde etmek mümkündür önemli ölçüde azaltılmış duyarlilik, hatta epifluorescence mikroskobu13ile ilgili olarak. Burada kullanılan LSFM teknik tek uçak aydınlatma mikroskobu (ince bir levha ile ışık Zebra balığı larva içinde tek bir uçağı aydınlatan istenmeyen anlık ileti), denir.
Bu metodoloji amacı T. cruzi hareketliliği ve ilgili davranışları vivo içindeanlamak için uygun bir enfeksiyon model olarak larva Zebra balığı kurmaktır. Bunu gerçekleştirmek için biz şeffaf Zebra balığı larva fluorescently etiketli trypomastigotes, insanlar, enfeksiyon için sorumlu hücresel formu ile enjekte ve T. cruzi hareketinde Zebra balığı kalp-damar dolaşımını tespit LSFM kullanarak.

<table><tbody><tr><td>0.5-10 & mu; L Mikropipet</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-815</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz RA</td><td>Amresco</td><td>N605</td><td>Normal</td></tr><tr><td>Agaroz SFR</td><td>Amresco</td><td>J234</td><td>Düşük Erime noktası</td></tr><tr><td>Akvaryum tuzu</td><td>Anında okyanus</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayım odası</td><td>Boeco</td><td>Neubauer&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Algılama hedefi</td><td>Nikon 40x 0.8NA&nbsp;</td><td>40x CFI APO NIR</td><td></td></tr><tr><td>DMEM orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 ince forseps</td><td>Dünya hassas Aletler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS)</td> <td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Chroma</td><td>ET-525 / 50M</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo montajı için cam kılcal damarlar</td><td>Vitrez Medical</td><td>160215</td><td></td></tr><tr><td>İğneleri çekmek için cam kılcal damarlar</td><td>Dünya hassas aletleri</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156300-80</td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka</td><td>Makinesi Thermo Corporation</td><td>Revco</td><td></td></tr><tr><td>Larva mikroenjeksiyon kalıbı</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Kristalleştirici</td><td>DL488-050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>250300-81</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>Albor Qu&iacute; micos</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör sistemi</td><td>LSFM için Sutter Instrument</td><td>MP-200</td><td>& nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme cihazı&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>CX31</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (ters)</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Çok amaçlı mikroskop</td><td>Nikon</td><td>AZ100M</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>Boeco Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 94x16</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pastör pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>11577722</td><td></td></tr><tr><td>Rotasyon aşaması</td><td>Newport</td><td>CONEX-PR50CC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4130</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>C-LEDS</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler 15 ml</td><td>Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr></tbody></table>

kuruluş, larva zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak trypanosoma cruzi hareketliliği in vivo olarak

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas hastalığı Trypanosoma cruzikimin hareketliliği sadece yerelleştirme, hücresel bağlama ve işgali için de önemli değil, neden olduğu paraziter bir enfeksiyondur. Hayvan modellerinde geçerli: T. cruzi çalışmanın parazit davranışını anlamak için bir meydan okuma enfeksiyon insanlarda ilk aşamalarında temsil eden parazitler içinde vivo sınırlı gözlem izin. Bu protozoon kamçılı aşamasında hem vektör hem de memeli ev sahibi var, ama onun hareketliliği vivotanımlayan hiçbir çalışma vardır. Bu projenin amacı T. cruzi hareketliliği damar sisteminde değerlendirmek için canlı omurgalı Zebra balığı modeli kurmak oldu. Larvaları ile fluorescently enjekte edildi şeffaf Zebra balığı trypomastigotes etiketli ve hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM), yüksek optik çözünürlük ile canlı organizmalar görselleştirmek için invaziv bir yöntem kullanarak görülmektedir. Parazitler bu teknik için confocal karşılaştırıldığında duyarlilik nispeten düşük riski nedeniyle uzun bir süre için görüntülenmeyecektir veya epifluorescence mikroskobu. T. cruzi parazitleri farklı boyutta kan damarları ve sarısını canlı Zebra balığı dolaşım sistemi de seyahat tespit edildi. Onlar sarısı sac duvar ve kalp kasılma ile ilişkili güçlü kuvvetler rağmen Atriyoventriküler kapak ekli görülebiliyordu. T. cruziLSFM-Zebra balığı aşısını larva bir yöntemdir parazitler dolaşan görselleştirmek için kullanılan ve onların tropism, geçiş desen ve motilite canlı hayvan kalp-damar sisteminin dinamik ortamda değerlendirmek bir değerli.

Enjeksiyon için en uygun koşulları:
Zebra balığı larva grupları 24, 48, 72, 96 ve 120 enjekte farklı anatomik sitelerdeki hpf ve onların yaşam 5 gün boyunca her gün muayene. 5 gün enjeksiyon deftere naklettikten sonra embriyo 24 enjekte hpf vardı %6.25 (2/32) hayatta kalma, % 95'i (38/40) 48 enjekte larva hpf hayatta iken. Bir denetim olarak larva 1 x PBS ile bir araç olarak enjekte edildi. Sağkalım oranı balıkların üzerinde hiçbir bağımlı parazit etkileri gösteren araç enjeksiyonlu ve parazit enjekte larva arasında hayatta hiçbir fark vardı (p 0,08 =). 72-120 hpf arasında enjekte larva 48 hpf-Injected larva için karşılaştırılabilir sağkalım oranları sabit enjeksiyon ses seviyesinde vardı. Burada sunulan tüm yordamları için 48 hpf larva manipülasyon ve organ ve belirgin zarar vermeden kolayca işlenebilir cilt enjeksiyon sonra geliştirilmiş olması onların kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır.
Hpf larva 48, enjekte edildi Perikardiyal boşluğa enjekte, kas, arka beyin ventrikül ve vezikül notochord ve Cuvier kanal sarısı saç kuyruk. Farklı anatomik sitelerinde enjekte larva yaşama hiçbir farklılıklar vardı. Ancak, enjekte etmek için en hızlı ve en kolay bölge Cuvier kanal sarısı sac (şekil 1, film 1) ön kısmında bulunan oldu. Enjeksiyonları, bu sitede önemli yapıları yaralanma daha düşük bir risk daha yüksek birimleri tanıtımıyla izin. Ayrıca, 24-72 hpf arasında bu bölge gelişmekte olan damarlara ve kalp11doğrudan erişmek için bir en iyi sitedir.
Parazit görselleştirme: LSFM kullanarak
8-10 dk içinde T. cruzi enjeksiyon Cuvier koli takip, parazitler Zebra balığı larva CFSE floresan sinyallerini ve larvalar optik saydamlığını nedeniyle LSFM kullanarak tespit edilmiştir. Aşı sonra parazit ya da dolaşım sistemi veya kan akımı (Şekil 2, şekil 3) yönünde seyahat etrafında duvarlar yapıştırılır tespit edildi. Bir parazit Atriyoventriküler kapak gibi bir kalp yapısına bağlı kalır zaman kalp kasılma, parazitler ve bağlılık için moleküler mekanizmalar bizim omurgalı modelinde (film 2, film 3 etkili olabileceğini gösteren ile olsun Tamamlayıcı film 1). T. cruzi da daha sonra emilir ve Zebra balığı bağırsak22parçası haline bir yapı larva sarısı sac ( Şekil 2, Film 2), duvarlar için yapıştırılır. Bu parazitler nerede bulunur cardiomyocytes ve sindirim sinir sistemi23,24sırasında enfekte insanlar, kronik hastalık aşamasında neler için benzer olabilir. Ne zaman bağlı değil, eritrositler ( şekil 3, Movie 4) olarak aynı yönde kan akımı yoluyla parazitleri sürüklendi. Parazitler balığın farklı büyüklükteki gemiler gözlenen ama Perikardiyal uzayda ve kan akımı ( Şekil 2, şekil 3, tamamlayıcı film 2) içeren bitişik sarısı bölgesinde daha bol.
10 dk sonrası enjeksiyon kendi dağıtım damarlara ve sitelere hızlı bir şekilde ekran farklı anatomik LSFM (40 X büyütme, görüş bir sınırlı alanı nedeniyle balıkların bir yetersizlik nedeniyle parazit spot tek formlara daha zor ). 24 saat sonra enjeksiyon (HPI) sonrası, CFSE sinyal gelişmekte olan bağırsak (ek şekil 1) yakınındaki bölgede toplamaya başlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig1.jpg"> 
Şekil 1: En iyi enjeksiyon izi. Larva 48 görüntüsünü(a)normal bir stereoscope kullanarak en uygun enjeksiyon yerinde Cuvier (sarı ok) kanal gösterilen hpf. (B) Magnified kutusunun içinde bir gösterilen Cuvier (sarı ok) kanal görüntüleyin. Ölçek çubuğu = 200 µm (A), 50 µm (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig2.jpg"> 
Resim 2: 48 hpf larva statik bir parazit görüntülerini LSFM. T. cruzi parazit (sarı ok) yumurta sarısı sac, hızlandırılmış sıra boyunca duvarlara yapıştırılan kalır (7,2 s, 17,2 s ve 27,2 s), yaklaşık ~ 15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Parazit konumunu bir değişiklik yok en az 30 Alım döneminde gözlenen s. a, Atrium; v, ventrikül. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig3.jpg"> 
Şekil 3: LSFM kullanarak Perikardiyal uzayda seyahat bir parazit yörüngesini. T. cruzi parazit-ebilmek var olmak izci kan akımı (kırmızı ile gösterilen parça) yönünü takip (PS), Perikardiyal uzayda sürüklenen sırasında yaklaşık ~ 15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov1.jpg"> 
Film 1: kan dolaşımı Vadisi bir larva 48 yumurtalı hpf. Bir larva 48 film kan dolaşımını Vadisi veya düzenli bir stereoscope kullanarak Cuvier kanal gösterilen hpf. Farklı bölgelerde kanalı dolaşan kırmızı kan hücreleri göstermek için video sırasında odaklandık. Sarı ok en uygun enjeksiyon yeri gösterir. Film kaydedildi yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_1.mp4" target="_blank">Video indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov2.jpg"> 
Film 2: T. cruzi parazitler bağlı sarısı sac duvarlar için. LSFM film bir larva 48 hpf gösteren T. cruzi parazitler parazit enjeksiyon sonra yumurta sarısı sac yaklaşık 10-15 dk yapıştırılır kalır. Parazit konumunu bir değişiklik yok en az 30 Alım döneminde gözlenen s. a, Atrium; v, ventrikül. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_2.mp4" target="_blank">Video indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov3.jpg"> 
Film 3: T. cruzi parazitler bağlı kalp duvarlarının. Bir larva 48 LSFM film hpf bu T. cruzi parazitler remai gösterilenn şeklinde olması gereken kalp-damar duvar, güçlü kalbin kasılma rağmen yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. Eritrositler siyah yuvarlak gölgeler görülebilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_3.mp4" target="_blank">Video indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov4.jpg"> 
Film 4: Perikardiyal alanda taşımak parazitler. Perikardiyal uzayda sürüklenen bir larva 48 hpf gösteren T. cruzi parazit LSFM film. İki parazit farklı zaman noktalarda (kimlik numarası 1, kırmızı daire ve sarı daire içinde kimliği 2), benzer bir yörünge takip takip edilebilir. Film kaydedildi yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_4.mp4" target="_blank">Video indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı şekil 1: CFSE birikimi floresan sinyal sarısı. Stereoscope 48, enjekte wildtype larva görüntülerini hpf Cuvier kanalı. Sonra iki gün enjeksiyon (48 HPI) sonrası CFSE floresan sinyal giderek sarısı içinde birikir. Ölçek çubuğu 500 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_figure_1.tif" target="_blank">rakam indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film 1: parazit bağlı duvarlar ve dolaşım sistemi valfleri. Stereoscope zaman serisi görüntüleri 48, enjekte bir vahşi türü larva hpf. Görüntüleri T. cruzi parazitler senkronizasyonu kalp kası kasılmalar Atriyoventriküler Vana ile hareket yakalama 0.2 s aralıklarla alınır. Film yaklaşık 30 dk sonra parazit enjeksiyon kaydedildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_movie_1.mp4" target="_blank">Video indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Movie 2: hareketli ve yapıştırılan parazitler periventriküler alanı ve sarısı. LSFM film sürüklenen veya Perikardiyal boşluk veya sarısı şeklinde olması gereken bir larva 48 hpf gösteren T. cruzi parazit. İletilen ışık görünümü için ilk 5 gözlendi s. Floresans görünümü 5.2-25,8 s ile gözlenmiştir. Film kaydedildi yaklaşık 10-15 dakika sonra parazit enjeksiyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_movie_2.mp4" target="_blank">Video indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Bu prosedürün genel amacı, Trypanosoma cruzi motilitesini incelemek için zebra balığını bir in vivo model olarak kurmaktır. Trypanosoma cruzi, Chagas hastalığına neden olan parazittir. Bu, temel olarak Latin Amerika'da ve Amerika Birleşik Devletleri'nin bazı bölgelerinde vektör aracılığıyla bulaşan, ihmal edilmiş bir tropikal hastalıktır.Parazit, enfeksiyöz kısmı içeren vektör dışkısı yoluyla insana bulaşır ve ardından konak hücrelerinde çoğalır. Kamçı hareketi, parazitin vücut içinde hareket etmesini sağlar. Ancak bu hareket, hücresel istila sırasında tutunma için de gereklidir.Trypanosoma cruzi ile oluşturulan in vivo enfeksiyon modelleri temel olarak kemirgenlerde gerçekleştirilmektedir. Dokuların opaklığı, parazitin hayvan içindeki takibini zorlaştırmaktadır. Parazit motilitesi şu ana kadar sadece in vitro olarak çalışılmıştır; bu nedenle, bir in vivo model, akış koşulları altında parazit hareketinin temel yönlerinin anlaşılmasını sağlayacaktır.Alternatif bir model ararken zebra balığı larvalarına rastladık. Zebra balığı larvaları, konakçı-patojen etkileşimlerini in vivo olarak incelemek için güçlü bir modeldir. Farelere kıyasla küçük, ucuz ve yetiştirilmeleri oldukça kolaydırlar.Çalışmamız için çok önemli olan nokta, bağışıklık sistemlerinin insanlara çok benzer olmasıdır. Adaptif bağışıklık sistemleri döllenmeden sonraki dört güne kadar gelişmeye başlamaz ve ondan sonraki dört hafta boyunca olgunlaşmaya devam eder; bu da bize bağışıklık müdahalesi olmadan çalışmak için oldukça geniş bir zaman penceresi sunar. Bununla birlikte, zebra balığının çalışmamız için sağladığı en büyük avantaj optik şeffaflığıdır.Bu durum, onu mikroskobik tarama ve görüntüleme için ideal bir model haline getirir. Bu özellik, balığı genetik olarak manipüle etmek için kullanılan tüm teknikler ve mevcut tüm transgenik ve mutant hatlarla birleştiğinde, çalışma için gerçekten birçok olanak sunar. Bu videoda, pigmentasyonu olmadığı için tamamen şeffaf olan Casper hattının mutant larvalarının, T.cruzi parazitlerini in vivo görüntülemek için nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz.Bu zebra balıklarının iç kısımlarını görüntülemek için ışık sayfası floresan mikroskopisini kullanıyoruz. Işık sayfası floresan mikroskopisi, yalnızca deteksiyon objektifinin odak düzlemini aydınlattığınız bir teknikler ailesidir. Bunun sonucu olarak, ön planda veya arka planda ışık bulunmaz ve bu durum, embriyolarınızın derinliklerinde bile net ve keskin görüntüler elde edilmesini sağlar.Numunenin yalnızca ilgilendiğiniz kısmı aydınlatıldığı için numunenizde çok daha az fotootarar oluşur ve bu da uzun süreler boyunca videolar çekebilmenize olanak tanır. Burada, zebrafish larvalarının içindeki canlı T.cruzi parazitlerini görselleştiriyoruz. Işık sayfasının doğası, konfokal mikroskoplara kıyasla güzel uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip yüksek hızlı videolar çekmemize imkan sağlamaktadır.Bildiğimiz kadarıyla, canlı Trypanosomalar canlı bir organizma içerisinde hiçbir zaman görüntülenmemiştir. Toplam yumurta üretimini artırmak için enjeksiyonlardan üç gün önce, sağlıklı erkek ve dişi balık çiftlerini veya bir erkek ve iki dişiyi üretim tanklarında çiftleşmeye bırakın. Metin protokolünü takip ederek, dökülen yumurtaları küçük bir süzgeç yardımıyla toplayın.Süzgeci ters çevirip yumurta suyunu süzgeç aracılığıyla bir Petri kabına dökerek yumurtaları yıkayın. Embriyoların sağlıklı kalması için, bir transfer plastik pipeti ile herhangi bir kalıntıyı veya döllenmemiş yumurtaları temizleyerek sularını arındırın. Ardından, embriyoları 28 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin ve canlı olmayan yumurtaları ayıklayıp yumurta grubunu sağlıklı tutmak için temizleme işlemini her üç saatte bir tekrarlayın.Döllenmeden 48 saat veya iki gün sonra, embriyoların çoğunun yumurtadan çıktığını kontrol edin. Ancak, gerekirse, stereoskop altında iki adet sivri pensle korionun karşı uçlarını tutun ve korionu yırtarak açmak için bir uçtan nazikçe çekerek dekoryonasyon işlemini gerçekleştirin. Korionu sudan uzaklaştırmak için bir transfer pipeti kullanın.Enjeksiyon için öncelikle, ince duvarlı cam kapilerler ve bir mikropipet polar cihazı kullanarak bir milimetrelik iğneler hazırlayın. Mühürlenmiş iğneleri bir Petri kabı içinde, bir modelleme kili şeridi üzerinde saklayın. Mikroenjeksiyon kalıbını oluşturmak için, distile su içinde %1,5'lik agaroz çözeltisi hazırlayın ve bunu bir Petri kabına dökün.Ardından, önceden hazırlanmış bir larval mikroenjeksiyon kalıbını agarozun üzerine yerleştirin ve düz bir yüzeyde oda sıcaklığında tamamen katılaşmasını bekleyin. Mikroenjeksiyon kalıbını kaldırın ve dört derece santigrat sıcaklıkta saklamak için su ekleyin. Bu, agarozun kurumasını önler.Yumurta suyunu, 150 mg/L nihai konsantrasyon elde edecek şekilde uygun hacimdeki Tricaine stok çözeltisine ekleyerek anestezi çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Son olarak, görüntüleme için düşük erime noktalı agaroz tozunu yumurta suyunda %1 nihai konsantrasyona ulaşana kadar çözerek düşük erime noktalı agaroz stoğu hazırlayın. Karışımı agaroz çözeltisi homojen görünene kadar ısıtın ve alikotları 1,5 mL'lik reaksiyon tüplerinde 4 °C'de saklayın.Parazitler, Trypanosoma cruzi 01/DA izolatından elde edilir ve T25 flasklar kullanılarak tamamlayıcı besiyeri ile desteklenmiş bir insan astrositom hücre hattında kültüre edilir. Üç veya dört günlük kültürün ardından parazitler hücrelerden dışarı çıkar ve trypomastigote'lar süpernatanttan toplanabilir. Bu süpernatantı beş dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti fetal dana serumu içeren 1X PBS içinde nazikçe yeniden süspande edin.Ardından beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı uzaklaştırın ve 1 ml PBS içinde yeniden süspande edin. Bir Neubauer odasında serbest yüzen parazitleri saymak için 10 µl alın. Yeniden süspande edilen parazitlerin geri kalanını alın, 1 µl CFSE ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Ardından, 10 mililitreye tamamlamak için PBS ekleyin. Beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atın ve işaretlenmiş parazitleri içeren peleti 100 microliters PBS içinde yeniden süspanse edin. Bu işaretleme prosedürünün ardından, parazitlerin hayatta olduğunu ve uygun şekilde işaretlendiğini bir ters floresans mikroskobunda parazitleri doğrudan gözlemleyerek kontrol etmek önemlidir.Geçirgen ışık modunda, parazitlerin hareket ettiğini kontrol edin. Floresan modunda, parazit etiketlemesini değerlendirmek için FITC filtresini kullanın. İlk olarak, parazitleri içeren çözeltiden 10 µL'yi bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak mühürlü cam iğneye yükleyin.Ardından, cam iğneyi mikromanipülatörün iğne tutucusuna yerleştirin. Stereoskop altında, ince pens kullanarak iğnenin ucundan yaklaşık beş milimetre kesin. Sonrasında, döllenmeden 48 saat sonraki larvaları, dokunmaya yanıt vermeyene kadar bir Tricaine çözeltisi içinde anesteziye tabi tutun.Larvayı stereoskop altında, agaroz plakada yan pozisyonda yerleştirin. Mikromanipülatörü, iğnenin ucunun larvanın vitellus merkezinde olacak şekilde ayarlayın. Mikroenjektör parametrelerini belirleyin.Balığı vitellüsün kan dolaşım vadisinden enjekte edin. Kalbin attığını kontrol edin ve iyileşmesi için larvayı derhal taze yumurta suyuna aktarın. Enjekte edilen embriyoyu boş bir Petri kabına aktarın ve çevresindeki suyu plastik bir pipet ve emici kağıt yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın.Embriyoyu kaplamak için önceden ısıtılmış %1 düşük erime noktalı agarozdan yaklaşık 100 µL hemen ekleyin. Agarozun 40 °C'yi geçmediğinden emin olun. Cam bir kılcal borunun içine düz bir tel yerleştirin ve embriyoyu dikey konumda almak için teli bir piston olarak kullanın.Bu işlem, agaroz katılaşmadan önce hızlıca yapılmalıdır. Agarozu emerken, embriyonun üzerinde bir miktar agaroz bıraktığınızdan emin olun ve katılaşana kadar bekleyin. Gerekirse, embriyonun altındaki fazla agarozu dışarı iterek kesin.Numune haznesini Trikain çözeltisiyle doldurun ve numune haznesi sıcaklığını 28 °C olarak ayarlayın. Ardından, embriyoyu içeren kılcal boruyu mikroskop numune tutucusuna yerleştirin ve mikromanipülatör tablasına yerleştirin. Embriyonun bulunduğu uç, serbestçe sarkana kadar dışarı itin.Geçirgen ışık modunda, bir XYZ mikromanipülatör sistemi ve numuneyi dikey eksen etrafında döndürmek için bir rotasyon tablası kullanarak numuneyi deteksiyon objektifinin pupili önüne yerleştirin. Öncelikle kılcal borunun kenarına odaklanmak, ardından embriyoyu ve kalp veya damarlanma gibi ilgi çekici yapıları bulmak için ilerlemek faydalıdır. Şimdi 488 nanometre veya benzer dalga boylu bir lazer kullanarak floresan moda geçin; fotobeyazlamayı azaltmak ve zaman çözünürlüğünü optimize etmek için aydınlatma şiddetini ve pozlama süresini ayarlayın.Bunun için, yüksek sayısal açıklığa sahip bir objektif seçilmelidir. İlgi bölgesinin video kaydına başlayın. Bizim durumumuzda, parazitlerin kapakçıklara tutunmuş halde ve kalp çevresinde serbestçe hareket ederken gözlemlendiği görülmektedir.Zaman içinde tek bir düzlemin videosunun çekilmesi veya farklı düzlemlere odaklanmak ve parazit hareketini takip etmek için mikromanipülatör ile Piezo ve galvo sisteminin kullanılması önerilir. Görüntüleme tamamlandığında, embriyoyu ince pens ve bir kıl döngü aracı kullanarak agarozdan dikkatlice çıkarın. Balığı tekrar taze yumurta suyuna aktarın ve 15 dakika boyunca toparlanma durumunu kontrol edin.Ardından, kurumunuzun standart protokollerine uygun olarak imha edin. Burada sunulan tüm prosedürler için döllenmeden 48 saat sonraki embriyolar kullanılmıştır. Paraziti inoküle etmek için farklı anatomik bölgeler kullanılabilir; ancak vitellus kesesinin kan dolaşım vadisi veya Cuvier kanalı, kardiyovasküler sisteme erişmek ve enjeksiyon yapmak için en hızlı ve en kolay bölgedir.Trypanosoma cruzi'nin Cuvier kanalına enjeksiyonundan sonraki sekiz ila 10 dakika içinde, parazitler gelişmekte olan kardiyovasküler sistemde gözlemlenir. Bazı parazitler, embriyonik vitellus kesesinin duvarlarına veya atriyoventriküler kapak gibi kalp yapılarına tutunmuş halde kalır. Parazitlerin kalp kasılmalarıyla birlikte salındıkları görülür; bu durum, onların etkili adezyon mekanizmasını kanıtlamaktadır.Ayrıca, perikardiyal boşlukta ve kan damarlarında, eritrositlerle aynı yönde kan akışıyla birlikte sürüklenen parazitler görülmektedir. Geliştirdiğimiz yöntem, şeffaf zebrafish larvaları içinde T.cruzi parazitlerinin in vivo gözlemine olanak tanımaktadır. Bu durum, canlı bir omurgalı organizmadaki kan ve kalp yapıları boyunca hareketlilik gibi bir patojenin dinamiklerini görselleştirmek ve analiz etmek için oldukça faydalı olabilir.Serbest yüzen paraziti gözlemleyebilmek için enjeksiyon ile görüntüleme arasındaki sürenin kısa tutulması önemlidir. Ayrıca, fotohasararı azaltırken yüksek kaliteli görüntüler elde edebilmek için light sheet mikroskobu kullanılırken görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesi kritik önem taşır. Zebrafish larvalarına T.cruzi mikroenjeksiyonu, paraziti kan dolaşımına aşılamak için etkili bir tekniktir.Bu yöntemde, parazitin balık içerisindeki net bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanıyan pratik bir prosedür olarak CFC işaretlemesini gördünüz. Cuvier kanalına yapılan enjeksiyon, parazitlerin dolaşıma girmesini sağlamanın nazik bir yoludur. T.cruzi, balığın kalp kapakçıklarına ve büyük damarlarına tutunma eğilimindedir.Ancak deneylerimize göre, hücresel enfeksiyon mevcut değildir. Tropizmini aydınlatmak için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir.

establishment-larval-zebrafish-as-an-animal-model-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri,...

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Video, zebra balığı larvalarının kaçınma ve timotaksis testini anlatıyor. Video, zebra balığı larvalarının görsel caydırıcı uyarana yanıt olarak davranışlarını inceler.

Zebra Balığı Kaçınma ve Timotaksis Deneyi: Caydırıcı Görsel Uyarana Yanıt Olarak Larva Davranışını İncelemek İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Keşfedin, Trypanosoma cruzi hareketliliğini in vivo olarak araştırmak için şeffaf zebra balığı larvalarının nasıl kullanıldığını. Işık levhası floresan mikroskobisi ile parazitlerin canlı görüntülenmesi sağlanır.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Daha fazla video keşfet