Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Bu floresan görüntüleme tekniğinin genel amacı, temel durum tükenme mikroskobu ve bireysel molekül dönüşü adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi formu kullanarak sabit hücrelerdeki hücresel proteinleri alt kırınım sınırlı çözünürlükte görselleştirmek ve ölçmektir. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve zar biyofiziği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur, çünkü araştırmacıların hücresel proteinlerin dağılımını daha kesin bir şekilde tanımlamasına, görselleştirmesine ve nicelleştirmesine yardımcı olan kırınım sınırlı çözünürlüğü atlar. Bu protokolün temel avantajı, konfokal mikroskopi gibi geleneksel floresan mikroskopi görüntüleme yaklaşımlarına göre çözünürlükte yaklaşık on kat iyileşme ile görüntülerin elde edilmesini sağlamasıdır.

Prosedürü gösterenler, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Oscar Vivas ve Rose Dixon'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olan Karen Hannigan olacak. Başlamak için, kapak fişlerini ve hücreleri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Daha sonra numuneleri sabitleyin ve ilgilenilen plazma zarını ve/veya hücre içi zar proteinlerini etiketlemek için immünositokimya yapın.

Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 12.5 mikrolitre katalaz stok çözeltisi, 3.5 miligram glikoz oksidaz ve 0.5 mikrolitre bir molar Tris'i 49.5 mikrolitre PBS'ye ekleyerek oksijen tutucu Glock çözeltisini hazırlayın. Tüpü kapatın ve bileşenleri çözmek için kısaca girdaplayın. Ardından çözeltiyi üç dakika santrifüjleyin.

Şimdi, beta-merkaptoetilamin çözeltisini PBS içinde 100 milimolar konsantrasyona çözerek foto geçişi indükleyen tiyal çözeltiyi hazırlayın ve pH'ı 8.0'a değiştirin. Thial solüsyonu ayırın ve bir haftaya kadar dondurucuda saklayın. Görüntülemeden hemen önce, tiyal ve oksijen süpürücü bileşenleri bir tuzlu su tamponu ile karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın.

Hazırlanan fotoğraf değiştirme tamponunun 100 mikrolitresini kullanarak, lekeli hücreler içeren kapak fişlerini çöküntü slaytlarına monte edin. Ardından, görüntüleme tamponunun hızlı oksidasyonunu önlemek için kapak kaymasının kenarlarını silikon bir yapıştırıcı ile kapatın. Görüntülemeden önce silikon yapıştırıcı tamamen kürlenene kadar birkaç dakika bekleyin.

Aksi takdirde, kapak fişi kayacaktır. Başlamak için, seçilen florofora bağlı olarak numuneyi aydınlatmak için uygun bir lazer seçin. Alexa 647 florofor için 642 nanometre lazer kullanın.

Ardından, uygun dikroik görüntüleme küpünü ve objektif lensi seçin. Görüntüleme yazılımını açın. 2D çekim modunu seçin ve ardından pozlama süresini 11 milisaniye olarak ayarlayın.

Ayrıca, EM Kazancını 300 olarak ayarlayın ve uygun bir algılama eşiği seçin. Ardından, Otomatik Olay Kontrolü'nü açın ve Görüntü Başına Olay sayısını sekiz olarak ayarlayın. Piksel Boyutunu 20 nanometre olarak girin.

GSD Araçları sekmesinde, Yüksek Çözünürlüklü Görüntü Hesaplama seçeneklerine gidin ve Histogram Modu'nun seçili olduğundan emin olun. Plazma zarındaki proteinleri görüntülemek için TIRF modunu seçin ve penetrasyon derinliğini belirlemek için geliş açısını değiştirin. Ardından, elektronları karanlık duruma göndermek için lazer yoğunluğunu %100'e ayarlayın.

Ardından, pompalama sırasında Tek Molekül Algılama'yı seçin ve çerçeve korelasyonu 0,20 olduğunda otomatik olarak alacak şekilde ayarlayın. Alım için lazer yoğunluğunu %50'ye ve alım karesi sayısını 60.000'e ayarlayın. Ardından fotoğraf çekmeye başlayın.

Protein kümesi boyutunu ölçmek için, 10 nanometre histogramlı tek molekül lokalizasyon haritasının görüntü dosyasını ImageJ'de açın. Görüntü menüsünde, Ayarla'ya gidin ve görüntünün parlaklığını ve kontrastını optimize etmek için Otomatik seçeneğini kullanın. Ardından, Tür menüsü altında 8 bit'i seçin.

Ardından, Analiz menüsünü açın, Ölçeği Ayarla'ya tıklayın ve burada gösterilen değerleri girin. Ardından, Analiz menüsünde Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan seçeneğinin yanındaki kutuyu işaretleyin. Görüntü menüsüne geri dönün, Ayarla, Eşik'i seçin ve ardından Üst/Alt'ı seçin.

Maksimum değeri 255'e, minimum değeri bire getirin ve Uygula'yı tıklayın. Son olarak, Analiz menüsünü açın ve Parçacıkları Analiz Et'i seçin. Piksel birimleri, Sonuçları görüntüle ve Özetle'yi seçmek için bir onay işareti koyun.

Ardından boyutu dört ila sonsuz olarak ayarlayın, Çıplak Anahatlar seçeneğini belirleyin ve Tamam'a tıklayın. Burada görüntülenen hücre, endoplazmik retikulum proteini, mCherry-Sec61 beta ile transfekte edildi ve TIRF modunda hem fraksiyon sınırlı TIRF mikroskobu hem de süper çözünürlüklü GSD mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Bu eğriler, ER tübüllerinin çapını temsil eder. Sağdaki resim, yanal çözünürlükte bir iyileşmeyi gösterir ve ER tübüllerinin yapısının daha doğru bir temsilini temsil eder.

Süper çözünürlüklü GSD görüntülemenin sunduğu çözünürlükteki iyileşme, bir anti-CAV 1.2 antikoru ile etiketlenmiş bir kardiyak miyositi gösteren bu görüntülerde daha da gösterilmiştir. GSD modunu kullanarak, yanal çözünürlükteki iyileşme belirgindir ve ayrı kanal kümelerinin tanımlanması daha kolaydır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol üç günden daha kısa sürede tamamlanabilir.

Tek bir hücrenin süper çözünürlüklü görüntülemesi, gereken kare sayısına bağlı olarak 10 ila 30 dakika sürer. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen floresan proteinin karmaşık hücresel çevre ile nasıl etkileşime girdiği gibi ek soruları yanıtlamak için elektromikroskopi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, temel durum tükenmesini ve ardından bireysel molekül dönüşünü kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi için bir veya daha fazla hücresel proteini görselleştirmek için örneklerin nasıl hazırlanacağını, elde edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.