Name: Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde plazma ve hücre içi membran proteinlerini GSD süper çözünürlüklü mikroskopi ile görüntülemeyi. Bu yöntem, protein dağılımını on kat daha yüksek çözünürlükte nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser AHA bir hibe için R.E.D. (15SDG25560035) tarafından desteklenmiştir. Yazar Dr Fernando Santana için kullanma-in onun Leica SR GSD 3D mikroskop ve Dr. Johannes cehennem tür FP1 antikor sağlamak için kabul etmek istiyorum.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Kırınım sınırını aşan görüntüleme sağlayan teknolojileri son patlama teklif var yeni windows memeli hücre uzay ve zaman içinde sinyal karmaşıklığı içine. Bu teknolojiler fırtına, STED, PALM, GSD, SIM ve onların türevleri (örneğin, dSTORM, FPALM) içerir. Bilim adamları bu teknikleri arkasındaki marifet ışığın kırınım yöneten fizik yasaları tarafından uygulanan sınırlamaları aşmak bize izin verdi. Bu büyük başarı rağmen bu tekniklerin herbirini bir uzlaşma süper çözünürlük elde etmek için yapar ve, gibi kendi sını...

Hücresel sinyal reaksiyonlar hücresel yanıt başlatmak için iç ve dış ortamlar değiştirme çevirmek. Onlar insan fizyolojisi, hormon ve nörotransmitter yayın, kalp atışı, görme, gübreleme ve bilişsel işlev için temel olarak hizmet veren tüm yönlerini düzenleyen. Bu sinyal cascades bozulma patofizyolojik koşulları kanser, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi şeklinde ciddi sonuçlar doğurabilir. On yıllardır, biyolojik ve tıbbi araştırmacılar başarıyla floresan proteinler, sonda ve birincil araç olarak Floresans mikroskobu ile birleştiğinde biyosensörler kesin zamansal ve mekansal organizasyonu bunlar hücresel anlamak için kullanmıştır sinyalleri.
Epifluorescence, confocal, veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi gibi optik teknikleri güçlü onların duyarlılık, hız ve büyük sınırlama ise canlı hücre, Imaging ile uyumluluk vardır onların kırınım-sınırlı çözünürlük, anlam yapıları veya protein kompleksleri 200-250 nm küçük çözümlenemiyor. Teorik ve pratik geliştirme deterministic süper çözünürlük ile (örneğin, uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED1), yapısal aydınlatma mikroskobu (SIM2) veya Stokastik süper çözünürlük (Örneğin , photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM3) veya zemin durumu tükenmesi (GSD4,5)), Floresans mikroskobu yanal ve eksenel çözünürlüğünde genişletmiştir kırınım bariyer için sırayla of nanometre onlarca. Böylece, müfettişler şimdi görselleştirmek ve nasıl protein dinamikleri ve organizasyon çevirir moleküler seviyede işlevine anlamak içineşsiz bir yetenek var.
Bilindiği gibi tek tek molekül dönüş takip zemin durumu tükenmesi mikroskobu (GSDIM) veya sadece GSD kırınım sınırı aynı anda fluorophores4,5yayan sayısını azaltarak kaçınmanızı sağlar. Yüksek enerjili lazer ışık fluorophore etiketli örnek, fotonlar ile elektron bombardımanı ve onlar bir 'spin-flip' geçmesi ve üçlüsü veya 'karanlık-devlet' heyecanlı devlet4girin olasılık artan heyecanlandırmak için kullanılır. Bu etkili bir şekilde yere devlet depletes, dolayısıyla adı 'devlet tükenmesi yer'. Üçlü devlet fluorophores fotonlar yayarlar değil ve örnek dimmer görünür. Ancak, bu fluorophores stochastically zemin durumuna döndürün ve birkaç foton üçlüsü durumuna geri dönmeden önce karaya heyecanlı durum geçişlerini yayan gidebilirsiniz. Daha az fluorophores herhangi bir zamanda verilirken ile bireysel fluorophores fluorophores komşu dağınık şekilde ve geçici ayrı haline gelen foton patlamaları yayılan. Fotonlar patlama hesaplanan centroid hangi lens için kullanılan ışığın dalga boyu sayısal diyafram (NA) bağlı bir yerelleştirme hassasiyetle fluorophore konumla örtüşen bir Gauss fonksiyonu ile uygun olabilir uyarma ve en önemlisi, fluorophore yayılan fotonlar sayısı. Bir GSD yalnızca bir alt kümesini fluorophores aktif olarak herhangi bir zamanda yayar beri görüntüleri binlerce bir tam yerelleştirme harita oluşturmak için birkaç dakika üzerinden toplanan gerekir, kısıtlamasıdır. Yüksek lazer güç gereksinimi ile birlikte uzun satın alma zaman GSD daha iyi yerine canlı örnekleri sabit için uygun olduğu anlamına gelir.
Bu makalede açıklar süper kararlılık mikroskobu düşsel membran ve endoplazmik retikulum (ER) sabit örnekleri hazırlanması-ikamet proteinler (için gerekli sarf malzemeleri ve reaktifler bkz: Malzemeler tablolistesi). Nasıl bu protokolü kolayca boyutu ve L-tipi voltaj Ca2 + kanal (Cav1.2) kardiyak miyositler sarcolemma içinde kümeleme derecesi ölçmek için uyarlanmış veya acil servis hücresel dağılımını görselleştirmenizi kullanılan örnekler, içinde gösterilen. Bu hücresel bileşenleri organizasyonu ve dağıtımı anlama başlatılması, çeviri ve sonuçta birçok Ca2 +işlevini anlama önem-bağımlı sinyal cascades. Örneğin, Cav1.2 kanalları temelde uyarma-kasılma kaplin, belki de en her yerde sinyal cascade memeli hücrelerinde olmakla birlikte reseptör aracılı Ca2 + serbest bırakmak--dan acil servis için önemlidir.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Kapak camı</td></tr> <tr><td># 1.5 kapak camını temizlemek için 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td> <td>Hücreleri büyütmek/işlemek / görüntülemek için</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Deiyonize su ile 1x'e seyreltin</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P4832</td> Cam laminini <td>kaplamak için hücre yapışmasına yardımcı olur</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>Camı kaplamak için hücre yapışmasına yardımcı olur</td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Ventriküler miyosit kültür ortamı</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal sığır Serumu (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Medya ek</td></tr><tr><td>% 0.05 tripsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Hücre kültürü çözeltisi</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Geçici transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Ca2 + içermeyen PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>% 100 Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Hücre Fiksasyonu</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskopi Bilimleri</td><td>15710</td><td>Hücre Fiksasyonu</td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Hücre Fiksasyonu</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA veya diğer engelleme çözümü alternatifleri mevcuttur</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Hücrelere nüfuz etmek için deterjan</td></tr><tr><td>Tavşan anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Hediye</td><td>Yok</td><td>Alomone Labs Rb, anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr> <tr><td>Fare monoklonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td> gibi ticari anti-CaV1.2 antikorları mevcuttur.<td>200-301-379</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-tavşan IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td> <td>A31573</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG (H + L)</td> <td>İnvitrojen (Thermo Scientific)</td> <td>A11031</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Numunelerin uzun süreli depolanması için mikrobiyal büyümeyi önler</td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Foto anahtarlama tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Glikoz oksidaz</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Foto anahtarlama tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Fotoanahtarlama tamponu bileşeni</td></tr><tr><td>beta-Merkaptoetilamin hidroklorür</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Foto anahtarlama tamponu bileşeni</td></tr> <tr><td>ve beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Foto anahtarlama tampon bileşeni</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Foto anahtarlama tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Foto anahtarlama tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Cam Depresyon slaytları</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Numuneleri monte etmek için</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Kapak camını kapatmak için</td></tr><tr><td>sec61&beta;- mCherry plazmid</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>PBS'de yıkama<td>bloğu çözeltisi</td><td></td><td></td><td>%20 SEAblock</td></tr><tr><td>Birincil antikor inkübasyon çözeltisi</td><td></td><td></td><td>%0.5 Triton-X100, %20 SEAblock, PBS İkincil</td></tr><tr><td>antikor inkübasyon çözeltisinde</td><td></td><td></td><td>PBS'de 1:1000</td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Floresan mikroskopi ve hücre biyolojisi gelişmeler yakından ilişkili mısınız, gelişmiş ile hücresel olaylar sık sık nasıl bizim anlayış ve dramatik sanattaki önde gelen görselleştirmek için yetenek hücreleri işlev. Geliştirme ve süper çözünürlük mikroskobu kullanılabilirliğini önemli ölçüde genişletmiştir optik çözünürlük sınırları ~ 250-20 nm. Biyologlar artık moleküler etkileşimleri açısından sınırlı kırınım alanı içinde colocalization açıklayan sınırlıdır, daha doğrusu artık bireysel moleküllerin dinamik etkileşimleri görselleştirmek mümkündür. Burada, görselleştirme ve proteinlerin miktar için bir protokol tarafından zemin-devlet tükenmesi mikroskobu sabit hücre görüntüleme için anahat. Biz iki farklı membran proteinlerinin, endoplazmik retikulum translocon, sec61β ve bir plazma zarı lokalize voltaj L tipi Ca2 + kanal (CaV1.2) unsuru örnekler sağlar. Tartışılan belirli mikroskop parametreleri, fiksasyon yöntemleri, fotoğraf geçiş arabellek formülasyonu ve tuzaklar ve görüntü işleme zorlukları vardır.

Giriş bölümünde de belirtildiği gibi birçok farklı süper çözünürlük mikroskobu görüntüleme yöntemleri vardır. Bu iletişim kuralı, GSD süper kararlılık düşsel üzerinde duruluyor. Temsili resim ve yerelleştirme haritalar Şekil 2 ve şekil 3' de gösterilmektedir.
Şekil 2 ER protein, mCherry-Sec61β ve işlenmiş yukarıda açıklanan yöntemi kullanar...

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Bu floresan görüntüleme tekniğinin genel amacı, temel durum boşaltma mikroskobu ve tekil molekül dönüşü olarak adlandırılan bir süper-çözünürlüklü mikroskopi türünü kullanarak, fikse edilmiş hücrelerdeki hücresel proteinleri difraksiyon limitinin altındaki çözünürlükte görselleştirmek ve nicelendirmektir. Bu yöntem, araştırmacıların hücresel proteinlerin dağılımını daha kesin bir şekilde tanımlamasına, görselleştirmesine ve nicelendirmesine yardımcı olan difraksiyon limitli çözünürlüğü ortadan kaldırdığı için hücre biyolojisi ve membran biyofiziği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu protokolün temel avantajı, konfokal mikroskopi gibi geleneksel floresan mikroskopi görüntüleme yaklaşımlarına kıyasla çözünürlükte yaklaşık on kat iyileştirme ile görüntülerin elde edilmesini sağlamasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Oscar Vivas ve Rose Dixon'ın laboratuvarındaki doktora sonrası araştırmacı Karen Hannigan gerçekleştirecektir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde lamelleri ve hücreleri hazırlayın. Ardından, plazma membranını ve/veya ilgilenilen hücre içi membran proteinlerini işaretlemek için örnekleri fikse edin ve immünositokimya uygulayın.Ardından, önce 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 49,5 µL PBS içine 12,5 µL katalaz stok çözeltisi, 3,5 mg glukoz oksidaz ve 0,5 µL 1 M Tris ekleyerek oksijen tutucu Glock çözeltisini hazırlayın. Tüpü kapatın ve bileşenleri çözmek için kısa süre vorteksleyin. Daha sonra çözeltiyi üç dakika boyunca santrifüjleyin.Şimdi, beta-merkaptoetilamin çözeltisini PBS içinde 100 millimolar konsantrasyona gelecek şekilde çözerek ve pH değerini 8,0'e ayarlayarak foto-anahtarlama indükleyici thial çözeltisini hazırlayın. Thial çözeltisini alikotlayın ve dondurucuda bir haftaya kadar saklayın. Görüntülemeden hemen önce, thial ve oksijen temizleyici bileşenleri bir salin tamponu ile karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın.Hazırlanan foto-anahtarlama tamponunun 100 µL'sini kullanarak, boyanmış hücreleri içeren lamel ve kapak camlarını çukur lamlar üzerine yerleştirin. Ardından, görüntüleme tamponunun hızla oksitlenmesini önlemek için lamelin kenarlarını silikon yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirin. Görüntülemeye geçmeden önce, silikon yapıştırıcının tamamen kuruması için birkaç dakika bekleyin.Aksi takdirde, lamel kayacaktır. Başlamak için, seçilen florofora göre numuneyi aydınlatacak uygun bir lazer seçin. Alexa 647 floroforu için 642 nanometrelik bir lazer kullanın.Ardından, uygun dikroik görüntüleme küpünü ve objektif lensini seçin. Görüntüleme yazılımını açın. 2D görüntüleme modunu seçin ve ardından pozlama süresini 11 milisaniye olarak ayarlayın.Ayrıca, EM Kazancını (EM Gain) 300'e ayarlayın ve uygun bir tespit eşiği seçin. Ardından, Otomatik Olay Kontrolünü (Auto Event Control) açın ve Görüntü Başına Olay sayısını sekiz olarak ayarlayın. Piksel Boyutunu 20 nanometre olarak girin.GSD Tools sekmesinde, High Resolution Image Calculation seçeneklerine gidin ve Histogram Mode'un seçili olduğundan emin olun. Plazma membranındaki proteinleri görüntülemek için TIRF modunu seçin ve penetrasyon derinliğini belirlemek için geliş açısını düzenleyin. Ardından, elektronları karanlık duruma göndermek için lazer yoğunluğunu %100 olarak ayarlayın.Ardından, pompalama sırasında Single Molecule Detection seçeneğini belirleyin ve kare korelasyonu 0.20 olduğunda otomatik olarak veri toplama işlemini başlatacak şekilde ayarlayın. Veri toplama için lazer yoğunluğunu %50'ye ve toplama kare sayısını 60,000'e ayarlayın. Daha sonra görüntüleri almaya başlayın.Protein küme boyutunu nicelleştirmek için, 10 nanometrelik bir histogram tek molekül lokalizasyon haritası görüntü dosyasını ImageJ'de açın. Image menüsünden Adjust sekmesine gidin ve görüntünün parlaklık ile kontrastını optimize etmek için Auto seçeneğini kullanın. Ardından, Type menüsü altından 8-bit seçeneğini belirleyin.Ardından, Analyze menüsünü açın, Set Scale seçeneğine tıklayın ve burada gösterilen değerleri girin. Sonra, Analyze menüsünden Set Measurements'ı seçin ve Area seçeneğinin yanındaki kutucuğu işaretleyin. Tekrar Image menüsüne dönerek Adjust, Threshold ve ardından Over/Under seçeneklerini seçin.Maksimum değeri 255'e, minimum değeri bire getirin ve Uygula'ya tıklayın. Son olarak, Analiz menüsünü açın ve Parçacıkları Analiz Et seçeneğini belirleyin. Piksel birimleri, sonuçları görüntüle ve özetle seçeneklerini işaretleyin.Ardından boyutu dört ile sonsuz arası olarak ayarlayın, Bare Outlines seçeneğini seçin ve OK'ye tıklayın. Burada görüntülenen hücre, endoplazmik retikulum proteini mCherry-Sec61 beta ile transfekte edilmiş ve hem difraksiyon sınırlı TIRF mikroskobisi hem de TIRF modundaki süper-çözünürlüklü GSD mikroskobisi kullanılarak görüntülenmiştir. Bu eğriler, ER tübüllerinin çapını temsil etmektedir. Sağdaki görüntü, lateral çözünürlükteki iyileşmeyi göstermekte ve ER tübüllerinin yapısının daha doğru bir temsilini sunmaktadır.Süper çözünürlüklü GSD görüntülemenin sunduğu çözünürlük artışı, anti-CAV 1.2 antikoru ile işaretlenmiş bir kardiyak miyositi gösteren bu görüntülerde daha açık bir şekilde ortaya konmuştur. GSD modu kullanıldığında, lateral çözünürlükteki iyileşme belirgindir ve kanal kümelerini ayrı ayrı tanımlamak daha kolaydır. Uzmanlaşıldığında, bu protokol üç günden kısa bir sürede tamamlanabilir.Tek bir hücrenin süper çözünürlüklü görüntülemesi, gereken kare sayısına bağlı olarak 10 ila 30 dakika sürer. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen floresan proteinin karmaşık hücresel ortamla nasıl etkileşime girdiği gibi ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bireysel molekül dönüşümünü takip eden temel durum boşaltma yöntemini kullanarak, süper çözünürlüklü mikroskopi için bir veya daha fazla hücresel proteini görselleştirmek amacıyla örneklerin nasıl hazırlanacağı, verilerin nasıl elde edileceği ve nasıl analiz edileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

ground-state-depletion-super-resolution-imaging-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Burada, immünolojik sinapslar oluşturmak için cam destekli lipid çift katmanlı tekniğin, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobunun süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği ile bir kombinasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, kullanıcılara bu iki tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için gerekli talimatları sağlamaktır.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır...

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu protokol, optik foton yeniden atamalı olan dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak derin, tam hücre tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) uygulanma prosedürünü özetler; böylece özel optik veya karmaşık aydınlatmaya ihtiyaç olmadan DNA-PAINT görüntüleme mümkün olur.

Optik foton yeniden atamalı dönen disk konfokal üzerinde DNA-PAINT ile tüm hücre süper çözünürlüklü görüntüleme

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Öğrenin, memeli hücrelerinde plazma ve hücre içi membran proteinlerini GSD süper çözünürlüklü mikroskopi ile görüntülemeyi. Bu yöntem, protein dağılımını on kat daha yüksek çözünürlükte nicelendirir.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Daha fazla video keşfet