İnsan serebrospinal sıvı Endopeptidomic analiz için numune hazırlama
4 Aralık 2017
Endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) kitle spektrometrik analizi için bir yöntem sunulur. Moleküler ağırlık kesme filtrasyon, Kromatografik ön ayırma, kitle spektrometrik analizi ve peptid kimlik stratejileri sonraki bir arada istihdam ederek, yaklaşık on göre bilinen CSF peptidome genişletmek olası Önceki çalışmalar için.
Bu protokolün amacı, endojen peptitlerin LC-MS analizi için insan beyin omurilik sıvısı örneklerini hazırlamak ve analiz etmektir. LC-MS'den önce bir peptit ön fraksiyonlama adımı, tanımlanan peptitlerin sayısını arttırır ve nispeten düşük bolluktaki BOS peptitlerinin tespit edilmesini sağlar. BOS'taki endojen peptitler, kapsamlı bir şekilde araştırılmamış kalsiyum molekülleridir ve potansiyel olarak nörodejeneratif bozuklukların önemli yeni biyobelirteçlerini içerebilir. Bu yöntem, BOS peptidomunun kütle spektrometresi ile kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlar. Bu yöntemin başlıca avantajları, düşük bolluktaki BOS peptitlerinin enjeksiyonunu mümkün kılması ve multipleks izobarik etiketleme teknikleriyle uyumlu olması ve klinik çalışmalar için uygulanabilir olmasıdır. Şimdiye kadar bu yöntemi esas olarak beyin omurilik sıvısının analizine uyguladık. Ancak, küçük değişikliklerle plazma ve doku örneklerinin analizi için de kullanılabileceğini gösteren ön verilerimiz var. 1.5 mililitre BOS alikotunu silindir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında çözdürerek başlayın. Çözüldükten sonra, içeriği 10 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın. Ve tamponlama maddesi olarak 80 mikrolitre bir molar TAB ekleyin. Daha sonra protein agregatlarını çözmek için 0.65 mililitre sekiz molar guanidinyum hidroklorür ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe girdap yapın. Daha sonra, 60 mikrolitre 200 milimolar sulu TCEP'de ve 55 ° C'de inkübe edin
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, insan beyin omurilik sıvısındaki (BOS) endojen peptidlerin kütle spektrometrik analizi için bir yöntem sunmaktadır. Moleküler ağırlık kesme filtrasyonu, kromatografik ön fraksiyonlama ve kütle spektrometrik analiz kullanılarak yapılan araştırma, bilinen BOS peptidomunu önemli ölçüde genişletmekte ve nörodejeneratif bozukluklar için biyobelirteç olarak hizmet edebilecek düşük bolluktaki peptidlerin tanımlanmasını geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kütle Spektrometrisi
- Biyobelirteç Keşfi
Arka Plan
- BOS'taki endojen peptitler, nörodejeneratif bozuklukların tanımlanmasında potansiyel olarak önem taşımaktadır.
- Düşük bolluktaki BOS peptitleri kapsamlı bir şekilde çalışılmamıştır.
- Mevcut yöntemler, BOS peptidomu hakkında sınırlı veri sağlamıştır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan BOS'undaki endojen peptitlerin tanımlanmasını ve karakterizasyonunu geliştirmek.
- BOS peptidomunun daha kapsamlı bir görünümünü sağlamak.
- Nörodejeneratif durumlarda yeni biyobelirteç potansiyellerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- BOS örneklerinin ön fraksiyonasyonu ile birlikte kütle spektrometrisi.
- BOS'un 1.5 milliliter'lik alikotlarının spesifik reaktiflerle çözdürülmesini ve işlenmesini içerir.
- Multiplex izobarik etiketleme teknikleriyle uyumludur.
- Küçük modifikasyonlarla plazma ve doku örneği analizleri için uyarlanabilir.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, önceki çalışmalara kıyasla önemli ölçüde daha fazla sayıda peptidin tespit edilmesine olanak tanır.
- Temel bulgular, daha önce araştırılmamış düşük bolluktaki peptitlerin varlığına işaret etmektedir.
- Yeni biyobelirteçlerin keşfine yol açabilecek içgörüler sağlar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, BOS peptidomunun karakterizasyonuna yönelik verimli bir yaklaşım sunmaktadır.
- Yöntemin çok yönlülüğü, nörodejeneratif hastalıklar üzerine yapılacak klinik çalışmalar için yeni yollar açmaktadır.
- Nöronal mekanizmaların anlaşılması ve hastalık belirteçlerinin tanımlanması açısından potansiyel etkileri bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Bu yöntem, nörodejeneratif hastalık biyobelirteç keşfi için temel bir biyosıvı olan insan beyin omurilik sıvısındaki düşük bolluktaki endojen peptidlerin tespitini geliştirmektedir. MWCO fraksiyonasyonu ile protein karmaşıklığını azaltıp yüksek pH'lı RP-HPLC ön fraksiyonasyonu aracılığıyla peptid kapsamını artırarak, hedef doğrulama çalışmaları için analitik hassasiyeti yükseltir. Bu yaklaşım, daha derin peptidom profillemesini mümkün kılarak mekanistik risk azaltma sürecini desteklemekte; bu da MSS ilaç keşif programlarında erken evre hedef güvenilirliği ve öngörücü biyobelirteç seçimine ışık tutabilmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: CNS patofizyolojik süreçlerini yansıtan endojen peptid popülasyonlarının incelenmesine olanak tanıyarak hedef hipotez testlerini destekler.
- Operasyonel Değer: Yüksek bolluktaki CSF proteinlerinden kaynaklanan dinamik aralık girişimini azaltarak, yolak modülasyonu ile ilgili düşük seviyeli sinyal peptidlerinin tespitini iyileştirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu için tutarlı LC-MS/MS okumaları sağlayan, tekrarlanabilir peptit fraksiyonlama paternleri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Multiplex izobarik etiketleme ile uyumlu olup, biyobelirteç tarama iş akışlarında hastalık ve kontrol kohortları arasında karşılaştırmalı peptidom analizine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Nörodejeneratif hastalık mekanizmaları ile ilişkili olabilecek BOS kaynaklı peptidlerin belirlenmesi yoluyla biyobelirteç keşfini kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Küçük modifikasyonlarla plazma ve doku örneklerine uyarlanabilir; böylece translasyonel süreçlerde örnekler arası validasyonu destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, öncü bileşik tanımlama ve preklinik doğrulama aşamaları öncesindeki hipotez odaklı peptidom araştırmalarını destekleyerek, erken keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Hastalıkla ilişkili yolakları netleştirmek ve hedef seçimindeki riskleri azaltmak için endojen peptidlerin tarafsız profilini çıkarmayı destekler.
- Tarama: Azaltılmış örnek karmaşıklığı ve iyileştirilmiş kromatografik ayrıştırma yoluyla yüksek güvenilirlikli peptid tespitine olanak tanır.
- Analitik: Karşılaştırmalı çalışmalar için etiket tabanlı çoklamayla uyumlu, fraksiyon çözünürlüğüne sahip kantitatif peptid verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: BOS peptidom değişikliklerini nörodejeneratif süreçlerle ilişkilendirerek biyobelirteç uyumu için bir temel sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Temel iş akışı —MWCO filtrasyonu, yüksek pH fraksiyonlaması ve LC-MS— tekrarlanabilir peptidom analizi için laboratuvarlar arasında standardize edilebilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Peptit tanımlama verimini artırır ve mekanistik veya hastalık durumu göstergesi olarak hizmet edebilecek düşük bolluktaki türlerin tespitini sağlar.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış ön fraksiyonlama yoluyla tekrarlanabilirliği artırır ve karmaşık biyosıvı analizindeki teknik değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: BOS'taki gözlemlenebilir biyolojik alanı genişleterek hedef doğrulamadaki karar güvenini artırır.
- Portföy Etkisi: Daha geniş peptidom kapsamı ve geliştirilmiş sinyal tespiti yoluyla risk ayarlı biyobelirteç önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- CSF işleme, proteaz inhibisyonu ve kütle spektrometrisi tabanlı peptidomik alanlarında uzmanlık gereklidir.
- Enstrümantasyon, yüksek pH fraksiyonlama uyumluluğuna ve hassas peptid tespitine sahip LC-MS/MS sistemlerini içermelidir.
- Siteler arası standardizasyon; tutarlı MWCO filtre seçimi, fraksiyonlama birleştirmesi ve yazılım tabanlı tanımlama parametreleri gerektirir.
- Plazma veya dokuya adaptasyon, farklı matriks karmaşıklıklarını göz önünde bulundurarak lizis, tüketim (depletion) ve fraksiyonlama koşullarının optimizasyonunu gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, filtrasyon sırasında olası peptid kaybı ve düşük bolluktaki hedef analizleri nedeniyle dikkatli kontaminasyon kontrolü ihtiyacı yer almaktadır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
