Name: Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Keşfedin lazer kaynaklı retina hasarı modelini Danio rerio kullanarak Müller glia hücre aktivasyonunu incelemek için. Bu yöntem, canlı görüntüleme ile retinal rejenerasyon süreçlerini detaylı şekilde izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Martin Zinkernagel, MD, PhD ve Miriam Reisenhofer, doktora Federica Bisignani ve model onun mükemmel teknik yardım için kurulması, onun bilimsel giriş için teşekkür ederiz.

tüm deneylerin hayvanlar kullanım Ophthalmic ve vizyon araştırma vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) Araştırmaları Derneği için beyannameyi yapıştırılır ve hükümet yetkilileri ilgili düzenlemelerin saygı.
 1. hayvanlar <ol><li>TgBAC korumak (gfap:gfap-GFP) Zebra balığı 167 (AB) zorlanma yaşları 6-9 ay içinde su sıcaklığını 26.5 ° C ile standart koşullar altında ve 14/10 h açık/koyu döngüsü 18 arasında.</li>
	<li>Hayvan bakımı yönergeleri hayvan deneyleri için ilgili kurumların hükümet yetkilileri tarafından onaylandıktan sonra izleyin.</li>
</ol> 2. Tersine çevrilebilir sistemik anestezi <ol><li>hazırla tricaine tozu 97,9 ml su tankı ve Tris 1 m 2.1 mL 400 mg eriterek tarafından etil 3-aminobenzoate methanesulfonate tuz (tricaine) stok çözüm tamponlu tuz (TBS). PH 7,0 1 M Tris (pH 9) ve mağaza içinde bir ay karanlık ilâ 4 ° C'de uyum. 
	Not: Tricaine gibi doğal yaşam koşulları hayvanın suda hazırlanmalı, tercihen orijinal tank su kullanılmalıdır.</li>
	<li>Tank su içinde hisse senedi çözüm 1:25 sulandırmak ve hemen kullanın.</li>
	<li>10 cm Petri kabına kadar hareketsiz hale ve dış uyaranlara karşı (yaklaşık 2-5 dk, ağırlık ve yaş bağlı olarak) yanıt vermeyen 50 mL anestezi çözeltisi içeren Zebra balığı yerleştirin.</li>
	<li>Transfer her balık el ile lazer tedavisi ( şekil 1A) için bir özel silikon pim tutucu. 
	DİKKAT! Balık tank için 10 dakikaya kadar sadece dışında imzalat kalabilir.</li>
	<li>Anestezi tedavi ve/veya görüntüleme sonra tersine çevirmek için Zebra balığı su tankı içeren kapsayıcısına getirin.</li>
	<li>Kurtarma desteklemek için bir akışı taze tank su üzerinde solungaçları Zebra balığı suyun içinde ileri geri hareket ettirerek oluşturun.</li>
</ol> 3. Lazer odak yaralanma Retina üzerinde Not: A 532 nm diode lazer Zebra balığı retina üzerinde odak hafif hasar oluşturmak için kullanılır. Lazer deneysel up yetişkin Zebra balığı tekrarlanabilir bir odak retina yaralanma kurulması sağlar.
<ol><li>Lazer çıkış gücü kadar ayarla: 70 mW; hava çapı: 50 µm; darbe süresi: 100 Bayan dikkat! Uygun kişisel koruma ve bölgesinin kalbinde etiketleme lazer ışık kullanımı gerektirir.</li>
	<li>1-2 damla % 2 hydroxypropylmethylcellulose topikal tedavi öncesi gözünde uygulayabilir ve lazer hedefleyen ışın retina üzerinde odaklanmaya 2.0 mm fundus lazer lens kullanabilirsiniz. 
	DİKKAT! hydroxypropylmethylcellulose damla viskoz ve solungaçları üzerinde giderse nefes sorunlara neden olabilir.</li>
	<li>Yer dört lazer noktalar görme sinirine soldaki çevresinde göz ve doğru tedavi edilmezse göz iç kontrol kullanın.</li>
</ol> 4. Vivo Retina morfolojisi Imaging <ol><li>gün 0, Zebra balığı retina doğrudan lazer indüksiyon sonra anesteziden canlandırıcı olmadan görselleştirmek. Tüm diğer zaman puan, istihdam genel anestezi (Bölüm 2 bkz: geri dönüşümlü sistemik anestezi). Özel yapım silikon pim tutucu ( şekil 1 B, B.1) üzerinde immobilize Zebra balığı yerleştirin.</li>
	En iyi görüntü elde etmek <li>kesmek Zebra balığı göz sığdırmak için piyasada bulunan hidrojel Kontakt lens (Ø 5.2 mm, r = 2.70 mm, Merkezi kalınlık = 0.4 mm =) aracılığıyla bir delik yumruk. Objektif içbükey yüzeyi methylcellulose ile doldurmak ve kornea yerleştirin.</li>
	<li>78 D temassız slit lamba camı OCT sistemiyle teçhiz.</li>
	<li>Kızılötesi (IR) görüntünün IR içinde odak + OCT modu (fundus göz görselleştirmek ve IR almak şekil 2A) resimleri tıklayarak &#34; edinme &#34; düğmesini ( şekil 2B yerelleştirmek için) Lazer sistemiyle retina lekeler &#39; s yazılım.</li>
	<li>Visualize IR + OCT retina katmanlarda üç boyutlu bir bölümünü modu ve tıklatarak resimleri almak &#34; edinme &#34; düğmesini ( şekil 2B). Dış nükleer tabaka (yalnız) yaralanma şiddeti gözlemlemek (bkz. Bölüm 3: lazer odak yaralanma retina üzerinde) bu görüntüler.</li>
	<li>Tedavi ve/veya görüntüleme tank su içeren bir kap içinde Zebra balığı yerleştirdikten sonra anestezi tersine çevirmek için.</li>
	<li>Kurtarma desteklemek için bir akışı taze tank su üzerinde solungaçları Zebra balığı suyun içinde ileri geri hareket ettirerek oluşturun.</li>
	<li>Retina morfolojisi benzer vivo içinde görüntüleme gerçekleştirmek 1 gün, 3, 7, 14 ve hafta 6.</li>
</ol> 5. Hematoksilen &#38; Eozin (H &#38; E) Staining <ol><li>batma içine soğuk (4 ° C) tarafından Zebra balığı ötenazi anestezi çözüm için en az 10 dk ve anlatabilirsin buzda gözleri hemen tarafından anlamına gelir küçük eğri forseps.</li>
	<li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 h için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde (PFA) bütün gözünde düzeltin ve sonra kademeli alkol serisi örneklerinde kurutmak (Ksilen %100 5 min iki kez için etanol %100 5 min iki kez için etanol %96 3 dk iki kez ve etanol %70 3 mi n bir kez). 
	DİKKAT! İngiltere'de yılın gözler, burun ve üst solunum yolu izlemek için rahatsız edici olabilir. İngiltere'de yılın olduğu bilinen bir insan kanserojen ve şüpheli bir üreme tehlike.</li>
	<li>Parafin içinde örnekleri katıştır, optik sinir başı düzeyde 5 µm bölümleri kesilmiş ve cam slaytlarda mount.</li>
	<li>% 0.1 asit Hematoksilen çözüm 5 min için deparaffinized bölümlerle leke ve hidroklorik asit karışımı slaytları daldırma sonra iki kez distile su içindeki slaytları daldırma (250 mL HCl % 25 2 mL distile su) ve amonyak (2 mL % 25 amonyak 250 ml karışımı distile su). Musluk suyu en az 10 dakika süreyle tarafından boyama Hematoksilen gelişimi sonra Eozin G sulu çözüm %0,5 3 dk bölümlerle leke</li>
	<li>Akrilik Reçine montaj orta susuz slaytları mount ve slaytları ışık mikroskobu altında dikkat.</li>
</ol> 6. İmmünhistokimya MC harekete geçirmek için <ol><li>antijen alma arabelleği (Tris-EDTA + %0,05 non-iyonik deterjan, pH 9.0) için uygun bir vapur veya bir mikrodalga fırında 10-15 dk 3 dk deparaffinized bölümlerde ısı ve yıkama üç kez TBS ile 5 için Min her.</li>
	<li>Bir silikon bölümlerle kalem ve 100 µL eklemek daire, oda sıcaklığında 1 h. için çözüm (TBS + %10 keçi normal serum + %1 sığır serum albümin, pH 7,6) engelleme</li>
	<li>Leke anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) tavşan poliklonal antikor ve anti-glutamin sentetaz (GS) fare Monoklonal antikor, 1: 200 seyreltme (örnek başına 40 µL) her ikisi de. Slayt 4 ° C'de oksijen odasında gecede kuluçkaya. Üç kez TBS + % 0.1 ile yıkama ara 20 5 min için.</li>
	<li>Bitiş görselleştirme ile uygun ikincil antikorlar. Bu iletişim kuralı bir keçi Anti-tavşan IgG H kullanılan &#38; GFAP'nin ve bir keçi Anti-fare IgG H L yeşil ikincil antikor &#38; L parlak kırmızı GS, 1 h için oda sıcaklığında 1:500 seyreltme her ikisi için</li>
	<li>Slaytlar ile montaj orta DAPI içeren dağ ve floresan mikroskop altında slaytlar gözlemlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+Pigmentosa%3A+Genes+and+Disease+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li>
<li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4688370/">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494(2015).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li>
<li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li>
<li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+activation%2C+proliferation+and+migration+following+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li>
<li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M%C3%BCller+cell%3A+a+functional+element+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Müller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li>
<li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li>
<li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+M%C3%BCller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li>
<li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li>
<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M%C3%BCller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+neurogenic+potential+of+M%C3%BCller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li>
<li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M%C3%BCller+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li>
<li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+of+L-glutamate%2FL-aspartate+transporter+%28GLAST%29+and+glutamine+synthetase+%28GS%29+immunoreactions+in+retinal+glia%3A+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li>
<li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radial+glia+of+M%C3%BCller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+%28GFA%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li>
<li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish%3A+implications+for+retinal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36(2006).</li>
<li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li>
<li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li>
<li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M%C3%BCller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Zebra balığı retina rejenerasyon/dejenerasyon Sitotoksin aracılı hücre ölüm22, mekanik yaralanma23ve termal yaralanma24gibi farklı yaklaşımlarla incelemeye gittim. Zebra balığı retina hasar için 532 nm diode lazer çalıştırmaya başladık. Böylece, bizim modeli birçok avantaj sunar. Örneğin, biz hızla PRs katmanındaki özellikle dış retina lokalize yaralanma iyi tanımlanmış bir alan oluşturdu. Ayrıca, bu deneysel kurulum Bruch'ın membran choroidal neovas...

Vizyon muhtemelen insanın en temel anlamda ve onun bozulma bir yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Sanayileşmiş dünyada retina dejeneratif hastalıkları görme kaybı ve körlük arasında1yetişkin nüfusun çoğunluğu için hesap. Retinitis pigmentosa (RP) körlüğü yaklaşık 1.5 milyon kişi dünya çapında2,3etkileyen 60 ve 20 yaşları arasındaki kişilerde en sık devralınan nedenidir. Kalıtsal retina bozuklukları dejenerasyonu retina pigment epiteli ve daha sonra gliosis tarafından takip ve iç nöronlar4remodeling ilerici kaybı photoreceptors (PRs) tarafından karakterize heterojen bir ailedir. Hastalığın seyrini genellikle çubuklar, loş ışık ve renk görme ve görme keskinliği5için gerekli olan, koniler akromatik vizyon için sorumlu olan ile başlayan iki PR hücre tipleri, artımlı kaybı açıklanabilir. RP neden için yeterli bir tek gen kusurdur. Defa 130'dan fazla 45'in üzerinde genlerdeki mutasyonlar hastalığı6ile ilişkili bulunmuştur. Bu değişen hastalığı fenotipleri yol açar ve gen tedavisi olmayan genelleştirilebilir bir neden ve böylece karmaşık bir tedavi yaklaşımı. Bu nedenle, hastalıklar kör olarak retina dejenerasyonlar tedavisinde yeni genel tedavi yaklaşımları geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Retina dejenerasyonu kez PR kaybı içerir; Bu nedenle, PR hücre ölümü dejeneratif süreçleri retina7özelliğidir. Zaten PR hücre ölümü Müller glia hücre (MC)8harekete geçirmek ve nükleer silahların yayılmasına karşı uyarır gösterilmiştir. MCs, omurgalı retina büyük gliyal hücre tipinde bir kez kabul "yapıştırıcı" başka bir şey olmak arasında retina sinir hücreleri. Son yıllarda, birçok çalışma daha fazla sadece yapısal9çekmek gibi MCs hareket göstermiştir. Farklı fonksiyonları arasında MCs da neurogenesis içinde katılmak ve10onarmak. Nitekim, karşılık diffusible faktörler degenerating retina, MCs önemli ölçüde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ifade artırın. Bu nedenle, retina hasarı ve dejenerasyon11ikincil bir tepki olarak MC harekete geçirmek için bir işaret olarak GFAP'nin etiketleme kullanılabilir.
Son zamanlarda, Zebra balığı (Danio rerio) retinal dejenerasyon ikna etmek için bir lazer kullanarak odak yaralanma bir roman uyarlaması geliştirdik. Odak yaralanma hücre yaralı siteye geçiş ve retina rejenerasyon12sırasında gerçekleşen olayların hassas zamanlama gibi bazı biyolojik süreçlerin eğitimi için avantajlıdır. Ayrıca, Zebra balığı onun görsel sistem ve bu diğer omurgalıların arasındaki benzerlikleri nedeniyle görsel araştırma önemli hale gelmiştir. İnsan ve teleost retinae brüt morfolojik ve histolojik özellikleri bazı farklılıklar görüntüler. Buna göre insan ve Zebra balığı retinae retina projeksiyon nöronlar, ganglion hücrelerinin en içteki içinde ikamet ederken nerede ışık algılama photoreceptors en dış katmanı işgal aynı katmanlı model düzenlenen aynı büyük hücre sınıfları içerir nöronal katmanı, lens proksimal. Retina interneurons, amacrine, bipolar ve yatay hücreler, photoreceptor ve ganglion hücre katmanları13arasında yerelleştirilmesine. Ayrıca, Zebra balığı retina koni egemen olduğu ve bu nedenle daha, örneğin, çalışılmış kemirgen retina insan retina için yakın olduğunu. Büyüleyici bir fark teleost ve memeliler arasında balık retina ve retina yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra hasar kalıcı neurogenesis vardır. Zebra balığı, MCs dedifferentiate ve rejenerasyon yaralı retina14,15dakika sonra arabuluculuk. Tavuk, MCs aynı zamanda hücre döngüsü yeniden girmek için ve dedifferentiate için bazı kapasitesine sahiptir. Retina yaralanma yetişkin balık MCs Dede ve kök hücre belirli özellikleri kabul, hasarlı retina dokusu ile göç ve yeni nöronlar16üretmek. Gen ifadesi memeli MCs profil oluşturma retina ataları beklenmeyen benzerlikler ortaya ve MCs içsel Nörojenik potansiyelini tavuk, kemirgen ve insan bile retina için kanıt17büyüyor. Yine de, neden kuşlar ve memeliler rejeneratif yanıtta düşük güçlü yanıt olarak balık ile karşılaştırıldığında henüz anlaşılamamıştır. Bu nedenle, Zebra balığı endojen tamir mekanizmaları anlama stratejileri uyarıcı retina rejenerasyon memeliler ve insanlar için önerebilir miyim? MCs retina dejenerasyonu olan hastaların tedavisi için endojen onarım mekanizması bir tedavi aracı olarak istihdam bizim toplum için olağanüstü bir etkisi olurdu.
Burada, biz göze ait araştırma dejenerasyon/rejenerasyon modelinde istihdam için gerekli adımları sağlar. Biz ilk neurosensory retina görüntüleme yaralanma site ve son olarak görüntülenmesi bitişik MCs katılımı gelişen olayların ardından üzerinde odak hasar inducing üzerinde duruldu. Genel iletişim kuralı gerçekleştirmek nispeten kolay ve çok çeşitli retina daha sonra değerlendirmek için olanaklar açar.

<table><tbody><tr><td>Asit hematoksilen çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albümin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danimarka</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI montaj ortamı</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, ABD</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G sulu çözeltisi% 0.5</td> <td>Carl Roth, Arlesheim, İsviçre</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Etilen diamin tetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG H & L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, İsviçre</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG H & L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, İsviçre</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Keçi normal serumu</td><td>Dako, Glostrup, Danimarka</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojel kontakt lens</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, İsviçre</td> <td>n.a.1-Day Acuvue Nemli</td><td></td></tr> <tr><td>Hidroksipropilmetilselüloz %2</td> <td>OmniVision, Neuhausen, İsviçre</td><td>n.a.Methocel</td> <td>%2</td></tr> <tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>A5040</td><td>Trikain, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Almanya</td><td>n.a.532</td> <td>nm lazer</td></tr><tr><td>Fare anti-GS monoklonal antikor</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Görüntüleme Sistemi</td><td>Heidelberg Mühendislik, Heidelberg, Almanya</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Göz Kaşifi</td><td>Heidelberg Mühendislik, Heidelberg, Almanya</td><td>n.a.Sürüm</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFAP poliklonal antikoru</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, ABD</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Silikon pim tutucu</td><td>Huco Vision AG İsviçre</td><td>n.a.</td> <td>Sterilizasyon tepsisinin silikon pim matından elle kesin.</td></tr><tr><td>Yarık lamba BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, İsviçre</td><td>n.a.Yarık</td><td></td></tr> <tr><td>lamba adaptörü</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, ABD</td><td>n.a.Superfrost</td><td></td></tr> <tr><td>Plus cam kaydıraklar</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Almanya</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) gerinim</td><td>KIT, Karlsruhe, Almanya</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris tamponlu salin (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D temassız yarık lamba lensi</td><td>Volk Optik, Mentor, OH, ABD</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Oküler fundus lazer lensi</td><td>Oküler Aletler, Bellevue, WA, ABD</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Birleşik Krallık</td><td>R2100-EU</td><td>Buharlı Pişirici</td></tr></tbody></table>

bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, zebra balığı rejenerasyon modelini müller glia hücre aktivasyonu

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Teleost ve memeliler arasında büyüleyici bir fark teleost retina retina neurogenesis ve yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra ciddi hasar için ömür boyu potansiyelidir. Zebra balığı rejenerasyon yollar soruşturma memelilerde retina dejeneratif hastalıkları tedavisi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yeni anlayışlar getirebilir. Burada, biz Fokal lezyon yetişkin Zebra balığı dış retinada için indüksiyon yoluyla 532 nm diode lazer odaklı. Yerelleştirilmiş bir yaralanma retina dejenerasyonu ve hasar alan, doğrudan rejenerasyon sırasında gerçekleşecek biyolojik süreçlerin soruşturma sağlar. Non-invaziv optik Koherens tomografi (OCT) kullanarak, biz were güçlü-e doğru bozuk alan ve monitör sonraki rejenerasyon konumunu tanımlamak içinde vivo. Gerçekten de, OCT görüntüleme histolojik analizler ile daha önce yalnızca bilgi veren Zebra balığı retina, yüksek çözünürlüklü, kesitsel görüntüler üretir. Gerçek zamanlı OCT verilerden onaylamak için histolojik kesitler gerçekleştirilen ve retina yaralanma indüksiyon sonra rejeneratif yanıt immünhistokimya tarafından araştırıldı.

Gerçek zamanlı OCT: MCs rol retina tamir amacıyla, biz iyi arasındadır bölgenin Zebra balığı retina hasar inducing bir lazer yaralanma modeli kullanılır. Hasar sitenin içinde vivo OCT yaralanma (şekil 3) takip 60 dakika içinde ilk kez (0 gün) aracılığıyla görüntüsü. Balık gözü optik için telafi etmek için özel yapım bir kontakt lens kornea üzerinde yerleştirildi. Hemen sonra lazer tedavisi, diffüz bir yansıtıcı hiper sinyal dış retin...

Zebra balığı retina dejenerasyonu/rejenerasyon omurgalılarda mekanizmaları incelemek için popüler bir hayvan modelidir. Bu iletişim kuralı yerelleştirilmiş yaralanma dış retina iç retina en az hasar ile kesintiye neden yöntemi açıklanır. Daha sonra in vivo retina morfoloji ve Müller glia yanıt retina yeniden oluşturma işlemi boyunca izliyoruz.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Bu videonun genel amacı, Zebrafish'lerde lazerle indüklenen fokal retinal hasar sonrası in vivo hücresel değişimlerin nasıl izleneceğini göstermektir. Bu model; morfolojik değişiklikler, kinetik ve yer alan hücre tipleri gibi retinal rejenerasyonla ilgili temel soruları yanıtlamanıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fokal bir yaralanma oluşturarak biyolojik süreçlerin doğrudan yaralanma bölgesinde incelenebilmesidir.Bu yöntem Zebrafish retinasının rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, farklı hayvan modellerindeki onarım mekanizmalarını incelemek için de uygulanabilir. 400 miligram trikain tozunu, 97,9 mililitre akvaryum suyunda ve 2,1 mililitre bir molar TBS içinde çözerek anestezik stok çözelti hazırlayın. pH 9'da bir molar tris ile pH 7,0'a ayarlayın.Çalışma çözeltisini hazırlamak için, trikain stok çözeltisini tank suyunda 1'e 25 oranında seyreltin ve 50 mililitresini bir Petri kabına aktarın. Ardından, Zebrafish'leri hareketsiz kalana ve dış uyaranlara yanıt vermeyene kadar iki ila beş dakika boyunca anestezik çözeltinin içinde tutun. Her bir balığı, lazer tedavisi için özel olarak yapılmış silikon pin tutucuya elle aktarın.Hayvanın refahı ve prosedürün ba

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, lazer yaralanması kullanılarak yetişkin zebra balıklarında retina dejenerasyonunu indüklemek için bir prosedürü göstermektedir. Lazer, retinadaki fotoreseptör hücrelerini hedef alarak hücre ölümünü ve dejeneratif bir süreci tetikler. Bu hasar, Müller glia (MG) hücrelerini aktive eder ve retinal rejenerasyona yardımcı olan kök hücre progenitörlerine farklılaşmalarına yol açar.

Zebra Balıklarında Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunun Fokal Lazer Yaralanması Kullanılarak Modellenmesi

Kaynak: Lahne, M., et.al. Multifoton Mikroskobu ile Canlı Hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra Balığı Retinal Eksplantlarının Kültürü. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, ışık kaynaklı fotoreseptör hasarını takiben agaroza gömülü zebra balığı retinal eksplantlarında Muller glial nükleer göçünün canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Hasarlı fotoreseptörler tarafından salınan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), Muller glial hücrelerini aktive ederek mitoz ve nöronal progenitör oluşumu...

Zebra Balığı Retina Rejenerasyonu Sırasında Müller Glial Nükleer Migrasyonunun Canlı Hücre Görüntülemesi

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Çoklu ışık zarar protokolleri zarar fotoreseptör tarif ve dolayısıyla yetişkin zebrafish bir retina rejenerasyon tepki neden olmuştur. Bu protokol, pigmentli hayvanlarda kullanılabilen geliştirilmiş bir yöntem açıklanır ve bu çubuk ve tüm retinada arasında koni fotoreseptörlerin büyük çoğunluğu zarar verir.

Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma

Bu yazıda retina de- ve rejenerasyon ve yetişkin zebrabalıkları N-metil-N -nitrosourea kullanarak görme fonksiyonu üzerindeki etkisinin ölçümü göstermektedir. Görme keskinliği kaybı ve azalmış fotoreseptör numaraları iç nükleer tabakada çoğalması ile takip edildi. Komple morfolojik ve fonksiyonel rejenerasyon 30 gün ilk tedaviden sonra meydana geldi.

Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

Tek tek hücrelerde yönlendirilmiş strese veya ölüme neden olacak hedefli manipülasyonların gerçekleştirilmesi nispeten zor olmuştur. Burada, hücre kültüründe ve canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak ve öldürmek için tek hücre çözünürlüklü bir ablasyon yaklaşımı, standart bir konfokal UV lazere dayalı olarak açıklanmaktadır.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

Keşfedin lazer kaynaklı retina hasarı modelini Danio rerio kullanarak Müller glia hücre aktivasyonunu incelemek için. Bu yöntem, canlı görüntüleme ile retinal rejenerasyon süreçlerini detaylı şekilde izlemenizi sağlar.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

Daha fazla video keşfet