Name: Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Keşfedin dinamik imin kimyası kullanarak enjekte edilebilir kitosan hidrojel hazırlama yöntemini. Bu teknik, 3D hücre kültürü ve hücre tedavisi uygulamaları için ayarlanabilir mekanik özellikler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Çin tarafından (21474057 ve 21604076) destek verdi.

dikkat: ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen uygun güvenlik uygulamaları kimya deneyleri, bir duman hood ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, koruyucu eldiven, önlük, vb) kullanımı da dahil olmak üzere yerine getirirken kullanın. Standart hücre işleme teknikleri (sterilizasyon, hücre kurtarma, cep passaging, hücre dondurma, hücre boyama, vb) protokolü gerektirir.
 1. hazırlık Hydrogels <ol><li><ol><li>öncesi kuruma, PEG benzaldehyde sentezi di functionalized polietilen glikol (DF PEG) sona polimer <ol><li>tartmak 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol), bir yuvarlak alt şişesi (250 mL) aktarmak ve toluen (100 mL) ekleyin. 
			Not: Farklı molekül ağırlıkları ile diğer mandal hidrojel oluşumu için çalışabilir ancak farklı sertlik götürecek.</li>
			<li>Isı tabancası (ya da sıcak bir tabak yaklaşık 40 ° C) hafif polimer çözülür yardımcı olmak için çözüm ısı. Tüm polimerler geçiyoruz sonra bir Buharlaştırıcı tüm çözücüler kaldırmak için kullanın. Bu erime ve kuru süreç kurutulmuş PEG polimerler yapmak için iki kez yineleyin. 
			Dikkat: Bu bir duman başlıklı aşırı özenle yapılmalıdır. Toluen yanıcı.</li>
		</ol></li> <li>Benzaldehyde fesih tepki PEG <ol><li>şişesi için manyetik karıştırıcı ve tetrahydrofuran (THF, 100 mL) ekleyip PEG bir karıştırıcı kullanarak geçiyoruz. 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) ve 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0.6 mmol) sırayla tüm katı tamamen erimesi için çözümler ekleyin.</li>
			<li>Ekle N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) çözümü ve susuz CaCl 2 şişeye doldurulur bir kurutma tüp ekleyin. Reaksiyon karıştırma altında oda sıcaklığında tutmak (~ 20 ° C) için yaklaşık 12 h.</li>
		</ol></li> <li>Sonrası tepki süreci <ol><li>reaksiyon tamamlandıktan sonra vakum tarafından çözümde oluşturulan beyaz katı filtre. Çözüm beyaz katı çökelti için karıştırma altında soğuk Dietil eter (500 mL) dökün. Beyaz katı göre filtrele toplamak ve katı bir duman başlıklı kuru.</li>
			<li>Beyaz katı THF yeniden dağıtılması, çözünmez herhangi bir beyaz katılar filtre, çözüm taze soğuk Dietil beyaz katı çökelti eter dökün ve kuru. 2-3 kez bu adımları tekrarlayın ve sonra beyaz katı bir vakum kurutma fırın (20 ° C, 0.1 mbar) onları tamamen kurumasını yerleştirin. Nihai ürün olarak beyaz toz toplamak: benzaldehyde sona DF PEG.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Hydrogels hazırlanması <ol><li>tartmak DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol 0,22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) farklı miktarda bir tüp (10 mL), deiyonize su (5.0 mL) ekleyin ve bir girdap veya manyetik karıştırıcı yardımcı olması için kullanın Polimer çözülür.</li>
		<li>Glikol chitosan (0.495 g, x 10 -3 mmol 6,18) deiyonize su (15,0 mL) bir tüp (50 mL) dağıtılması ve kitosan çözüm (3 wt %) homojenize için birkaç dakika için bir girdap kullanın.</li>
		<li>Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) ve DF PEG Çözümleri (0.2 mL) sırayla bir tüp (2.0 mL) ekleyin. Bir girdap formu hydrogels homojen çözümlerinize birkaç dakika içinde karıştırmak için kullanın. Hydrogels farklı mekanik güçlü yapmak için Tablo 1 ' deki oranları izleyin. 
		Not: hidrojel zaten oluşmuş olup olmadığını belirlemek için tüp ters çevirme yöntemini kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Reolojisi analizleri <ol><li>Reolojisi analizleri dönüş rheometer paralel bir çelik plaka üzerinde yürütmek (çapı: 20 mm). Jelleşme test için Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) daha düşük bir tabağa yayıldı. O zaman, DF PEG sulu çözümler (0.2 mL, 2 wt %) eşit olarak dropwise kitosan çözüm yüzeye ve hızlı bir şekilde bir pipet ile karıştırın. Düşük aşağı üst plaka ve test için başlar</li>
		<li>İçin hidrojel &#39; s sertlik testi, kesilmiş bir hidrojel bir çember içine (çapı: 20 mm) ve depolama modülü ölçmek (G &#39;) değerleri frekans analizleri % 1 zorlanma, karşı. Tipik G &#39;: 6,3 rad s değerleri &#8722; 1 Tablo 1 ' de listelenen. 
		Not: 0,5 h hidrojel Reolojisi analizleri hidrojel dinamik bağ istikrar sağlamak için hidrojel oluşumu sonra taşımak.</li>
		<li>İçin hidrojel &#39; s kendi kendine healable özelliği testi, bir hidrojel paramparça ve duyulursa ayrılmaz bir parçası için parçaları bir araya toplamak. Bir daire yapmak hidrojel parça kesme (çapı: 20 mm) ve Reolojisi analizlerini incelemek rheometer üzerinde koydu.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hydrogels 3D cep ekimi <ol><li>hidrojel jelleşme çözümleri hazırlanması <ol><li>tartmak DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) steril tüp (4.0 mL), hücre kültürü medya (RPMI-1640, 2.0 eklemek mL) ve bir girdap veya karıştırıcı polimer çözüm (20 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olması için kullanın. Çözüm bir şırınga (10.0 mL) içinde yük ve sonra mikrop bakteri kuvvetli filtreden (0,22 µm) geçirerek sterilize.</li>
		<li>Glikol chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) bir steril tüp (15,0 mL) tartmak, hücre kültürü medya (RPMI-1640, 4.0 mL) ve girdap glikol kitosan çözüm (4.0 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olmak için ekleyin. Bir şırınga (10.0 mL) çözümde yük ve 0,22 µm bakteri kuvvetli filtre ile filtre.</li>
	</ol></li> <li>Hydrogels hücre ekimi dikkat: gerçekleştirmek tüm doku kültürü başlıklı ilgili yordamları cep. Steril tekniği konusunda temel bilgi bekleniyor.
	<ol><li>Hücre süspansiyon <ol><li>RPMI-1640 hücrelerde kültür L929 hazırlanması orta % 10 ile desteklenmiş FBS, %5 penisilin (10 mL) bir Petri çanak (çapı 10 cm) ve 37 ° C, % 5 CO 2 kuluçkaya. Orta kullanmadan önce her gün değiştirin.</li>
			<li>Hasat L929 hücreleri tripsin (0.025 w/v %) ve EDTA içeren PBS ile (% 0,01 w/v), (70 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi ve RPMI-1640 orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Kan sayım kurulu standart operasyon kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Hücre toplama ayarlamak için hücreleri yeniden askıya ~ 3.75 × 10 6 hücre/mL.</li>
		</ol></li> <li>Hydrogels hücre katma <ol><li>L929 hücre süspansiyonlar (0.4 mL, 3,75 x 10 6 hücre mL -1) glikol kitosan çözüm (0.4 mL) girdap tarafından bir tüp (4.0 mL) ile karıştırın. L929/glikol kitosan çözüm (0.8 mL) confocal Petri kabına ortasına pipette (çapı 2,0 cm). DF PEG Çözümleri (0.2 mL) aynı çanak içine pipette ve yavaşça çözüm mix ve hidrojel oluşumu teşvik pipet. 
			Not: hidrojel oluşumu petri kabına eğerek değerlendirmek.</li>
			<li>Doğrudan hücre kültürü için ek RPMI-1640 kültür medya (1.0 mL) hidrojel üstüne miktarda ekleyebilirsiniz. Gömülü hücre hydrogels (1.0 mL, 1,5 wt % glikol kitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1.5 × 10 6 hücre mL -1) (37 ° C, % 5 CO 2) bir kuluçka makinesine koy ve orta her gün değiştirin. Gün 1, 3, 5 ve 7'den sonra hücre kapsülleme hücre görüntüleme için hazır olun.</li>
		</ol></li> <li>3D cep sonrası kültür için hydrogels enjeksiyon sonra yüklü hücre hidrojel hazırlamak (1.0 mL, bkz: adım 2.2.2) bir şırınga (10.0 mL, 48 G iğne) içinde. Sonra hidrojel formları hidrojel yavaş yavaş bir petri confocal görüntüleme için içine enjekte. Üstünde tepe-in hidrojel (1.0 mL) kültür ortamının ek bir miktar ekleyin ve her gün değiştirin. Petri kabına (37 ° C, % 5 CO 2) bir kuluçka makinesine koy ve daha sonra görüntüleme için hazır olun. 
		Dikkat: Lütfen kontrol edin ve bir şırınga Emanet işlem protokolü izleyin.</li>
	</ol></li> <li>Hücre canlılığı analizi <ol><li>Confocal gözlem <ol>
			<li>PBS (1.0 mL) ile hydrogels için iki kez yıkayın. Floresein diacetate (FDA, 0.5 mL, 0,05 mg/mL) ve propidium iyodür (PI, 0.5 mL, 0,08 mg/mL) çözümleri için 15 dk ile hydrogels leke. Boyama sonra tüm maddeleri kaldırın.</li>
			<li>Gözlemlemek confocal mikroskop altında uyarma dalgaboyu 488, kullanarak hydrogels nm ve 543 canlı görselleştirmek için nm ve ölü hücreleri, anılan sıraya göre. Z-yığınlar hücreler eşit dağılımı doğrulamak için hydrogels her 2 µm derinliğe üzerinden alın. 
			Not: PI ölü hücreleri lekeleri ise FDA canlı hücreleri lekeleri.</li>
		</ol></li> <li>Hidrojel (1.0 mL) Asetik asit (HAc, 3 v %, 1.0 mL) 5 min ve pipet ile bir tüpe (4.0 mL) bozulmasına yol açar. Hücreleri tarafından santrifüj (70 x g, 5 min) toplamak ve RPMI-1640 hücre kültür orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Bir kan sayım kurulu kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li>
<li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%223D+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li>
<li>Breslin, S., O’Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/255762985_Facilely_prepared_inexpensive_and_biocompatible_self-healing_hydrogel_A_new_injectable_cell_therapy_carrier">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/TB/c4tb01705f#!divAbstract">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li>
<li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid.+Surface.+B%22%5BJournal%5D)">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li>
<li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable%2C+Self%E2%80%90Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li>
<li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c7py00112f#!divAbstract">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/CC/c2cc34745h#!divAbstract">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c6py01704e#!divAbstract">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li>
<li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu Protokolü (şekil 1) sunulan hidrojel iki ana bileşenden oluşur: doğal polimer glikol chitosan ve sentetik bir benzaldehyde sona polimer gelator DF PEG, hangi her iki Biyouyumlu malzemelerdir. DF PEG sentezi bir tek adımlı değişiklik tepki kullanılarak sunulur. Moleküler ağırlık 4.000 PEG bu protokol çözünürlük, değişiklik verimliliği gibi hidrojel sertlik endişelerini için seçildi. Hydrogels ile farklı mekanik güçlü bir dizi hazırlanan kullanarak farklı katı içeriği ve oranları glikol chi...

Hydrogels çapraz polimer malzemeler büyük miktarda su ve yumuşak mekanik özellikleri ile ve birçok bio-tıbbi uygulamalar1,2' kullanılmıştır. Hydrogels hücreleri içinde vivoiçin fizyolojik çevre çok benzer bir yumuşak ve ıslak ortam sunmaktadır. Bu nedenle, hydrogels 3D hücre kültür3,4için en popüler iskele biri haline gelmiştir. 2D Petri kabına hücre kültürü için karşılaştırıldığında, 3D hücre kültürü, microenvironment başvurun ve yayılmasını önleme ve ayırt etme amacıyla5için bir araya hücreler için bir hücre dışı Matriks (ECM) taklit sunmak için hızla ilerlemiştir. Ayrıca, doğal polimerler içeren hydrogels biyo uyumlu ve teşvik ortamları çoğalırlar ve3ayırt etmek için hücreleri için önerebiliriz. Sentetik polimerler elde Hydrogels hayvan kökenli proteinler veya virüs gibi karmaşık etkileri dışlamak onların basit ve net bileşenleri için tercih edilir. Tüm hidrojel adaylar arasında 3D hücre kültürü için kolayca hazırlanır ve tutarlı bir özellik olan hydrogels her zaman tercih edilir. Farklı araştırma gereksinimleri uyacak hidrojel'ın özelliklerini ayarlamak için tesisin iyi6önemlidir.
Burada bir çok yönlü hidrojel platform 3D hücre kültür7için olur dinamik imin kimya kullanarak bir glikol kitosan tabanlı hidrojel facile hazırlanması tanıtmak. Bu yöntemde, iyi bilinen biyo uyumlu glikol kitosan çerçeveler hidrojel'ın ağlar kurmak için kullanılır. Onun amino grupları ile sona benzaldehyde polietilen glikol dinamik imin Tahvil hydrogels8crosslinkages oluşturmak için polimer gelator olarak tepki. Dinamik imin Tahvil formu ve çevresi, hydrogels mekanik olarak ayarlanabilir çapraz ağlar9,10,11ile endowing için geri döndürülebilir ve responsively ayrıştırmak. Yüksek su içeriği, biyo uyumlu malzemeler ve ayarlanabilir mekanik güçlü nedeniyle hidrojel başarıyla 3D hücre kültürü12,13L929 hücreler için bir iskele olarak uygulanır. İletişim kuralı burada polimer gelator sentezi, hidrojel hazırlama, hücre katıştırma ve 3D hücre kültürü çalışmalarının da dahil olmak üzere yordamlar, ayrıntıları.
Hidrojel aynı zamanda birçok diğer özellikleri nedeniyle çok duyarlı çeşitli biyo-uyarıcılara (asit/pH, B6 vitamini türevi piridoksal, protein papain, vb) dahil olmak üzere, hidrojel olabileceğini gösteren onun dinamik imin crosslinkages gösterir fizyolojik şartlarda8altında çürümeye bağlı. Hidrojel hidrojel minimal invaziv enjeksiyon yöntemi ile idare ve uyuşturucu ve hücre teslimatlar14,15dakika sonra bir avantaj Yani kendi kendine healable ve enjekte edilebilir, da. Hidrojel işlevsel katkı maddeleri veya belirli önceden tasarlanmış polimer gelators ekleyerek, manyetik, sıcaklık, pH duyarlı, hangi yerine vb16,17, gibi belirli özellikleri kazanıyor için uyumlu bir araştırma gereksinimleri çok çeşitli. Bu özellikleri bir enjekte edilebilir olmak potansiyel kapasite hidrojel'ın uyuşturucu ve hücreler içinde in vitro ve in vivo bio-Medikal araştırma ve uygulamalar için birden fazla taşıyıcıları ortaya koyuyor.

<table><tbody><tr><td>Glikol kitosan</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>39280-86-9</td><td>%90 deasetilasyon derecesi</td></tr><tr><td>4-Karboksibenzaldehit</td><td>Şangay Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>619-66-9</td><td>%99</td></tr> <tr><td>N, N'-disikloheksilkarbodiimid</td><td>Şangay Aladdin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>538-75-0</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Kalsiyum klorür susuz</td><td>Şangay Alaaddin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>10043-52-4</td><td>%96</td></tr> <tr><td>4-dimetilamiopryidin</td><td>Şangay Alaaddin&nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>1122-58</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Polietilenglikol</td><td>Çin-pharm Kimyasal Reaktif</td><td>5254-43-7</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Tetrahidrofuran</td><td>Çin-eczane Kimyasal Reaktif</td><td>109-99-9</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Toluen</td><td>Çin-eczane Kimyasal Reaktif</td><td>108-88-3</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Etil eter</td><td>Çin-eczane Kimyasal Reaktif</td><td>60-29-7</td><td>%</td></tr><tr><td>99Asetik asit</td><td>Sino-pharm Kimyasal Reaktif</td><td>64-19-7</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Susuz CaCl2</td><td>Çin-eczane Kimyasal Reaktif</td><td>10043-52-4</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Floresein diasetat</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Propidyum iyodür ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>%94</td></tr> <tr><td>RPMI-1640 kültür ortamı</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>%0.25</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin çözeltisi</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Reometre</td><td>TA Cihazı</td><td></td><td>AR-G2</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3kanal</td></tr><tr><td>L929 Hücreler</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC klonu 929; L hücresi, L929, Gerinim L</td></tr><tr><td>Evaporatör</td><td>türevi EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48 guage iğne</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>48-guage</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Mikroskop yazılımı</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı tabancası</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kitosan-esaslı enjekte edilebilir hydrogels ve kendi uygulamasında 3d hücre kültürü hazırlanması

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Protokol kitosan tabanlı hydrogels dinamik imin kimya kullanarak hazırlamak için facile, verimli ve çok yönlü bir yöntem sunuyor. Hidrojel çözümleri glikol kitosan, sentezlenmiş benzaldehyde sonlandırıldı polimer gelator ile karıştırılarak hazırlanır ve hydrogels verimli bir şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika içinde elde edilir. Glikol kitosan, polimer gelator ve su içeriği arasında değişen oranlarda tarafından farklı jelleşme kez ve sertliği ile çok yönlü hydrogels elde edilir. Zarar görmüş, hidrojel onun Görünüşe ve modülü, dinamik imin Tahvil reversibility crosslinkages olarak nedeniyle kurtarabilirsiniz. Kendi kendine healable bu özellik hidrojel enjeksiyon işleminden sonra sıkılmış parçaları bir ayrılmaz toplu hidrojel kendi kendine iyileşmiş olabilir bu yana enjekte edilebilir olmasını sağlar. Hidrojel da çok farklı denge durumları dinamik imin Tahvil nedeniyle birçok biyo-aktif uyaranlara cevap veriyor. Bu hidrojel biyo uyumlu doğrulandı ve L929 fare fibroblast hücreleri katıştırılmış aşağıdaki Standart prosedürler ve Hücre proliferasyonu kolayca 3D cep ekimi işlemi tarafından değerlendirildi. Hidrojel farklı araştırma nerede bir 3D çevre hücreler için fizyolojik bir taklit kazançlı için ayarlanabilir bir platform sunar. Çok duyarlı, kendi kendine healable ve enjekte edilebilir özellikleri ile birlikte, hydrogels potansiyel olarak uyuşturucu ve gelecekteki bio-tıbbi uygulamalar hücrelerde birden çok taşıyıcıları olarak uygulanabilir.

Bu protokol hidrojel hazırlık ve 3D hücre kültürü olarak kullanılmasını şematik bir sunumunu şekil 1' de sunulmaktadır. Bilgi hidrojel'ın içindekiler ve farklı mekanik güçlü ile hazırlanan oranları Tablo 1' de özetlenmiştir. Hidrojel kendi kendine healable ve depolama modülü Frekans testi Şekil 2' deki karşı tarafından hidrojel'ın sertlik Reolojisi özelliği sunar. Hücre confocal görüntüleri ve gün ile hücre sayısı hydrogels kültüründe hücre canl...

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Bu protokolün genel amacı, nihayetinde terapötik tedavilerde kullanılmak üzere, üç boyutlu hücre kültürü için enjekte edilebilir bir kitosan hidrojeli hazırlamaktır. Bu yöntem, kendi kendini iyileştiren hidrojel alanındaki, bütünsel bir yöntemle kendi kendini iyileştiren bir hidrojelin nasıl yapılacağı ve bunun 3D hücre kültürü için nasıl kullanılacağı gibi sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin avantajı, biyouyumlu ve kendi kendini iyileştiren bir hidrojelin çok basit bir yöntemle hazırlanabilmesi ve 3D hücre kültüründe kullanılabilmesidir.Bu hidrojel aynı zamanda enjekte edilebilir olduğundan, hücre terapisi için bir taşıyıcı olarak kullanılabilir. Şimdi Bay Yongsan Li, size hidrojelin nasıl hazırlanacağını ve bu hidrojel kullanılarak 3B hücre kültürünün nasıl yapılacağını gösterecek. Yongsan Li, laboratuvarımızın lisansüstü öğrencisidir.Hidrojelleri hazırlamak için öncelikle DF PEG sentezleyin. Bir çeker ocak altında, 4.000 molekül ağırlığında dört gram PEG'i bir balon jojeye tartarak ekleyin ve 100 mililitre toluen ilave edin. Ardından, polimerleri çözmek için çözeltiyi ısıtın.Tüm polimerler çözündükten sonra, tüm çözücüleri uzaklaştırmak için bir evaporatör kullanın. Ardından, kuru PEG polimerlerini hazırlamak için toluen ile karıştırma ve buharlaştırma işlemini iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, bir manyetik karıştırıcı ve 100 milliliters DHF kullanarak polimerleri çözün.Ardından, çözeltinin içine 0.9 gram 4-Karboksibenzaldehit çözün. Sonra, çözeltinin içine 0.07 gram dimetilaminopirimidin çözün. Şimdi, susuz kalsiyum klorürle doldurulmuş bir kurutma borusu içerisinde 1.25 gram DCC ekleyin.Şimdi reaksiyonun oda sıcaklığında yaklaşık 12 saat boyunca karıştırılmasına izin verin. Ertesi gün, beyaz katıları çöktürmek için 500 mililitre soğuk dietil eter kullanın ve katıları toplamak için vakumlu filtrasyon uygulayın. Çözeltiyi atın ve katıları iyi havalandırılan bir ortamda kurutun.Ardından, beyaz katıları 100 mililitre THF içinde çözün. Devam etmeden önce çözünmeyen tüm beyaz katılar süzülmelidir. Şimdi, çözünmüş katıları taze soğuk dietil eter kullanarak çöktürün.Ardından, katı maddeleri toplamak için vakumlu filtrasyon uygulayın ve kurumaya bırakın. Bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın ve ardından beyaz katıları tamamen kurutmak için vakumlu kurutma fırınına yerleştirin. Elde edilen beyaz toz son üründür: benzaldehit uçlu DF PEG.Hücreleri kültürleme amacıyla hidrojele hapsetmek için, öncelikle dört mililitrelik bir tüp içerisinde 0,44 gram DF PEG'i iki mililitre hücre büyüme medyumunda çözün. Karışımı, ağırlıkça %20'lik bir çözelti haline gelene kadar vorteksleyin. Ardından, çözeltiyi sterilize edin.Bir 10 mililitrelik şırıngaya yükleyin ve 0,22 mikronluk bakteri tutucu bir filtreden geçirin. Şimdi, ağırlıkça %4'lük bir kitosan çözeltisi hazırlamak için 0,165 gram glikol-kitosanı, bir vorteks kullanarak dört mililitre hücre kültürü besiyeri ile karıştırın. Ardından, çözeltiyi başka bir 0,22 mikronluk bakteri tutucu filtre kullanarak sterilize edin.Ardından, L929 hücreleri gibi hücreleri tripsin kullanarak hasat edin. Toplanan hücreleri yıkayın ve mililitre başına 3,75 milyon hücre olacak şekilde besiyerinde yeniden süspande edin. Bir sonraki adımda hücreler 3B bir matrise ekilir.Başarıyı yakalamak için bu adımların kesin olarak takip edilmesi kritiktir. Şimdi, bir vorteks kullanarak 0,4 mililitre hücre süspansiyonunu 0,4 mililitre kitosan çözeltisi ile karıştırın. Bu karışımı iki santimetre çapındaki bir petri kabının merkezine pipetle aktarın ve kabın içine 0,2 mililitre DF PEG çözeltisi ekleyin.Ardından, hidrojel oluşumunu tetiklemek için nazikçe pipetleme yapın. Çanağı eğerek ve çözeltinin viskozitesini gözlemleyerek hidrojelin oluşumunu değerlendirin. Kapsüllenen hücrelerin enjekte edilebilirliğini test etmek için aynı hazırlığı 10 mililitrelik bir şırıngada gerçekleştirin.Ardından, hidrojel oluştuktan sonra, hidrojeli 48 gauge bir iğne aracılığıyla yavaşça petri kabına boşaltın. Sonrasında, plaka içindeki hidrojel-hücre karışımına bir mililitre kültür medyumu ekleyin ve plakayı kültüre etmek üzere bir inkübatöre aktarın. Gün aşırı, 3D hidrojel hücre kültürünün üzerini kaplayacak şekilde medyumu değiştirin.Hidrojeller içine hapsedilmiş hücreleri görüntüleme için hazırlamak amacıyla, önce hidrojelleri iki kez bir mililitre PBS ile durulayın. Ardından, hidrojelleri fluorescein-diacetate çözeltisi ve propidium iodide çözeltisi ile boyayın. Her iki çözeltiden 0.5 mililitreyi hidrojelin üzerine ekleyin ve hidrojeli oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Boyama çözeltileriyle yapılan kısa inkübasyonun ardından, tüm solventleri aspire edin. Şimdi, canlı hücreleri görüntülemek için 488 nanometrede ve ölü hücreleri görüntülemek için 543 nanometrede eksitasyon uygulayarak hidrojelleri konfokal mikroskopi ile gözlemleyin. Hücrelerin hidrojel içindeki dağılımını doğrulamak için iki mikronluk dilimlerle görüntü yığınları toplayın.L929 hücreleri. Yaklaşık 5.600 Pascal değerinde in-vivo ortam doku sertliğine sahip tipik bir fare-fiberglas hücre hattı bir hidrojel içine kapsüllendi. Kültür süreci boyunca canlılıkları son derece yüksek seyretti ve dikkat çekici bir hücre yoğunluğuna ulaştılar.Hidrojelde yedi günlük kültürleme sonrası hücre sayısı %200 oranında artmıştır. 48 gauge bir iğne aracılığıyla hücre kültürü kabına püskürtülen hidrojeller, yaklaşık bir saat sonra kendi kendini onararak bütünleşik bir hidrojel yapısını yeniden oluşturabilmiştir. Kültürdeki yedinci günün sonunda, bu hücreler de çarpıcı bir şekilde çoğalmıştır. Bazı hücrelerin ikiye bölündüğü hücre bölünmesi olaylarına dair kanıtlar saptanabilmiştir.Canlı-ölü analizi, enjeksiyondan sonra 3D hidrojelde başarılı hücre proliferasyonunu kanıtlayan çok yüksek bir canlılık göstermiştir. Bu hücre proliferasyon oranı, yedi günlük kültürleme sonrası enjekte edilmemiş hücrelerin yaklaşık 3/4'ü kadardı. Bu nedenle, enjeksiyon sırasındaki kayma kuvvetinin ölçülebilir bir negatif etkisi olsa da, enjekte edilen hücreler hala oldukça proliferatifti.Bu videoyu izledikten sonra, kendi kendini iyileştiren bir hidrojelin nasıl hazırlanacağını, bu hidrojelin 3D hücre kültürü için nasıl kullanılacağını ve hücrelerin bu hidrojel ile nasıl iletileceğini öğrenmiş olacaksınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün uygulandığında bir saat içinde tamamlanabilir. En iyi prosedür takip edilerek, hücre tedavisi veya ilaç iletimi için in-vivo enjeksiyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Mevcut kök hücre tedavilerinde büyük bir engel konak dokularına bu hücrelerin sunmak için en etkili yöntem belirlemektir. Adipoz kaynaklı kök hücreler kendi multipotency korumasını sağlarken Burada, verimli ve yaklaşım, basit bir kitosan tabanlı dağıtım yöntemi açıklar.

Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Kıkırdak onarımı, karşılanmamış bir tıbbi zorluğu temsil eder ve insan eklem kıkırdağını tasarlamak için hücre temelli yaklaşımlar umut verici bir çözümdür. Burada, insan eklem kondrositlerinin genişlemesi ve olgunlaşması için ideal bir araç olarak üç boyutlu (3D) biyomimetik hidrojelleri tanımlıyoruz.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

poli (N-izopropil akrilamid) -graft-kondroitin sülfat oluşan enjekte edilebilir doku mühendisliği iskelesi (PNIPAAm-g-CS) içeren aljinat mikro hazırlandı. Özellikleri ve in vitro biyouyumluluk şişme yapışma mukavemeti, bu çalışmada incelenmiştir. Burada geliştirilen karakterizasyon teknikleri diğer thermogelling sistemleri için geçerli olabilir.

Doku Mühendisliği Aljinat mikropartiküllerin ile Thermogelling Poli (N-izopropil) -graft-kondroitin Sülfat Kompozitlerin Sentezi

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Burada, insan periodontal bağ (PDL) hücre kürleri tarafından kitosan filmleri ile ilgili protokoller sunuyoruz. Üç boyutlu (3D) hücresel küreler kültürü geleneksel doku kültürü Polistiren (TCPS) kültür sistemine bir alternatif sağlar.

Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu

Mevcut protokol, kitosan-genipin mikrojellerinin üretimi için emülsiyon bazlı olmayan bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu mikrojellerin boyutu hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve pH'a bağlı şişlik gösterebilir, in vivo olarak bozulabilir ve zamanla sürekli bir şekilde salınan terapötik moleküllerle yüklenebilir, bu da onları doku mühendisliği uygulamaları için oldukça alakalı hale getirir.

Doku Mühendisliği Uygulamaları için Boyut Kontrollü ve Emülsiyonsuz Kitosan-Genipin Mikrojellerinin İmalatı

Keşfedin dinamik imin kimyası kullanarak enjekte edilebilir kitosan hidrojel hazırlama yöntemini. Bu teknik, 3D hücre kültürü ve hücre tedavisi uygulamaları için ayarlanabilir mekanik özellikler sunar.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Daha fazla video keşfet