Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Bu protokolün genel amacı, nihayetinde terapötik tedavilerde kullanılmak üzere üç boyutlu hücre kültürü için enjekte edilebilir bir kitosan hidrojel hazırlamaktır. Bu yöntem, kendi kendini iyileştiren hidrojel alanında, tamamen daldırılarak kendi kendini iyileştiren bir hidrojelin nasıl yapılacağı ve 3D hücre kültürü için nasıl kullanılacağı gibi sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin avantajı, uyumlu bir şekilde kendi kendini iyileştiren hidrojelin çok basit bir şekilde hazırlanabilmesi ve 3D hücre kültürü kullanılmasıdır.

Bu hidrojel aynı zamanda enjekte edilebilir, bu nedenle hücre tedavisi için bir taşıyıcı olarak kullanılabilir. Şimdi Bay Yongsan Li size hidrojelin nasıl yapıldığını ve bu hidrojeli kullanarak 3D hücre kültürünün nasıl yapılacağını gösterecek. Yongsan Li, laboratuvarımızın yüksek lisans öğrencisidir.

Hidrojelleri yapmak için önce DF PEG'i sentezleyin. Bir davlumbazda, yuvarlak tabanlı bir şişeye dört gram moleküler ağırlıklı 4.000 PEG tartın ve 100 mililitre toluen ekleyin. Daha sonra polimerleri çözmek için çözeltiyi ısıtın.

Tüm polimerler çözüldükten sonra, tüm çözücüleri çıkarmak için bir evaporatör kullanın. Ardından, kuru PEG polimerlerini hazırlamak için toluen karıştırma ve iki kez daha buharlaştırma işlemini tekrarlayın. Daha sonra, manyetik bir karıştırıcı ve 100 mililitre DHF kullanarak polimerleri çözün

Ardından, 0.9 gram 4-Karboksibenzaldehit'i çözelti içinde çözün. Daha sonra, 0.07 gram dimetilaminopirimidi çözelti içinde çözün. Şimdi susuz kalsiyum klorür ile doldurulmuş bir kurutma tüpüne 1.25 gram DCC ekleyin.

Şimdi reaksiyonun oda sıcaklığında yaklaşık 12 saat karışmasına izin verin. Ertesi gün, beyaz katıları çökeltmek için 500 mililitre soğuk dietil eter kullanın ve katıları toplamak için vakumlu filtrasyon kullanın. Çözünen maddeyi atın ve katıları iyi havalandırma altında kurutun.

Daha sonra, beyaz katıları 100 mililitre THF içinde çözün. Devam etmeden önce çözünmeyen beyaz katılar filtrelenmelidir. Şimdi çözünmüş katıları taze soğuk dietil eter kullanarak çökeltin.

Ardından katıları toplamak için vakumlu filtrasyon kullanın ve tekrar kurumasını bekleyin. Bu işlemi iki ila üç kez tekrarlayın ve ardından beyaz katıları tamamen kurutmak için vakumla kurutma fırınına koyun. Elde edilen beyaz toz nihai üründür: benzaldehit sonlu DF PEG.

Hücreleri kültürleme için hidrojel içinde kapsüllemek için, önce 0.44 gram DF PEG'yi dört mililitrelik bir tüpte iki mililitre hücre büyüme ortamına çözün. Karışımı ağırlıkça %20'lik bir çözeltiye vorteksleyin. Sonra, çözeltiyi sterilize edin.

10 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve 0.22 mikronluk bakteri tutucu bir filtreden geçirin. Şimdi 0.165 gram glikol-kitosanı dört mililitre hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve ağırlıkça% 4'lük bir kitosan çözeltisi yapmak için bir girdap kullanın. Ardından, başka bir 0.22 mikron bakteri tutucu filtre kullanarak çözeltiyi sterilize edin.

Daha sonra, tripsin kullanarak L929 hücreleri gibi hücreleri hasat edin. Toplanan hücreleri yıkayın ve mililitre başına 3.75 milyon hücrede ortamda yeniden süspanse edin. Bir sonraki adımda, hücreler bir 3D matrise ekilir.

Bu adımları tam olarak takip etmek, başarı elde etmek için kritik öneme sahiptir. Şimdi bir girdap kullanarak 0.4 mililitre hücre süspansiyonunu 0.4 mililitre kitosan çözeltisi ile karıştırın. Bu karışımı iki santimetre çapında bir petri kabının ortasına pipetleyin ve 0,2 mililitre DF PEG solüsyonunu tabağa pipetleyin.

Ardından, hidrojel oluşumunu indüklemek için nazik pipetleme kullanın. Çanağı eğerek ve çözeltinin viskozitesini gözlemleyerek hidrojelin oluşumunu değerlendirin. Kapsüllenmiş hücrelerin enjekte edilebilirliğini test etmek için, aynı hazırlığı 10 mililitrelik bir şırıngada yapın.

Ardından, hidrojel oluştuktan sonra, hidrojeli 48 gauge bir iğneden petri kabına yavaşça boşaltın. Daha sonra, plakadaki hidrojel hücre karışımına bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve plakayı kültürleme için bir inkübatöre aktarın. Her iki günde bir, 3D hidrojel hücre kültürünü kaplayan ortamı değiştirin.

Görüntüleme için hidrojeller içinde kapsüllenmiş hücreleri hazırlamak için, önce hidrojelleri iki kez bir mililitre PBS ile durulayın. Daha sonra hidrojelleri floresein-diasetat çözeltisi ve propidyum iyodür çözeltisi ile boyayın. Her iki çözeltiden 0,5 mililitre hidrojel üzerine yerleştirin ve hidrojeli oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Leke çözeltileri ile kısa bir inkübasyondan sonra, tüm çözücüleri aspire edin. Şimdi hidrojelleri konfokal mikroskopi kullanarak, canlı hücreleri görüntülemek için 488 nanometrede uyarma ve ölü hücreleri görüntülemek için 543 nanometrede uyarma ile gözlemleyin. Hidrojeldeki hücrelerin dağılımını doğrulamak için iki mikronluk dilimlerle görüntü yığınlarını toplayın.

L929 hücreleri. Yaklaşık 5.600 Paskal in-vivo ortam doku sertliğine sahip tipik bir fare-fiberglas hücre hattı, bir hidrojel içinde kapsüllendi. Kültür süreci boyunca canlılıkları son derece yüksekti ve dikkate değer bir hücre yoğunluğu elde ettiler.

Hidrojelde yedi günlük kültürden sonra, hücre sayısı %200 arttı 48 gauge bir iğne ile hücre kültürü kabına atılan hidrojeller, yaklaşık bir saat sonra entegre bir hidrojeli yeniden şekillendirmek için kendi kendini iyileştirebilir. Kültürde yedi gün sonra, bu hücreler de dramatik bir şekilde çoğaldı. Bazı hücrelerin ikiye bölünmüş gibi göründüğü hücre fisyon olaylarına dair kanıtlar bulunabilir.

Canlı ölü tahlili, enjeksiyondan sonra 3D hidrojeldeki başarılı hücre proliferasyonunu gösteren çok yüksek canlılık gösterdi. Bu hücre çoğalma hızı, yedi günlük kültürlemeden sonra enjekte edilmemiş hücrelerin yaklaşık 3/4'ü kadardı. Bu nedenle, enjeksiyon sırasındaki kıvrılma kuvveti ölçülebilir bir olumsuz etkiye sahip olsa da, enjekte edilen hücreler hala oldukça proliferatifti.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi kendini iyileştiren bir hidrojelin nasıl hazırlanacağını ve bu hidrojelin 3D hücre kültürü için nasıl kullanılacağını ve hücrenin bu hidrojel ile nasıl verileceğini bilmelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. En iyi prosedürü takiben, hücre tedavisi veya ilaç dağıtımı için in-vivo enjeksiyon gibi başka bir yöntem de gerçekleştirilebilir.