Name: Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Öğrenin, fare modelinde antijen spesifik sitotoksik öldürme yöntemini. Bu teknik, T hücre manipülasyonu ile immün yanıtları hızlıca değerlendirmeyi sağlar ve sitolitik potansiyeli doğrudan ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH araştırma tarafından desteklenmektedir (A1R03AI120027 (RN) ve 1R21AI20012 (RN)), kurumsal araştırma hibe (RN), başlangıç (RN) vermek ve MD Anderson CIC tohum vermek (RN).

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of Texas MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır.
1. aşı için peptid hazırlanması
<ol><li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) uygun konsantrasyon ve 30 için girdap ile lyophilized peptid dağıtılması s. Not: hgp10025-33için son konsantrasyonu 1 mg/mL ve OVA257-264için son konsantrasyonu 0.5 mg/mL. Peptid enjeksiyon önce yeniden oluşturma. Sulandırma sonra depolamayın.</li>
</ol>2. Splenocytes transgenik fareden yalıtım
Not: Dalak hücre izolasyon steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>
Onaylanmış CO2 boğulma yöntemini kullanarak OT-1 transgenik fare ötenazi ve dalak kaldırın. Not: Bu adımda seçim peptid için belirli uygun transgenik fare kullanılmaktadır.<ol>
<li>Fareyi sağ yan yattı. Sprey % 70 etanol (alkol) fareyle sol tarafında. Deri forseps kullanarak çekin ve Cerrahi makas kullanarak deriyi kesme; dalak peritoneal kavite içinde görünür. Yavaşça dalak erişmek için Periton boşluğuna kesmiş. Dalak forseps kullanarak kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dalak bir petri kabına (PBS % 1 fetal sığır serum (FBS) ile) 2 mL orta A ile 70 µm filtrede yerleştirerek ve lavabo pompası sonu ile dalak smashing tarafından disaggregate.
	<ol>
<li>Splenocytes yeri bir 50 mL konik tüp ve petri kabına toplamak. Petri kabına orta iki kez tüm hücreleri toplamak için A 5 mL ile yıkayın. Orta bir up için 25 mL ekleyin ve hücreler için 475 x g de oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri Aspire edin ve resuspend 1 ml / dalak kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek başı. Kuluçkaya 5 dakika süreyle oda sıcaklığında eklemek 10 mL orta A ve santrifüj 475 x g., oda sıcaklığında Pelet orta A 10 ml Resuspend ve hücre süspansiyon 70 µm filtre içine temiz bir 50 mL konik yoluyla filtreleme tarafından enkaz kaldırmak.</li>
	<li>
Trypan mavi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. PBS hücrelerde son konsantrasyonu 10 resuspend6 - 1006 hücre/mL. OVA257için-264 özel 106 hücre/mL öldürme, resuspend ve hgp100 için25-33 belirli 1006 hücre/mL öldürme, resuspend.
	<ol>
<li>475 x g., 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri süpernatant Aspire edin ve 15 mL soğuk PBS hücreleri yıkamayı resuspend spin. Yıkama adım bir kez daha yineleyin. Hücreleri 475 x g., 5 min için oda sıcaklığında süpernatant Aspire edin ve 2.4. adımda belirlenen son hacmine göre soğuk PBS resuspend spin.</li>
		<li>Tek hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve alıcı C57/BL6 fare içine enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Splenocytes transgenik fareler üzerinden enjeksiyon
<ol><li>Bir restrainer dorsal yüzü alıcı C57/BL6 fare yerleştirin. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Tek hücre süspansiyon (Bölüm 2), 100 µL intravenöz eğim yüzü yukarı bakacak şekilde 27 G iğne kullanarak kuyruk ven içine yönetmek.</li>
</ol>4. Covax yönetim
Not: Eğer hücreler öğleden sonra enjekte edilir, covax ertesi sabah 18 h hücre enjeksiyon içinde yönetilmesi.
<ol><li>Fare ile % 1-3 isoflurane açık anestezi kutusuna yerleştirin. Fareler tam anestezi sonra manifold anestezi odasında bağlı burun koni için fareler aktarın. Sırt yanında kadar ölçülü fareler tutun. Not: Anesthetization para çekme yanıt değil elde edildi doğrulamak için bir kısa ayak çimdik tarafından onaylanır. Federal yasa isoflurane Kullanım sırasına lisanslı bir veteriner kısıtlar.</li>
	<li>Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Peptid çözümden (Bölüm 1) 100 µL subkutan enjekte içine kuyruk temel bölge, iğne eğim yüzü yukarı bakacak şekilde 4-5 mm nüfuz şırınga ile 27 G iğne kullanarak. Not: Fare kuyruğu10tabanında Subkutan Enjeksiyon ile bir kanat içinde aşı.</li>
	<li>100 µL anti-CD40 antikor (0,5 mg/mL stok) lateral aşı enjeksiyon yeri için enjekte.</li>
	<li>Dikkatle imiquimod krem 50 mg/fare aşı sitelerde geçerlidir. Kadar krem artık görünür ve tamamen emilir yüzeyde imiquimod krem sür.</li>
	<li>İntraperitoneally 100 µL 100.000 IU/mL rhIL-2 protein enjekte (IP), alt karın bölgesi. Onlar tamamen anesteziden iyileştikten sonra fare 5 min için gözlemlemek. Not: Deney 3 gün boyunca bu noktada duraklatıldı.</li>
</ol>5. CFSE ile etiketleme için hedef Splenocytes yalıtım
Not: Dalak hücre izolasyon steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>C57BL/6 fareler onaylı CO2 boğulma yöntemine göre ötenazi. Spleen(s) olduğu gibi adım 2.1.1 kaldırın. Dalak disaggregate ve splenocytes olduğu gibi adımları 2.2.1 - 2.2.3 yıkayın. Kırmızı kan hücreleri adımları 2.3 - 2.3.2 olduğu gibi koşullar.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak sayım için hücre kaldırma ve hücre 106 hücre/mL CFSE-etiketleme çözümü (7. adımda açıklanan), son bir konsantrasyon için hesaplayın. G. aspiratı süpernatant x 475, 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri spin.</li>
</ol>6. peptid hedef Splenocytes darbe
Not: Peptid darbe steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>Senaryo Özeti 106 hücre/mL tam medya resuspend (% 10 ile RPMI 1640 medya FBS, % 1'l-glutamin (L-Gln), % 1 penisilin/streptomisin (kalem/Strep)). 2 tüpler (15 mL conicals) içine hücreleri bölün. Her tüpün darbeli veya unpulsed olarak etiketleyin.</li>
	<li>
Peptid etiketli tüp için Geniş puls ekleyin. OVA257-264 darbe için 1 µg/mL ekleyin ve darbe hgp10025-33 için 2 µg/mL ekleyin. Not: Unpulsed hücreleri aynı kuluçka peptid ek olmadan sadece pulsed hücreler olarak tabi.<ol>
<li>Kuluçkaya hücreleri + 37 ° c için 1 h peptid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL tam medya ekleyin (RPMI 1640 medya % 10 ile FBS, % 1'l-glutamin (L-Gln), % 1 penisilin/streptomisin (kalem/Strep)) yıkamak için her tüp için her ikisi de darbe ve unpulsed hedef hücreler. G. aspiratı süpernatant x 475, 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri spin.</li>
</ol>7. hedef Splenocytes etiketleme için hazırlanması CFSE
<ol><li>
6.3. adımda yıkama hücre sırasında CFSE etiketleme çözüm hazırlamak; Darbeli hücreleri CFSEMerhaba ve unpulsed CFSEloetiketlenir. 1 mL CFSE-etiketleme çözeltisi 106 hücreler için hazırlayın. Not: CFSE ışığa duyarlı ve ışık her zaman korunmalıdır.<ol>
<li>CFSEMerhaba hazırlamak-etiketleme medya RPMI medya %1640 2 ile 1 uL/mL CFSE (5 mM stok çözelti) 5 µM/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyerek FBS.</li>
		<li>CFSElo hazırlamak-etiketleme medya 1 uL/mL CFSE (0,5 mM stok çözelti) 0.5 µM/mL RPMI medya %1640 2 ile son bir konsantrasyon için ekleyerek FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. hedef Splenocytes CFSE ile etiketlerine göre
Not: CFSE etiketleme steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>Darbeli ve unpulsed Hedef hücrelerden (adım 6.3) 106 hücre/mL medya CFSE etiketleme resuspend. Darbeli hücreleri ile hazırlanmış CFSEMerhabaresuspend-medya ve unpulsed hücreleri etiketleme hazırlanan CFSElo-etiketleme medya.</li>
	<li>Hücreleri ve CFSE etiketleme medya nazik inversiyon veya dönen karıştırın. Vortexing tarafından bir arada kullanmayın. Hücreleri kuluçkaya ve CFSE etiketleme medya 15 dk. 37 ° C'de hücreler her 5 dk Remix.</li>
	<li>Her hücre süspansiyon ve spin hücrelere 475 x g de 5 min için oda sıcaklığında 10 mL tam medya ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve 10 mL soğuk PBS hücrelerde resuspend. 475 x g de 5 min için 4 ° C'de hücreler spin.</li>
	<li>8.4 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri ve mix peptid Geniş puls, CFSEMerhabasaymak-unpulsed, CFSEloile etiketli-hücreleri alıcı fareler içine enjeksiyon için 1:1 oranında etiketli. 1 x 106 temel Akış Sitometresi değerlendirmesi (Bölüm 11) için kullanacağınız hücre karışık bir aliquot tutmak. Not: Son enjeksiyon için fare başına 100 µL birimdir. Son hücre sayısı 10e6 hücreleri olduğunu. Şırınga ve iğne hacim kaybı dikkate alınması gerekir ve 500 µL tahmin edilebilir.</li>
</ol>9. enjeksiyon hedef hücre
Not: CFSE etiketli hücreleri ışık öncesinde ve mümkün olduğu kadar enjeksiyon sırasında korumalı tutun.
<ol><li>Bir restrainer dorsal yüzü alıcı C57BL/6 farelerde yerleştirin. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Tek hücre süspansiyon, 100 µL kuyruk damar içine eğim yüzü yukarı bakacak şekilde intravenöz yönetmek.</li>
</ol>10. yeniden yalıtım hedef hücre
Not: Bu adımı zamanlaması kritik ve CTL sitotoksisite ve uyarılması için antijen gücünü bağımlı değil. Bir OVA257-264 pulsed hedef öldürme değerlendirme için hücreleri enjeksiyon sonra hasat 4-6 h olmak istiyorum. CFSE etiketli hücreleri karanlıkta ışık duyarlı, süreç dalağı olduğundan.
<ol><li>Alıcı C57BL/6 fareler onaylı CO2 boğulma yöntemine göre ötenazi.</li>
	<li>Spleen(s) olduğu gibi adım 2.1.1 kaldırın. Dalak disaggregate ve splenocytes olduğu gibi adımları 2.2.1 - 2.2.3 yıkayın. Kırmızı kan hücreleri adımları 2.3 - 2.3.2 olduğu gibi koşullar.</li>
	<li>Hücreleri (FACs) arabellek (%1 BSA + PBS) sıralama 1 mL Floresans aktif hücredeki değerlendirmesi için Akış Sitometresi tarafından resuspend.</li>
</ol>11. gating mantığı tarafından Akış Sitometresi CTL etkinliğini belirlemek için
<ol><li>
Standart Akış Sitometresi protokolü kullanarak CTL etkinliğini değerlendirmesini gerçekleştirin. Hücrelerin uyarma11488 nm lazer ile bir Akış Sitometresi FITC kanal kullanarak elde.
	<ol>
<li>Canlı lenfositler ileri dağılım (FSC) vs yan dağılım (SSC) parametrelerini kullanarak kapıda. Toplam CFSE pozitif nüfus için canlı lenfosit kapısı içinde subgate. Not: Enjekte CFSE etiketli hücreleri dalak içinde mevcut toplam lenfositlerin küçük bir alt kadar yapacaktır. CSFE-pozitif hücreler günlük ölçekte iki ayrı nüfus olarak görünmesi gerekir.</li>
		<li>Unpulsed (sol üst noktası, CFSElo) ve darbeli (sağ üst noktası, CFSEMerhaba) yüzdesini belirlemek için bir çubuk grafik biçimi kullanın nüfus. CFSEMerhaba hücre kaybı antijen spesifik CTL aktiviteyi göstermektedir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı basit olmakla birlikte, dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken birkaç önemli adımlar vardır. Enjeksiyon antijen spesifik T-hücre test edilen takip covax astar pulsed hedeflerinden herhangi bir öldürme görmek gereklidir. Kısa ömürlü su bazlı formülasyonu yavaş-antijen serbest yağ bazlı bir yaklaşımla yerine su bazlı covax aşı kronik enflamatuar faz için bir akut iltihabi durum oluşturur mümkün olsa daha iyi bir neden olabilir sonucu7,12...

Birden çok iletişim kuralı bir CD8 cytolytic (CTL) potansiyelini değerlendirmek için mevcut+ veya CD4+ T hücre. Bu değerlendirme vitro kontrollü şartlar1,2,3altında kolayca yapılabilir. Buna ek olarak, bulaşıcı hastalık modelleri, LCMV gibi klasik CTL işlev hedef hücreleri etiketli differentially CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) aracılığıyla inceledik nerede CFSEMerhaba-etiketli hücreleri bir peptid ve CFSEloile geniş puls-etiketli hedef hücre are sol unpulsed. Hücreleri sonra bir 1:1 oranında enjekte ve kaybı CFSEMerhabaiçin değerlendirildi-darbeli hedefleri Akış Sitometresi4tarafından etiketli. Aşı ve ret modelleri de benzer stratejileri için kullanmış her iki CD8 tarafından öldürmek vivo içinde değerlendirilmesi+ ve CD4+ T hücreleri de5,6NK hücreleri. Bu güçlü bir tahlil ancak bağışıklık sistemi hedef enjeksiyon önce Başbakan enfeksiyöz ajanlar kullanımını gerektirir.
Bu iletişim kuralı, öte yandan, ana bilgisayarın önceki enfeksiyon gerektirir ve bunun yerine hedef enjeksiyon önce bağışıklık sistemi hazırlamak için bir aşı strateji kullanır. Bu aşı bir su bazlı bir immunostimulatory kokteyl covax7bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) oluşan, adı verilen hükmü gerektiren peptid aşı formülasyon oluşur agonist (imiquimod krem), agonistik bir anti-CD40 antikor ve immunostimulatory maddeleri, yaşla peptid özgü astar ve güçlü bağışıklık yanıtı için sinerjik birleşime önde gelen interleukin-2 (IL-2). Bu nedenle, aşı sadece üç gün önce hedef hücrelerin enjeksiyon ile birlikte işlev değerlendirmesi için hücreleri işletilmektedir gibi bu tahlil CTL işlevinin bir hızlı okuma sağlar. Buna ek olarak, covax astar yeterince güçlü astarlanmalıdır antijen spesifik T hücre öldürme kapasitesi 4 ile 24 h sonra enjeksiyon arasında görülebilir.
Bu protokol büyük sınırlama antijen ve test edilen hipotez için uygundur hedef öldürme tespiti için zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Dikkatli değerlendirme gerçekleştirilmelidir, varyasyonları antijen gücü hem de genetik değişiklikler olarak T-hücreleri test edilen hedef öldürme farklı zamanlama algılamaya gerektirecektir fark CTL işlevinde neden olabilir. Ayrıca, süre peptid uygun konsantrasyonu için aşı insan Melanom antijen glycopeptide 100 (hgp10025-33) için optimize edilmiş ve ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , belirli bir çalışma için daha uygun olabilir başka bir antijen model kullanımı daha fazla doğrulama gerektirir. CTL efektör fonksiyonu covax ile birlikte bir adjuvan olarak uyarmak için bir hedef antijenleri kapasite beklenen farklılıklar nedeniyle IL-2 doz konsantrasyon ve doz sıklığı duruma getirilmesi istenen hedefe ulaşmak için gerekli olabilir. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>6 ila 12 haftalık dişi C57BL / 6 fare&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Siyah 6 fare</td></tr><tr><td>OT-1 6-12 haftalık dişi fareler&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33</alt>&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264</alt>&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>Imiquimod krem %5&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Krem</td></tr><tr><td>CD40'a özel mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>klonu FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2 proteini&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Rekombinant insan IL-2 proteini</td></tr><tr><td>%70 izopropil alkol Hazırlanışı</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-023</td><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>26140-079</td><td>fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu ve nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10492-01</td><td>kırmızı kan hücresi lizis tamponu</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td>penisilin / streptomisin</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C34554</td><td>5- (ve 6) -Karboksifloresein diasetat süksinimidil ester</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCT dereceli doğal&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>mikrosantrifüj tüpü</td></tr><tr><td>% 70 etanol</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi,% 0.4 & nbsp; &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge iğne</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo tahlil antijen spesifik t-hücre cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antijen spesifik öldürmek için mevcut metodolojiler vitro kullanmak için sınırlı veya bulaşıcı hastalık modellerinde kullanılmaktadır. Ancak, değil özellikle enfeksiyon öldürmeden antijen spesifik ölçmek amacıyla bir protokol vardır. Bu iletişim kuralı tasarlanmıştır ve antijen spesifik tespiti için izin vererek bu sınırlamaları aşmak için yöntemler açıklanır hedef hücrenin CD8 tarafından öldürmek+ T hücreleri vivo içinde. Bu bir aşı modeli tahlil öldürmek bir geleneksel CFSE etiketli hedef ile birleştirerek gerçekleştirilir. Bu kombinasyon tahlil tümör büyüme veya enfeksiyon bağımlı olmadığı gibi antijen spesifik CTL potansiyel doğrudan ve hızlı bir şekilde değerlendirmek araştırmacı sağlar. Ayrıca, okuma Akış Sitometresi üzerinde temel alır ve bu yüzden çoğu araştırmacı için kolayca erişilebilir olması gerekir. Çalışmanın büyük sınırlama test edilen hipotez için uygun zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Antijen gücü değişimler ve fark cytolytic işlevinde neden olabilir T hücreleri mutasyonların hücre hasat ve değerlendirme için en uygun zamanı belirlemek için dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Peptid aşılama için uygun konsantrasyonu hgp10025-33 ve OVA257-264için optimize edilmiştir, ama daha fazla doğrulama için belirli bir çalışma daha uygun olabilir diğer peptidler için gerekli olacaktır. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.

Önce enjeksiyon CFSE etiketli hedef hücre 1:1 cep karışımı CFSEMerhaba hem CFSElo hedef hücreleri temel frekansları belirlemek için bir Akış Sitometresi çalıştırılır. Resim 1 A gösterir gating strateji CFSE nüfus değişiklikleri algılamak için bir ilk kapısı FSC ve SSC parametreleri kullanılarak yapılır. Bu nüfus için etiketlenmemiş endojen splenocytes göre nispeten küçük olduğu gibi toplam CFSE pozitif hücreler sonra fre...

Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Bu deneyin genel amacı, bir fare modelinde hedef hücrenin in vivo antijene özgü öldürülmesinin tespit edilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, saldırıya uğramış bir bağışıklık sisteminde hedef hücrelerin antijene özgü sitolitik öldürülmesinin yeterliliği ve tespiti ile in vivo fonksiyonu artırmak için T-hücrelerinin manipülasyonuyla bunun nasıl değiştirilebileceği gibi immünoloji alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, analiz tümör büyümesine veya enfeksiyona bağlı olmadığı için araştırmacının antijene özgü sitolitik potansiyeli doğrudan ve hızlı bir şekilde değerlendirmesine olanak tanımasıdır.Bu prosedürler, Melanom Tıbbi Onkoloji Bölümü'nden Cara Haymaker ve Yared Hailemichael tarafından sunulacaktır. Metin protokolüne uygun olarak fareler anestezi altına alındıktan sonra, enjeksiyon yapılacak kuyruk tabanı bölgesine %70 izopropil alkol püskürtün. Bir şırıngaya takılı 27 gauge iğne kullanarak ve iğnenin eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde, kuyruk tabanı bölgesine dört ila beş milimetre derinliğinde girin ve önceden hazırlanmış 100 µL peptit çözeltisini enjekte edin.Ardından, aşı enjeksiyon bölgesinin yan tarafına 100 µL anti-CD4D antikoru enjekte edin. Aşılama bölgelerine fare başına 50 mg imiquimod krem dikkatlice uygulayın. Krem görünmez hale gelene ve tamamen emilene kadar yüzeye sürün.Ardından, alt karın bölgesinden intraperitonal olarak, mililitre başına 100.000 IU içeren rekombinant insan rhIL-2 proteininden 100 µL enjekte edin. Metin protokolüne uygun olarak farelerden splenositleri izole edip eritrositleri lizledikten sonra, öncelikle hücreleri komple ortamda mililitre başına 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse ederek peptid yüklemesini gerçekleştirin. Hücreleri iki adet 15 mL'lik konik tüpe ayırın ve bunları yüklü veya yüksüz olarak etiketleyin.OVA 257'den 264'e kadar pulsing işlemi için, "pulsed" olarak etiketlenen tüpe mililitre başına bir mikrogram peptit ekleyin. Ardından, pulsed ve unpulsed hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Hedef hücreleri yıkamak için hem pulsed hem de unpulsed tüplerine 10 mL komple besiyeri ekleyin.Ardından, süpernatantı aspire etmeden önce kalan hücreleri 475 x g'de ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin. %2 FBS içeren RPMI 1640'a, mililitre başına 1 mikrolitre CFSE ekleyerek, mililitre başına beş mikromolar nihai konsantrasyonda bir CFSE yüksek etiketleme medyumu hazırlayın. Daha sonra, %2 FBS içeren RPMI 1640'a, mililitre başına bir mikrolitre CFSE ekleyerek, mililitre başına 0.5 mikromolar nihai konsantrasyonda bir CFSE düşük etiketleme medyumu hazırlayın.Hedef splenolitleri etiketlemek için, pulse uygulanmış 10⁶ cells/mL hücreleri hazırlanmış CFSE yüksek etiketleme ortamıyla ve pulse uygulanmamış 10⁶ cells/mL hücreleri CFSE düşük etiketleme ortamıyla yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını hafifçe ters çevirerek veya dairesel hareketlerle karıştırın. Ardından, hücreleri her beş dakikada bir yeniden karıştırarak 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, her bir hücre süspansiyonuna 10 milliliters tam besiyeri ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında, 475 x g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri yeniden süspande etmek için 10 milliliters soğuk PBS kullanın. PBS yıkama işlemini tekrarlamadan önce, hücreleri 4 degrees Celsius sıcaklıkta, 475 x g hızda beş dakika boyunca döndürün.Alıcı farelere enjekte etmek için hücreleri sayın ve peptit yüklü CSFE yüksek etiketli hücreleri, yüklü olmayan CSFE düşük etiketli hücrelerle 1:1 oranında karıştırın. Bazal akış sitometrisi değerlendirmesinde kullanmak üzere, karıştırılmış hücrelerden 1 × 10⁶'lik bir alikotu ayırın. Yazılı protokole uygun olarak hücreleri enjekte edip hedef hücreleri yeniden izole ettikten sonra, uyarılma için 488 nanometre lazer ile FITC kanalı kullanılarak hücreleri elde edip standart bir akış sitometrisi protokolü ile CTL aktivitesi değerlendirmesini gerçekleştirin.CFSE ile işaretlenmiş hedef hücrelerin enjeksiyonundan önce, hem CFSE yüksek hem de CFSE düşük hedef hücrelerin bazal frekanslarını belirlemek için 1:1 hücre karışımı bir akış sitometresinde analiz edilmiştir. Burada, CFSE popülasyonlarındaki değişiklikleri tespit etmek için kullanılan kapılama stratejisi gösterilmektedir. İlk kapılama, FSC ve SSC parametreleri kullanılarak yapılmıştır.Toplam CSFE pozitif hücreler, etiketsiz endojen splenositlerle karşılaştırıldığında bu popülasyon nispeten küçük olduğundan, frekanstaki değişiklikler değerlendirilmeden önce alt kapılamıştır (subgated). Enjeksiyondan önceki CSFE popülasyonlarının göreli frekansına bir örnek burada gösterilmiştir ve bu oran bire bir civarında olmalıdır. Covex priming işleminin gerekliliği, enjeksiyondan 24 saat sonra antijenle pulse edilmiş CSFE yüksek hedef hücrelerde herhangi bir öldürme gözlemlenmediği bu panelde görülmektedir.Bu şekil, enjeksiyon öncesinde gözlemlenen pikin neredeyse tespit edilemez hale gelmesi ve oranın %50'den %1 tespit oranına çarpıcı bir şekilde kaymasıyla, antijen yüklü CFSE yüksek etiketli hedef hücrelerin etkili bir şekilde öldürüldüğünü göstermektedir. Son olarak şekil, enjeksiyondan 6 ve 24 saat sonra bu popülasyondaki kaybı değerlendirerek, antijen yüklü CFSE yüksek etiketli hedef hücre öldürülmesinin kinetiğini de sunmaktadır. Uzmanlaşıldığında bu teknik, antijen ve T hücresi fonksiyonuna bağlı olarak iki ila üç günde gerçekleştirilebilir.Bu prosedür uygulanırken, CSFE etiketlemesinin homojen olması gerektiği ve analiz gerçekleştirilmeden önce CTL yanıtının kinetiğinin değerlendirilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Bu prosedürü takiben, efektör fonksiyonundaki değişiklikleri değerlendirmek ve diğer ek soruları yanıtlamak için ELISA, ELISPOT ve hücre içi akış sitometrisi boyama gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir enfeksiyon veya tümör yokluğunda in vivo CTL fonksiyonunun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Birçok enfeksiyonları güçlü bir CTL yanıtı ortaya çıkarmak, fakat bazen yanıt hücrelerinin miktarı patojenin kontrol etmek için orantılı...

Antijen Özgül In Vivo</emKAKE Etiketli Hedef Hücreler> Killing Testi

Bu videoda, piyasada bulunan aşıların immünojenisitesini ölçmek için monositten türetilmiş dendritik hücreli, MoDC tabanlı bir test gösterilmektedir. MoDC tahlilleri, antijenlere, patojenlere veya tedavilere karşı dendritik hücre tepkilerini araştırır ve bağışıklık tepkileri, aşı geliştirme ve immünoterapi araştırmaları hakkında bilgi sağlayabilir.

Lenfosit Proliferasyonunu İndüklemek için Aşı Darbeli Dendritik Hücre Bazlı İn Vitro Test

Video, in vivo adjuvan kaynaklı sitotoksik T lenfosit veya CTL üretimini izlemek için immünolojik bir yöntemi göstermektedir. Bir fareye genetik olarak tasarlanmış, proliferatif boya lekeli donör CD8 + T lenfositleri önceden enjekte edilir. Ovalbüminin adjuvanlarla deri altı enjeksiyonu, hasat sonrası immün boyama ve akış sitometrisi yoluyla tanımlanan sitotoksik CD8 + T lenfositleri oluşturur.

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik

Biz HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salgılanmasının düzenlenmesinde immünregulatuar yolların rolünü araştırmak için bir in vitro testi geliştirdi.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Öğrenin, fare modelinde antijen spesifik sitotoksik öldürme yöntemini. Bu teknik, T hücre manipülasyonu ile immün yanıtları hızlıca değerlendirmeyi sağlar ve sitolitik potansiyeli doğrudan ölçer.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Daha fazla video keşfet