Name: Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Keşfedin CORALINA yöntemiyle herhangi bir DNA kaynağından kapsamlı gRNA kütüphaneleri oluşturmayı. Mikrokokkal nükleaz enzimatik sindirimi kullanan bu maliyet etkin protokol, CRISPR tabanlı tarama çalışmaları için geleneksel yöntemlere güçlü bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Prof. Dr. Stephan Beck ve Prof. Dr. Magdalena Goetz onların bilgi için teşekkürler, yardımcı ve CORALINA yöntemi, Maximilian Wiessbeck ve Valentin Baumann yararlı yorumlar için gelişmekte olan destek istiyorum. İş DFG (STR 1385/1-1) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+editing%3A+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li>
<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CORALINA hedef DNA kontrollü nükleaz sindirim tarafından büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak ve elde edilen çift telli parçalarını klonlama toplu için kullanılabilir. İstatistiksel çıkarsama çok fazla 107 bireysel gRNA dizileri zaten başarıyla el9iletişim kuralını kullanarak klonlanmış olduğunu gösterir. CORALINA birden fazla şekilde özelleştirilebilir. Seçtiğiniz şablon DNA bir hedef bölge ve oluşturulan Kütüphane maksimal karmaşıklığı tanımlar. Bu iletişim kuralını kullanan, CORALINA kütüphaneler insandan daha önce oluşturulmuş olan ve genomik DNA fare9. Temsilcisi sonuçları burada sunulan arıtılmış BAC DNA CORALINA kitaplıktan nesil tasvir. Daha fazla özelleştirme gRNA ifade vektör ve bağlayıcı sıraları seçimi ile elde edilebilir. Biz daha önce bağlayıcı uzunlukları Gibson derleme için üç farklı çift küçük farklılıklar nedeniyle verimliliği9' test ettik.
Sindirmek toplu DNA kökenlerine nedeniyle CORALINA gRNAs protospacer değildir genellikle tam olarak 20 bp uzunluğu, ama göstermek her ikisi de bağlıdır bir ortalamaya sahip bir uzunluğu dağıtım MNase sindirim parametrelerinin yanı sıra eksizyon boyutunu yapılan sayfa jel s. şekil 2B ve C, gösterilen temsilcisi örnek parçaları ortalama uzunluğu 19 ve 27 bp arasında gösterilmektedir. Deneyim, parçaları uzunluğu sadakatle oluşturulan gRNA protospacer9tarafından korunur. Süre parçaları 20 kısa bp elde edilen gRNAs daha yüksek hedef kapalı oranı nedeniyle kaçınılmalıdır, uzun parçaları büyük olasılıkla bir sorun olduğundan beri aşağı akım uygulamalarda çok daha az gösterdi o gRNAs protospacers 45 sürece ile kan basıncı hala vardır fonksiyonel9.
CORALINA protokolü en kritik iki adımda MNase sindirilmiş parçaları ve klonlama adımları boyutu yelpazesi vardır. Çok kısa parçaları nesil (örneğin ortalamanın altında 18 bp) veya çok fazla boş gRNA ifade vektörel çizimler birleşme-render Kütüphane işe yaramaz. Böylece, MNase sindirim adım (şekil 2A) en iyi duruma getirmek, eksizyon (şekil 2B, C), izlemek için gRNA vektör omurga tam sindirim için kontrol ve protokol boyunca hiçbir parçası denetimleri de dahil olmak üzere önemlidir. Özel bakım gRNA Kütüphane gösterimi korumak için alınacak have. Kütüphane nesil bir ortak performans sorunu genel olarak plazmid verimli transfer içine bakteri amplifikasyon için var. Böylece, bol miktarda bakteri ile mükemmel yetkinlik ve bireysel elektroporasyon olaylar, çok sayıda gRNA klon yüksek bir sayı elde etmek için gerekli.
GRNA Kütüphane üretim için yeni stratejiler CRISPR tabanlı tarama yaklaşımlar sonraki on yıl boyunca tam potansiyelini hasat için gerekli olacaktır. Önceden tarama mükellef sistemleri modellemek ve CRISPR tabanlı farklı mühendislik yaklaşımlar daha büyük bir dizi yapmak için gerekli büyük ölçekli kütüphaneler, oluşturmak düşük maliyetli, basit ve özelleştirilebilir yöntemleri için önemli bir talep vardır. Bu doğru bir ilk adım CORALINA sağlamaktadır. Potansiyel kullanır manifold özellikle genleri kapsamlı kütüphaneler üretmek için, daha az yaygın model sistemleri kütüphanelerin, son derece odaklanmış kütüphaneler ve hangi farklı CRISPR proteinler (farklı PAM ile deneysel set-up cDNA elde gereksinimleri) birlikte kullanılır.
Diğer yöntemler aksine, CORALINA girişten DNA tüm olası gRNAs oluşturur. Ancak, gerekli PAM sıra eksik gRNAs kütüphanede, gRNA kitaplığı oluşturmak için CRISPR yiyen (Tablo 1) ikinci bir enzimatik yöntem ile paylaşan bir özelliği de eklenmiştir yönteminin bir dezavantajı vardır. İdeal yöntem seçimi gRNA Kütüphane üretimi planlanan tarama özellikleri üzerinde bağlıdır için deneme, özellikle doğa (genetik, düzenleyici, intergenic) ve hedef bölgenin (tek odağı, birden çok bölge, genom çapında) boyutunu. Biz CORALINA kodlamayan, çok sayıda zaman kullanarak özel bir ters görmek veya düzenleyici bölgeleridir çözümlenmesi için eksik veya güvenilmez sırası bilgi ise (egzotik model sistemleri, türleri (örneğin microbiomes) karışımları veya deneysel olarak elde giriş), farklı CRISPR endonucleases birleştirilir veya analiz doyurarak kısa ve tanımlanmış bir odağı (BACs tarafından temsilörneğin ) gerçekleştirilir.

Bakteriyel CRISPR/Cas9 sistem adaptasyonu moleküler hedefleme aracı olarak Moleküler biyolojide en son devrim neden oldu. Daha önce hiç Kromatin tanımlanmış genomik yerlerde işlemek çok kolay. CRISPR ortak uygulamalar arasında hedeflenen gen mutasyonlar1, genom mühendislik2,3, transkripsiyon harekete geçirmek ve4susturmak gen düzenleme epigenome. GRNA kütüphaneler daha az önyargılı ekranlar mümkün kılmak gibi bir belirli CRISPR sistem uygulamaları iyi okudu aday sitelere sınırlı değildir avantajdır. Bunlar olmadan herhangi bir ön deneysel bilgi genom içinde işlevsel loci keşfi kolaylaştırmak. Ancak, gRNA Kütüphane inşaat şu anda çoğunlukla oligo-nükleotit sentezi dayanır ve insan değildir gRNA kütüphaneler satın almak için sınırlı seçenekler ya da fare kaynak veya hedef bölgeleri dışında çerçeveler okuma açık. CRISPR ekranlar zaten inanılmaz güçlü5,6,7,8, kanıtlanmış ancak böylece, kendi potansiyellerini henüz istismar değil.
Üstesinden gelmek için klasik gRNA nesil yöntemleri iki stratejileri sınırlandırılması son zamanlarda geliştirilmiştir. Her ikisi de hedef DNA üzerinde özel Oligonükleotid sentez güvenerek daha kontrollü Enzimatik sindirim temel alır. İken CORALINA9 micrococcal nükleaz, sadece mevcut alternatif yöntem10CRISPR yiyen, geçici kullanma-enzimleri (HpaII, ScrFben Bfaben ve Mmeben). Önemlisi, her iki teknik gRNA protospacer dizileri kaynağı olarak hizmet veren giriş DNA var mı, uygulanabilir. CRISPR yiyen yöntemi klonlanmış gRNAs gerekli S.pyogenes PAM (protospacer bitişik güdü) hedefleme olan siteleri takip sayısını azaltmak için bir strateji iken, tüm olası fonksiyonel gRNAs için sadece küçük bir kısmını oluşturur bir belirli bölge. CORALINA, öte yandan, kaynak sırası için tüm olası gRNAs oluşturmak yapabiliyor ama aynı zamanda işlevsel olmayan kılavuzları daha yüksek bir kısmını içermektedir. gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile sağlar kapsamlı gRNA kütüphaneleri herhangi bir tür için üretim herhangi bir Cas9-protein veya - efektör sistemi basit ve maliyet-etkin bir şekilde. Ayrıca, kitaplık türü, boyutu ve içerik uygun giriş ve vektör seçenekleri tanımlamak gibi CORALINA özelleştirme için uyarlanabilir. Burada ayrıntılı bir protokol bu anlatılan bakteriyel yapay kromozomu (BACs) veya genomik DNA9dahil olmak üzere nesil DNA (şekil 1), farklı kaynaklardan gelen kapsamlı gRNA kitaplıkları için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı eşlik eden temsilcisi sonuçları BAC DNA'yı CORALINA Protokolü uygulayarak elde edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Mnase</td></tr><tr><td>Novex Yüksek Yoğunluklu TBE Numune Tamponunun</td> İnaktivasyonu <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Jeller, %20, 10 kuyulu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., önceden yapılmış %20 PAGE jel</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Merdiveni,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Koşu Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE jel çalışma tamponu</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık neşter, steril</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3., diğer eşdeğer reaktifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>SYBR Green I nükleik asit boyası (DMSO'da 1000x konsantre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., ayrıca Thermo Fisher Scientific'ten de temin edilebilir (S7563)</td></tr><tr><td>UltraPure Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., diğer eşdeğer reaktifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., diğer eşdeğer reaktifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>3M Sodyum asetat, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., diğer eşdeğer reaktifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Hızlı köreltme kiti&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>amonyum asetat</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., diğer eşdeğer reaktifler</td></tr><tr><td>kullanılabilir magnezyum asetat</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., diğer eşdeğer reaktifler</td></tr><tr><td>kullanılabilir 0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp; MOLEM37465520 (veya Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., diğer eşdeğer reaktifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP boncukları</td><td>Beckman coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., diğer eşdeğer reaktifler konsantre</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td> <td>kullanılabilir; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Uzun Amfi Taq 2X Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biyolojik Laboratuvarları</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., diğer eşdeğer reaktifler kullanılabilir</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP, dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>T5 eksonükleaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimeraz&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>TG1 yetkili hücreler</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>1mm boşluklu elektroporasyon küvetleri&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.Biyo-Tahlil</td></tr> <tr><td>Kabı (Polistiren, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr>9.3.Bakto-tripton<td></td> <td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td>, <td></td></tr><tr><td>Micropulser</td><td>boyunca Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küvetleri</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.250</td></tr> <tr><td>ml santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

büyük ölçekli grna kütüphane üretim herhangi bir dna kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Genom ve epigenome mühendisliği için CRISPR/Cas9 sistemi popülerlik onun sadelik ve adaptasyon kaynaklanıyor. Bir efektör (Cas9 nükleaz veya nükleaz ölü dCas9 füzyon proteini) tarafından Kılavuzu RNA veya gRNA olarak bilinen küçük bir sentetik RNA genomu belirli bir sitedeki hedeflenmektedir. CRISPR sistem önerebilirim doğası plazmid kitaplıkları içeren ifade kaset binlerce bireysel gRNAs tek bir deney birçok farklı sitelerdeki sorgulamak için kullanılabilir beri yaklaşımlar eleme içinde kullanımı sağlar.
Bugüne kadar gRNA dizileri kitaplıkları inşası için neredeyse sadece kütüphane serilerinde ulaşılabilir karmaşıklığı sınırlar ve görece maliyet yoğun Oligonükleotid sentezi tarafından üretilmedi. Burada, ayrıntılı bir protokol CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile), basit ve son derece karmaşık gRNA kütüphaneler nesil için düşük maliyetli yöntemi, giriş DNA Enzimatik sindirim üzerinde temel açıklanan. DNA'ın herhangi bir kaynaktan CORALINA kütüphaneleri oluşturulabilir beri pek çok seçenek özelleştirme için çok çeşitli ekranlar CRISPR tabanlı etkinleştirme mevcuttur.

El altında iletişim kuralını kullanarak, CORALINA gRNA kütüphaneler insan ve fare genomik DNA9 ve BAC DNA (şekil 1) üretilmedi. Giriş DNA gRNA ifade vektörel çizimler klonlama için uygun parçaları üretmek için kontrollü nükleaz sindirim için optimal koşullar belirlenmesi gerekir. Tipik bir sonuç micrococcal nükleaz sindirim optimizasyonu için şekil 2Atasvir edilir. Nükleaz yetersiz miktarda (0,1, 2, 3, 4, 4,5-5 birimleri) üretir (10-100 bp) gereken boyut aralığındaki göze çarpan ürün ve 5,5-7,5 birimleri hala üretilen ortalama olarak çok uzun olan parçaları. Enzim (50 adet) daha büyük miktarlarda giriş DNA aşırı düşüşü 10 dk sonra yol. Sonuç olarak, bir ara tutar (10 adet) seçildi. "Denemeler" den yeterince üretmek için parçaları sonraki arıtma ve (şekil 2B) klonlama için sindirilmiş ölçekli. Bu körü körüne DNA parçalarının boyutuna göre seçin ve sadece DNA parçalarının ışığa maruz kalma UV en aza indirmek oryantasyon DNA merdiveninde itimat için tavsiye edilir iken, jelleri sindirim ve kesme kalite kontrolü için daha sonra Boyanabilen. Şekil 2B hangi DNA parçaları arasında 20 ve 30 bp eksize bir sayfa jel temsil edici bir örnek gösterir. Jel saf MNase parçaları başarılı boyutu seçimi ve arıtma MNase sindirilmiş parçaları (şekil 2C) kontrol etmek için sayfa jel % 20 yüklü. İletişim kuralı el altında özelleştirilmiş Bağlayıcı sıraları, MNase sindirilmiş parçaları seçim gRNA ifade vektörel çizimler clone için izin kullanımı ile uyumludur. Burada, gRNA-PLKO9 bel kemiği olarak kullanıldı. Halkalı standart PCR kullanarak gRNA ifade vektör güçlendirilmiş. Şekil 2B güçlendirilmiş Bağlayıcı sıraları ek, yanlış, yoksun veya hiçbir şablon amplicons temsil edici bir örnek gösterilmektedir. Daha sonra bağlayıcı amplicons halkalı doğru yönde MNase sindirilmiş parçaları üzerine bakmaksızın emin olmak için enzimleri ile sindirmek. Şekil 2B özel jelleri 5' ve 3' halkalı, önce ve sonra sindirim HindIII ve SacII ile sırasıyla gösterir gösteren öngörülen 637 ve 295 halkalı tam sindirim kan basıncı. Jel görüntünün sağ kısmı sindirilir bağlayıcı parçaları eksizyon makaleler. Aşağıda sindirilir halkalı çıkarımı jel, halkalı MNase sindirilmiş sonunda tamir parçaları için ligasyonu protokolündeki sonraki adımdır. Bağlayıcı sıraları unphosphorylated primerler kullanılarak PCR tarafından üretmediğinden halkalı öz ligasyonu değil vuku bulmak. Sadece son tamir MNase sindirilmiş DNA parçaları fosfat grupları ligasyonu için gerekli sağlar. Nick çeviri ligasyonu ürün PCR ile güçlendirilmiş. GRNA dizileri kütüphanede gösterimi çarpık aşırı PCR güçlendirme önyargı önlemek için amplifikasyon 20'den az döngüleri toplam sınırlıdır. PCR, amplifikasyon ürünleri özel jeller üzerinde görselleştirmek zordur. Ayrı denetim PCR 32 çevrimleri ile bu nedenle ürünleri algılamak için gerçekleştirilir (ancak Kütüphane hazırlık için kullanılmaz). Bu denetim sonuçlarını PCR şekil 2Eiçinde gösterilen. Bu tüp ligasyonu reaksiyonlar optimize etmek ve reaksiyonlar bazen "hiçbir parçaları denetimlerde" oluşan PCR eserler yoksun sağlamak için sağlar (NFC). Şekil 2E istenen amplicon gösterir (5' bağlayıcı + DNA parçası + 3' bağlayıcı, uzunluk: 869 bp) amplifikasyon ligasyonu reaksiyonların ekimolar (1:1) oranları parçaları ve bağlayıcı sıraları arasında kullanarak takip.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Resim 1 : GRNA kitaplığı hazırlanması için zaman çizelgesi önerdi. CORALINA basit ve maliyet-etkin bir strateji kapsamlı gRNA kitaplıkları oluşturmak için farklı DNA kaynaklardan herhangi bir organizma bir bolluk sunmaktadır. İletişim kuralı el altında tamamlanması sırasında iş günü getirilebilir. Bağlayıcı üretimi, DNA sonu-tamiri ile paralel olarak gerçekleştirilebilir. Electrocompetent bakteri hazırlanması iki gün sürer ve bir gecede büyüme adım içerir ve bu nedenle reaksiyonlar ayarlanır derleme önce başlatılmalıdır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Resim 2 : Protokol sırasında kritik adımlar. (A)kontrollü sindirim BAC DNA parçaları farklı boyutlarda nesil sağlar. Burada gösterilen MNase sindirim optimizasyonu olduğunu. 10 dk. 10 U MNase oluşturmak için DNA parçalarının İstenilen uzunlukta (20-30 bp) saf BAC DNA MNase farklı miktarda ile tedavi edildi. (B) boyutu parçaları eksizyon üzerinden polyacrylamide Jeller kullanarak 20 ve 30 bp arasında seçim. Arıtılmış BAC DNA 10 U MNase 10 dk ile tedavi edildi. Görüntü eksizyonu kaydedildi. (C) kalite kontrol, jel saf parçacıkları. Jel-arıtma sonra 1/6th saf MNase parçaları yüklü olduğunu %20 başarılı boyutu seçimi ve arıtma denetlemek için sayfa jel. (D) amplifikasyon halkalı yönlü klonlama emin olmak için derleme ve restriksiyon enzimi hazım için bağlayıcı sıraları. 5' ve 3' halkalı güçlendirilmiş ve HindIII ve SacII, sırasıyla kesti. Hayır-şablonu denetimler (NTC) PCR eserler ve DNA kirlenme için denetime dahil edildi. Sol: analitik örnek uygulama; doğru: partiye hazırlık örnek uygulama. Görüntü Jel kesme sonra kaydedildi. Halkalı DNA parçaları için (E) başarılı ligasyonu PCR artan sayıda PCR döngüsü (32) ile kullanarak ve hiçbir şablon kontrolleri ile H2O (NTC) gerçekleştirme veya önceki nick çeviri adımdaki NTC kullanarak kontrol analiz edilebilir giriş olarak (NTC NT)). Bir amplifikasyon ligasyonu ve nick çeviri tepki içinden MNase parçaları ihmal olan bir parça kontrol (NFC), eklemek önemlidir. Beklenen amplicon hangi MNase Birleşik parçalar bağlayıcı ile DNA örnekleri üretmek sadece (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Bu yöntemin genel amacı, herhangi bir kaynaktan elde edilen saflaştırılmış DNA'dan kapsamlı kılavuz RNA kütüphaneleri oluşturmaktır. gRNA kütüphaneleri, CRISPR tabanlı taramalarda kullanılan plazmid koleksiyonlarıdır. CORALINA yöntemi, elde edilen fragmanları bir kılavuz RNA kütüphanesi iskeletine klonlamak için saflaştırılmış DNA'nın enzimatik sindirimini kullanır.Bu tekniğin temel avantajı, girdi dizisinden tüm olası kılavuz RNA'ları üretmesi ve oldukça maliyet etkin olmasıdır. Bu video, bakteriyel yapay kromozomdan elde edilen bir CORALINA kütüphanesinin korunmasını göstermesine rağmen, bu yöntem prensipte herhangi bir organizmadan alınan herhangi bir girdi DNA türüne uygulanabilir. Her yeni mikrokokal nükleaz partisi için mikrokokal nükleaz sindiriminin optimizasyonu gerçekleştirilmelidir.Her bir reaksiyon için şunları hazırlayın. 1 µL 10x mikrokokal nükleaz tamponu, 1x sığır serum albümini, 1 µg hedef DNA, 1 µL mikrokokal nükleaz ve toplam hacim 10 µL olacak şekilde su ekleyin. 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Bir mikrolitre 500 millimolar EGTA ekleyerek enzimi hemen inaktive edin. DNA örneklerine jel yükleme boyalı örnek tamponu ekleyin ve %20 poliakrilamid jele her kuyucuğa bir mikrogram DNA yükleyin. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yükleyin.Jeli 1x TBE yürütme tamponunda, 150 volt değerinde yaklaşık 1,5 saat boyunca veya alt boya önü jelin alt ucuna ulaşana kadar yürütün. Jeli ultra hassas bir nükleik asit boyasıyla boyayın ve UV ışığı altında görselleştirin. Bu örnekte, DNA'yı 20 ila 30 baz çifti boyutuna kadar sindirmek için optimum mikrokokal nükleaz konsantrasyonu 10 üniteydi.Optimizasyon reaksiyonları için gösterilen yöntemle, 10 ila 12 mikrogram hedef DNA'yı sindirmek için mikrokokkal nükleazın bu optimum konsantrasyonunu kullanın. DNA fragmanlarını PAGE ile ayırdıktan sonra, marker şeridinin yanındaki jeli kesmek için steril bir neşter kullanın ve jelin yalnızca ladder içeren kısmını, ultra hassas bir nükleik asit boyası içeren taze 1x TBE yürütme tamponu ile boyayın. DNA ladder'ını görselleştirin ve yaklaşık 18 ila 30 baz çifti boyut aralığındaki mikrokokkal nükleaz ile sindirilmiş DNA fragmanlarını çıkarmak için bir jilet kullanın.Jel dilimini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Jelinin geri kalanını, daha önce gösterildiği gibi nükleik asit boyasıyla boyayın. Jeli UV ışığına maruz bırakın ve jel kesme adımının kaydı olarak bir görüntü alın.Bu prosedüre, kesilen jel dilimini mikro santrifüj tüpünün çeperine karşı steril bir pipet ucu kullanarak ezerek başlayın. İki jel hacmi kadar PAGE çözündürme tamponu ekleyin ve döner bir platformda 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, örneği bir mikro santrifüjde maksimum hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin.Ezilmiş jel parçalarını transfer etmemeye dikkat ederek süpernatantları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Jel peletine 0,5 hacim PAGE çözündürme tamponu ekleyin, vorteksleyin ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Süpernatantları birleştirin ve metin protokolünde belirtilen standart fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemini kullanarak DNA fragmanlarını ekstrakte edin.DNA fragmanlarının izolasyonuyla paralel olarak, standart PCR kullanarak rehber RNA ekspresyon vektöründen linkerleri amplifiye edin. Yönlü klonlamayı sağlamak için linkerler, metin protokolünde açıklandığı şekilde uygun restriksiyon enzimleri ile sindirilir. Linkerlerin restriksiyon enzim sindirimini yüzde birlik agaroz jelde yürütün.Doğru bantları kesin ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilen jel parçalarından DNA'yı saflaştırın. Uç onarım reaksiyonu için bir DNA blunting kiti kullanılır. Aşağıdakileri bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.10 µL saflaştırılmış DNA, 1,5 µL 10x blunting tamponu, 1,5 µL 1 mM dNTP karışımı, 1,4 µL su ve 0,6 µL blunting enzimi ekleyin. 22 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından enzimi 70 °C'de 10 dakika inkübasyonla ısıtarak aktive edin. 85 µL su ekleyin ve metin protokolünde açıklandığı şekilde bir reaksiyon temizleme işlemi gerçekleştirin.Metin protokolünde açıklandığı gibi, mikrokokkal nükleaz ile sindirilmiş ve onarılmış fragmanlar ile linker dizilerini eşit molar miktarlarda kullanarak 14 µL'lik bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Nick translasyonunun ardından, ligasyon ürünü PCR ile amplifiye edilir. Doğru şekilde 5' ve 3' linkerleri bağlanmış mikrokokkal nükleaz fragmanlarını, iki adet 5' veya iki adet 3' linkeri içeren fragmanlardan ayırmak için tüm 15 döngülü PCR reaksiyonlarını birleştirin, DNA yükleme boyası ekleyin ve %0,8'lik agaroz jelde yürütün.869 baz çiftindeki belirgin bandı kesin ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın. DNA miktarını bir spektrofotometre kullanarak belirleyin. Ardından, PCR ile amplifiye edilen fragmanları, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere Gibson assembly yöntemiyle kılavuz RNA ekspresyon vektörüne klonlayın.Bu prosedüre başlamak için, saflaştırılmış vektör insert konstrüktunu steril ve önceden soğutulmuş PCR tüplerine paylaştırın ve buz üzerinde tutun. Bir milimetrelik boşluğa sahip elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun. Taze hazırlanmış TG1 hücrelerinden 25 µL miktarını doğrudan bir DNA alikotuna ekleyin ve karışımı derhal bir elektroporasyon küvetine aktarın.Hücrelerin ve DNA karışımının, hapsolmuş hava veya kabarcık kalmadan küvet bölmesi boyunca dağıldığından emin olmak için küvete hafifçe vurun veya dokunun. Küveti lam bölmesine yerleştirin ve uygun elektroporasyon programını başlatın. Hemen ardından küvete oda sıcaklığında 475 µL 2TY ekleyin.Elektropore edilmiş bakterileri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Münferit elektroporasyonları tekrarlayın, tek bir kütüphaneyle transforme edilmiş tüm hücreleri bir 50 mililitrelik tüpte toplayın ve toplam hacmi kaydedin. Tüm kütüphane için toplam koloni sayısını tahmin etmek amacıyla, kütüphaneyle transforme edilmiş bakterilerden belirlenmiş küçük bir miktarı, uygun antibiyotik seçimi içeren 10 santimetrelik bir agar plakına ekin.Kalan bakterilerin hacmini azaltmak için, yaklaşık 4,000 g'de 10 dakika boyunca veya görünür bir pelet oluşup süpernatant berraklaşana kadar santrifüjleyin. Süpernatantın birkaç mililitresi hariç tamamını uzaklaştırın ve hücreleri yeniden süspande edin. Bakterileri, uygun antibiyotik seleksiyonu içeren 2TY agar kaplı biyolojik analiz plaklarına ekin.pUC19 kontrol elektroporasyon reaksiyonunun uygun hacmini, uygun antibiyotik seçimi içeren ek bir 10 santimetre agar plağına yayın. Agar plaklarını 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bakteriler için mikrogram DNA başına koloni oluşturan birim sayısını ve kütüphane karmaşıklığını tahmin etmek için kontrol plaklarındaki koloni sayısını sayın.Son olarak, plazmid DNA ekstraksiyonu için bakterileri plakadan sıyırın. Jel saflaştırmasından sonra, başarılı boyut seçimini ve saflaştırmayı doğrulamak için saflaştırılmış mikrokokal nükleaz fragmanlarının 1/6'sı %20'lik bir PAGE jeline yüklendi. Linkerların, mikrokokal nükleaz ile sindirilmiş fragmanlara doğru yönde ligatlandığından emin olmak için linker amplikonları restriksiyon enzimleri ile sindirildi.Bu temsili jel görüntüsünün sol tarafı, sırasıyla HindIII ve SacII ile sindirim öncesi ve sonrası beş prime ve üç prime linkerlarını göstermekte olup, linkerların öngörülen 637 baz çifti ve 295 baz çiftine tam sindirildiğini belirtmektedir. Jel görüntüsünün sağ tarafı, sindirilmiş linker fragmanlarının eksizyonunu belgelemektedir. Linkerların DNA fragmanlarına başarılı ligasyonu, artırılmış PCR döngü sayısı kullanılarak PCR ile analiz edilmiştir.Kontroller arasında, önceki çentik çevirisi adımından gelen "şablon içermeyen kontrol"ün girdi olarak kullanıldığı bir şablon içermeyen kontrol ve bir mikrokokkal nükleaz fragman kontrolü yer almıştır. Yalnızca mikrokokkal nükleaz fragmanlarının linker DNA ile birleştirildiği örnekler, beklenen 869 baz çiftlik amplikonu üretmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde beş günde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, kütüphanenin karmaşıklığını korumak ve diğer kontrol reaksiyonlarını gerçekleştirmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA'yı küçük parçalara ayırıp bunları kütüphane vektör omurgasına klonlayarak CRISPR tabanlı taramalar için bir rehber RNA kütüphanesinin nasıl oluşturulacağı konusunda artık iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-universal-protocol-for-large-scale-grna-library-production-from-any

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Aday düzenleyici elemanların, tanımlayıcı dizi etiketlerini taşıyan raportör genlere bağlanması, bu tahlillerin büyük ölçüde paralelleştirilmesini sağlar.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA'ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Mikroskobik organizmaların genomik sıralama sırasında kontaminasyon büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. İşte, bir tardigrade tek bir örnekten genom genomik DNA tüm genom amplifikasyon olmadan bulaşma riskini en aza indirmek için olduğu kadar az 50 pg ile sıralamak için bir yöntemi göstermektedir.

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Burada, dize derleme gRNA (STAgR), klonlama mevcut CRISPR/Cas9 yaklaşıyor kolayca gRNA vektörler multiplex için bir yöntem. STAgR basit, etkili ve özelleştirilebilir gRNA çoğullama yapar.

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

Bu makalede, yerinde üretilen nükleik asit mikrodizilerinin sentezi ve uygulamalarındaki yeni gelişmeleri sunmakta ve tartışıyoruz. Özellikle, DNA sentezi protokollerinin RNA'ya nasıl genişletilebileceğini ve mikrodizilerin geri alınabilir nükleik asit kitaplıkları oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Halka açık cDNA/ORF kaynaklarını kullanarak Drosophila'daki UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerini düzenlemek için uygulanabilir.

UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj

Bu protokol, otomasyon destekli genetik kütüphane oluşturma ve değerlendirme yoluyla genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin sistematik küresel optimizasyonu için bir yöntem sağlar. Bu, deneyleri kolaylaştırmak ve biyosensörleri belirli tasarım sonuçlarına göre ayarlamak için genetik bileşenlerin seçimini sağlamak için deney tasarımı metodolojileriyle birleştirilir.

Genetik Olarak Kodlanmış Biyosensör Tasarım Alanının Verimli Örneklenmesi, Deney Tasarımı ve Otomasyon İş Akışı ile Etkinleştirildi

Keşfedin CORALINA yöntemiyle herhangi bir DNA kaynağından kapsamlı gRNA kütüphaneleri oluşturmayı. Mikrokokkal nükleaz enzimatik sindirimi kullanan bu maliyet etkin protokol, CRISPR tabanlı tarama çalışmaları için geleneksel yöntemlere güçlü bir alternatif sunar.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet