Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

Bu yöntemin genel amacı, herhangi bir kaynaktan saflaştırılmış DNA'dan kapsamlı kılavuz RNA kütüphaneleri oluşturmaktır. gRNA kütüphaneleri, CRISPR tabanlı ekranlarda kullanılan plazmit koleksiyonlarıdır. CORALINA yöntemi, elde edilen parçaları bir kılavuz RNA kütüphanesi omurgasına klonlamak için saflaştırılmış DNA'nın enzimatik sindirimini kullanır.

Bu tekniğin temel avantajı, giriş dizisinden olası tüm kılavuz RNA'ları üretmesi ve çok uygun maliyetli olmasıdır. Bu video, bir CORALINA kütüphanesinin bakteriyel bir yapay kromozomdan korunmasını gösterse de, bu yöntem prensip olarak herhangi bir organizmadan gelen herhangi bir giriş DNA'sına uygulanabilir. Her yeni mikrokokal nükleaz partisi için mikrokokal nükleaz sindiriminin optimizasyonu yapılmalıdır.

Her reaksiyon için aşağıdakileri ayarlayın. Bir mikrolitre 10x mikrokokal nükleaz tamponu, 1x sığır serum albümini, bir mikrogram hedef DNA, bir mikrolitre mikrokokal nükleaz ve 10 mikrolitreye kadar su. 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Bir mikrolitre 500 milimolar EGTA ekleyerek enzimi hemen inaktive edin. DNA örneklerine jel yükleme boyası ile örnek tamponu ekleyin ve %20'lik bir poliakrilamid jel içinde oyuk başına bir mikrogram DNA yükleyin. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yükleyin.

Jeli, yaklaşık 1,5 saat boyunca veya alt boya cephesi jelin alt ucuna ulaşana kadar 150 voltta 1x TBE çalışma tamponunda çalıştırın. Jeli ultra hassas bir nükleik asit boyası kullanarak boyayın ve UV ışığı altında görselleştirin. Bu örnekte, DNA'yı boyut olarak 20 ila 30 baz çiftine kadar sindirmek için optimum mikrokokal nükleaz konsantrasyonu 10 birimdi.

Optimizasyon reaksiyonları için gösterildiği gibi 10 ila 12 mikrogram hedef DNA'yı sindirmek için bu optimum mikrokokal nükleaz konsantrasyonunu kullanın. DNA parçalarını PAGE ile ayırdıktan sonra, işaretleyici şeridin yanındaki jeli kesmek için steril bir neşter kullanın ve jelin sadece merdiveni içeren kısmını ultra hassas bir nükleik asit boyası içeren taze 1x TBE çalışma tamponu ile boyayın. DNA merdivenini görselleştirin ve yaklaşık 18 ila 30 baz çifti arasındaki boyut aralığında mikrokokal nükleaz sindirilmiş DNA parçalarını çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.

Jel dilimini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Jelin geri kalanını daha önce gösterildiği gibi nükleik asit boyası ile boyayın. Jeli UV ışığına maruz bırakın ve jel eksizyon adımının bir kaydı olarak bir görüntü elde edin.

Eksize edilen jel dilimini mikrosantrifüj tüpünün duvarına karşı ezmek için steril bir pipet ucu kullanarak bu işleme başlayın. İki jel hacimde PAGE çözündürme tamponu ekleyin ve dönen bir platformda 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi bir dakika boyunca maksimum hızda bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin.

Süpernatantları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve ezilmiş jel parçalarını aktarmamaya dikkat edin. Jel peletine 0.5 hacim PAGE çözündürme tamponu ekleyin, girdap yapın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanları birleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi standart bir fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanarak DNA parçalarını çıkarın.

DNA fragmanlarının izolasyonuna paralel olarak, standart PCR kullanarak kılavuz RNA ekspresyon vektöründen bağlayıcıları çoğaltın. Yönlü klonlamayı sağlamak için, bağlayıcılar daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilir. Bağlayıcıların kısıtlama enzimi sindirimini yüzde bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın.

Doğru bantları eksize edin ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak eksize edilen jel parçalarından DNA'yı saflaştırın. Son onarım reaksiyonu için bir DNA künteleme kiti kullanılır. Aşağıdakileri bir mikrofuj tüpüne ekleyin.

10 mikrolitre saflaştırılmış DNA, 1.5 mikrolitre 10x künkörleştirme tamponu, 1.5 mikrolitre bir milimolar dNTP karışımı, 1.4 mikrolitre su ve 0.6 mikrolitre künt enzim. 22 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve ardından 70 derecede 10 dakika inkübe ederek enzimi ısıtın ve aktive edin. 85 mikrolitre su ekleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi bir reaksiyon temizliği yapın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi eşit molar miktarlarda mikrokokal nükleaz, sindirilmiş ve onarılmış fragmanlar ve bağlayıcı dizileri kullanarak 14 mikrolitrelik bir ligasyon reaksiyonu ayarlayın. Nick çevirisini takiben, ligasyon ürünü PCR ile amplifiye edilir. Doğru şekilde bağlanmış beş asal ve üç asal bağlayıcı ile mikrokokal nükleaz fragmanlarını iki beş asal veya iki üç asal bağlayıcılı parçalardan ayırmak için, 15 döngü PCR reaksiyonunun tümünü birleştirin, DNA yükleme boyası ekleyin ve% 0.8'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın.

Belirgin bandı 869 baz çiftinde kesin olarak çıkarın ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın. Bir spektrofotometre kullanarak DNA miktarını ölçün. Daha sonra, PCR amplifiye edilmiş fragmanları, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Gibson derlemesi tarafından kılavuz RNA ekspresyon vektörüne klonlayın.

Bu prosedüre başlamak için, steril ve önceden soğutulmuş PCR tüplerine alikot saflaştırılmış vektör eki oluşturun ve buz üzerinde tutun. Bir milimetre boşluklu elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde soğutun. 25 mikrolitre taze hazırlanmış TG1 hücresini doğrudan bir DNA alikotuna ekleyin ve karışımı hemen bir elektroporasyon küvetine aktarın.

Hücrelerin ve DNA karışımının, sıkışmış hava veya kabarcıklar olmadan küvet odasının uzunluğu boyunca dağıtıldığından emin olmak için küvete hafifçe vurun veya hafifçe vurun. Küveti kaydırma haznesine yerleştirin ve uygun elektroporasyon programını başlatın. Küvete hemen 475 mikrolitre oda sıcaklığında 2TY ekleyin.

Elektroporasyonlu bakterileri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bireysel elektroporasyonları tekrarlayın, bir kütüphane ile dönüştürülen tüm hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve toplam hacmi belgeleyin. Tüm kütüphane için toplam koloni sayısını tahmin etmek için, uygun antibiyotik seçimi ile 10 santimetrelik bir agar plakası üzerine kütüphane ile transforme olmuş tanımlanmış küçük bir bakteri miktarını plakalayın.

Bakterilerin geri kalanının hacmini azaltmak için, 10 dakika boyunca veya görünür bir palet oluşana ve süpernatant berrak görünene kadar yaklaşık 4.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanın birkaç mililitresi hariç hepsini çıkarın ve hücreleri yeniden askıya alın. Bakterileri, uygun antibiyotik seçimini içeren 2TY agar kaplı biyotahlil kaplarına yerleştirin.

Uygun antibiyotik seçimi ile 10 santimetrelik ek bir agar kabına uygun bir hacimde pUC19 kontrol elektroporasyon reaksiyonu yayın. Agar plakalarını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bakteriler için DNA'nın mikrogramı başına koloni oluşturan birimi ve kütüphane karmaşıklığını tahmin etmek için kontrollü plakalardaki koloni sayısını sayın.

Son olarak, plazmit DNA ekstraksiyonu için bakterileri plakadan kazıyın. Jel saflaştırmasından sonra, saflaştırılmış mikrokokal nükleaz fragmanlarının 1 / 6'sı, başarılı boyut seçimini ve saflaştırmayı doğrulamak için% 20'lik bir PAGE jel üzerine yüklendi. Bağlayıcı amplikonlar, bağlayıcıların mikrokokal nükleaz sindirilmiş fragmanlara doğru yönde bağlanmasını sağlamak için kısıtlama enzimleri ile sindirildi.

Bu temsili jel görüntüsünün sol tarafı, sırasıyla HindIII ve SacII ile sindirimden önce ve sonra beş asal ve üç asal bağlayıcıyı gösterir, bu da bağlayıcıların öngörücü 637 baz çiftine ve 295 baz çiftine tam sindirimini gösterir. Jel görüntüsünün sağ tarafı, sindirilmiş bağlayıcı fragmanlarının eksizyonunu belgeler. Bağlayıcıların DNA fragmanlarına başarılı bir şekilde bağlanması, artan sayıda PCR döngüsü ile PCR kullanılarak analiz edildi.

Dahil edilen kontroller, girdi olarak önceki nick çeviri adımındaki şablon yok kontrolünü kullanan bir şablon yok kontrolü ve mikrokokal nükleaz parçası kontrolü yoktu. Sadece mikrokokal nükleaz fragmanlarının bağlayıcı DNA ile birleştirildiği numuneler, 869 baz çiftinin beklenen amplikonunu üretti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa beş gün içinde gerçekleştirilebilir.

Bu yordamı denerken, kitaplığın karmaşıklığını korumak ve diğer kontrol reaksiyonlarını gerçekleştirmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA'yı küçük parçalara ayırarak ve bunları kütüphane vektör omurgasına klonlayarak CRISPR tabanlı ekranlar için bir kılavuz RNA kütüphanesinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.