Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

Bu iletişim kuralı tarafından far-red floresan intra artiküler (IA) enjeksiyon yoluyla bir sıçan diz osteoartrit (KOA) modelinde etiketleme hücre sebat ve biodistribution insan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin (haMSCs) izlemek için etkili bir yöntem açıklanır.

Bu prosedürün genel amacı, in vivo floresan görüntüleme kullanarak bir sıçan diz osteartritinde veya bir KOA modelinde insan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin hücre kalıcılığının ve biyolojik dağılımının etkinliğini değerlendirmektir. İn vivo kök hücre izleme, rejeneratif matematik alanında, KOA hayvan modellerinde mezenkimal kök hücrelerde türetilen insan yağının tahrişi ve dağılımı hakkındaki temel soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. DiD kullanmanın ana avantajı, sıçan kaydırmalı emisyon spektrumunun, boya etiketli hücrelerde sitotik etki veya fonksiyonel hasar olmaksızın canlı hayvanlarda derin doku görüntülemeye izin vermesidir.

Anestezi uygulanmış 250 ila 300 gram, sekiz ila 12 haftalık bir erkek Sprague Dawley sıçanını ısıtılmış bir ped üzerine sol lateral pozisyonda yerleştirerek başlayın. Sağ dizinizi iyice tıraş etmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve cerrahi alanı %10 povidon iyot solüsyonu ve %70 etanol ile dezenfekte edin. Cerrahi olmayan bölgeyi cerrahi ped ile örtün.

Ve eklem kapsüllerini ortaya çıkarmak için patellar tendon boyunca yanal olarak iki santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Daha sonra, menisküsü uyluk kemiğine doğru yansıtan medial kollateral ligamenti kesmek için cerrahi bir neşter kullanın ve medial menisküsü forseps ile kavrayın. Menisküsü tibial bağlantıdan en dar noktasından kesmek için bir neşter kullanın.

Güvenilir ve uygulanabilir bir KOA başlangıcı elde etmek için, menisküsün uyluk kemiği tarafı her deney hayvanında tamamen kesilmelidir. Daha sonra, eklem kapsülünü dört-O gözlemlenebilir bir sütürle kapatın ve fareyi tamamen iyileşene kadar izleyin. Ameliyattan sekiz hafta sonra, insan yağ kaynaklı mezenkimal hücreleri, 37 santigrat derecede üç dakika boyunca iki mililitre tripsin artı EDTA ile% 80 birleşik bir kültürden ayırın.

Birkaç dakika sonra, tripsini dört mililitre tam kültür ortamı ile nötralize edin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Pelet, beş mililitre serumsuz kültür ortamında mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin. Ve hücreleri 37 santigrat derecede 50 dakika boyunca 50 mikrolitre DiD hücre etiketleme solüsyonu ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve yıkama başına beş mililitre PBS'de iki kez yıkayın. Son santrifüjlemeden sonra, hücreleri 100 mikrolitre PBS konsantrasyonu başına 2,5 kez 10 ila altıncı canlı hücreye seyreltin ve hücreleri 26 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. Daha sonra, eklem bölgesini açığa çıkarmak için ilk deney hayvanının artritik dizini yeniden tıraş edin ve maruz kalan cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin.

Etiketli hücreleri, patellar ligamanın medial tarafı, medial femoral kondil ve medial tibial kondil tarafından oluşturulan üçgenin merkezine enjekte edin ve görüntüleme yazılımını açın. İn vivo biyolüminesans görüntüleme sistemini başlatın ve hayvanları görüntüleme sisteminin merkezi aşaması içinde sırtüstü pozisyonda konumlandırın. Hazne kapısı kapalıyken floresan kutusunu kontrol edin ve uygun uyarma ve emisyon floresan filtre setlerini seçin.

Görüş alanını D'ye, piksel bükülmesini sekize, F Stop'u ikiye ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. Görüntüleri elde ettikten sonra, hayvanların tam iyileşmeye kadar izleme ile bir ısı yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin. Ardından, uygun görüntü analiz yazılımında, floresan ölçümü için radyant verimlilik birimlerini ve analiz için ilgilenilen bölgeleri seçin ve her görüntüden gelen floresan sinyallerini nicelleştirin.

Bu temsili deneyde, diz osteoartritinin neden olduğu bir sıçanın diz ekleminin seri kesitleri, ameliyattan sekiz hafta sonra H&E ve safranin O/Fast Green boyaması ile değerlendirildi. Eklem kıkırdağının kalınlığı, artritik dizlerde, H&E lekeli bölümlerde gözlendiği gibi, ameliyatsız kontralateral eklemlere göre daha incedir. Ayrıca, safranin O / Fast Green boyama ile görselleştirildiği gibi artrit ekleminde proteoglikan azalır ve fibrillenmiş kollajen artar, bu da ameliyatın neden olduğu dejeneratif diz osteoartriti fenotipinin ilerlemesini gösterir.

Boyamadan bir saat sonra, DiD etiketli insan adipoz türevli mezenkimal hücreler in vitro olarak yuvarlak bir şekil sergiler. 24 saat sonra, kültürlenmiş DiD etiketli mezenkimal hücreler, DiD'nin hücrelerin yapışma kabiliyetini değiştirmediğini doğrulayan uzun bir iğ şekli gösterir. Ameliyattan sekiz hafta sonra osteoartritik hayvanların dizlerinin görüntülenmesi, sıfırıncı günden enjeksiyondan sonraki 70. güne kadar DiD etiketli hücrelerin varlığını ortaya koymaktadır.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kök hücre tedavisi alanındaki araştırmacıların, hayvanlarda diz osteoartritinin tedavisi için mezenkimal kök hücrelerin güvenli ve uygulanabilir enjeksiyonu için en uygun rutini ve dozu belirlemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, cerrahi olarak indüklenen sıçan KOA modelinde enjeksiyon ve in vivo izleme için insan mezenkimal kök hücresini DiD ile nasıl etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.