Name: Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Öğrenin, pluripotent kök hücrelerden retinal pigment epitel hücreleri üretmek için büyüme faktörleri ve küçük moleküller kullanarak hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma yöntemini. Bu protokol 14 günde olgunlaşmamış ve üç ayda fonksiyonel RPE sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Garland Initiative tarafından desteklenmiştir görme, California Enstitüsü için rejeneratif tıp (CIRM; hibe DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 ve TG2-01151), Vermont Toplum Vakfı, Breaux Vakfı ve Körlük Wynn-Gund translasyonel araştırma hızlandırma programını mücadele Vakfı.

1. hazırlık reaktifler gün 0 gün 14 iletişim kuralı için <ol><li>Aşağıdaki orta bileşenleri hazırlamak: 100 x N2 ek, 2 mL 1 mL ekleyerek <ol><li>yapmak 100 mL retina farklılaşma orta (RDM) 50 x B27 ek ve 100 gerekli olmayan amino asit (NEAA) Dulbecco 96 mL x 1 mL &#39; s değişikliğin gerekli orta/besin karışımı F12 9 (DMEM/F12).</li>
		1 M Nikotinamid (NIC) NIC eriterek 1.221 g 8 ml steril su, vortexing ve 10 mL steril su ile ses getiren <li>olun 10 mL. Steril filtre çözümü.</li>
	</ol></li> <li>Aşağıdaki büyüme faktörleri ve küçük moleküller hazırlamak: <ol><li>rekombinant fare kafa sulandırmak, insan dickkopf WNT sinyal yolu inhibitörü 1 (DKK-1) ve IGF-1'e 100 µg/mL her %0.1 sığır serum albümin (BSA) fosfat tamponlu çözüm (PBS). Gerektiği gibi aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 3 ay için.</li>
		<li>Temel FGF-10 µg/mL ve rekombinant insan/mouse/fare aktivin A 100 µg/mL her PBS % 0,1 BSA için yeniden oluşturma. Gerektiği gibi aliquot ve-80 ° c ilâ 1 yıl için mağaza.</li>
		<li>Yeniden oluşturma SU 5402 (FGF reseptör özgü tirozin kinaz inhibitörü) ve CHIR99021 (glikojen sentaz kinaz 3, GSK-3β, engelleyici) 10 mm her Dimetil sülfoksit (DMSO). Aliquot ve mağaza-20 ° c ilâ 1 yıl ya da 6 ay için sırasıyla.</li>
	</ol></li> <li>Gün 0 ve/veya gün 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm (0.2 g EDTA PBS 1 litre başına), 1 X PBS- / - için aşağıdakileri elde olmadan kalsiyum veya magnezyum, pH 7,4 (PBS), 1 x tripsin benzeri ayrılma enzim (TDE), DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE destekleyen orta (RSM) ve Y-27632 dihydrochloride (kullanımı 10 µM).</li>
</ol> 2. Gün 0: Pluripotent kök hücre geçiş farklılaşma için günün <ol><li>Grow kök hücre kolonilerde Besleyici, serum boş koşulları için passaging önce yaklaşık % 80'i izdiham. 
	Not: Bu adım optimize üzerinde tartışma ayrıntılı bilgi için bkz:.</li>
	<li>12-şey plaka ekstraselüler matriks tabanlı hidrojel (ECMH) göre üretici önerileri ile kat. 1s için oda sıcaklığında veya gecede 4 ayarlamak için izin ver ° C.</li>
	<li>Aliquot RDM ve gün için gerekli büyüme faktörleri eklemeden önce 0 ve sıcak su banyosu 37 ° C için PBS- / - hacmi. EDTA oda sıcaklığına getirmek.</li>
	<li>10 mM NIC, 50 ng/mL kafa, 10 ng/mL DKK-1 ve 10 ng/mL IGF-1 ile ısıtılan RDM 0 gün için gerekli büyüme faktörleri ekleyin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri 100 µL NIC, kafa 5 µl, DKK-1'in 1 µL ve IGF-1'in 1 µL eklemek RDM için 10 mL.</li>
	Morfoloji farklılaşma için passaged kök hücreleri temel alan tüm farklı koloniler kaldırmak için <li>seçin. P10 damlalıklı ipucu farklılaşmış hücreler el ile kaldırmak için kullanın. 
	Not: Fibroblastic hücreler arasında kolonileri hem de opak hücrelerin kolonileri içinde kaldırılacak farklılaşmış hücreler gösterir. Farklılaşmış hücreler hakkında ayrıntılı bilgi için bkz.</li>
	<li>6-şey plaka tek iyi bir 12-şey plaka (1:4) 4 kuyu geçiş. 
	Not: Bu aşamada kök hücre passaging Ayrıntılar için tartışma bakın.
	<ol><li>Kök hücre kök hücre ortamından Aspire edin ve wells Önceden ısıtılmış PBS- / - 2 mL ile bir kez yıkayın.</li>
		<li>Aspire PBS- / - ve durulama her EDTA 1 mL 6-şey plaka kuyu başı ile de üç kez.</li>
		<li>Yavaşça plaka eğilme ve EDTA Aspire edin. Plaka zamanından önce hücreleri kaldırma önlemek için herhangi bir şekilde tahrik değil.</li>
		<li>Sonra üçüncü yıkama 1 mL EDTA ekleyin ve mahalle için 3-5 dk içinde oda sıcaklığında kuluçkaya. Plaka bu kuluçka sırasında rahatsız etmeyin.</li>
		<li>EDTA Aspire edin ve RDM 0.5 mL ilave orta ile 1 mL numaralı seribaşı şey başına ekleyin. Örneğin, 1 de 6-şey plaka ile RDM 4.5 mL 12-şey plaka 4 kuyu plaka için yıkayın.</li>
		<li>Hücre kazıyıcı yavaşça hücreleri ayırmak için kullanın. Konik tüp içinde tüm hücreleri toplamak ve RDM hücrelerde yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından triturate. Hücre büyük kümeleri ayırmak, ama tek hücre süspansiyon için triturate değil. Damlalıklı hücrelerde eşit olarak dağıtın. Hızlı bir şekilde yatıştırıldı plaka engellemek için bu adımı tamamlamak.</li>
		<li>Tohum hücreleri (hücre süspansiyon iyi başına 1 mL) ECM kaplı 12-şey plakaları.</li>
		<li>İleri geri hücreleri kuyuları boyunca eşit olarak dağıtmak için plaka eğ. Yavaşça bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO 2 orta değiştirmek kadar yerleştirin.</li>
		<li>Tam olarak ne zaman unutmayın. Her gün aynı anda değişiklik orta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Gün 1-14: büyüme faktörleri ek <ol><li>gün 1: Bütün wells (iyi başına 1 mL) medyada değiştirmek gün 0 (bkz. Adım 2.4) büyüme faktörü bileşimi ile RDM kullanarak.</li>
	<li>Gün 2: Orta RDM (iyi başına 1 mL) 10 mM NIC ile 5 ng/mL FGF-temel, 10 ng/mL kafa, 10 ng/mL DKK-1 ve 10 ng/mL IGF-1 kullanarak değiştirin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, NIC, FGF-Basic 5 µL, kafa 1 µL, DKK1 1 µL ve IGF1 1 µL 100 µL RDM için 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Gün 4: RDM (iyi başına 1 mL) kullanarak orta 100 ng/mL aktivin A, 10 ng/mL DKK-1 ve 10 ng/mL IGF-1 ile değiştirin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, aktivin A, DKK1 1 µL ve IGF-1'in 1 µL olan 10 µL RDM için 10 mL ekleyin. 
	Not: Bu aşamada hücreleri Konfluent gözlemlemek.</li>
	<li>Gün 6: 5402 RDM (iyi başına 1 mL) kullanarak orta 100 ng/mL aktivin A ve 10 µM SU ile değiştirin. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, aktivin a 10 µL ekleyip 10 µL SÜ RDM 5402-10 mL.</li>
	<li>Gün 8, 10 ve 12: RDM (iyi başına 1 mL) kullanarak orta 100 ng/mL aktivin A, 10 µM SU 5402 ve 3 µM ile değiştirin CHIR99021. 1.2. adımda anlatılan hisse senetleri, aktivin A, SU 5402 10 µL ve CHIR99021 3 µL olan 10 µL RDM için 10 mL ekleyin.</li>
</ol> 4. Gün zenginleştirme RPE 0 geçirilmesi için <ol><li>kat büyüme faktörü ile 6-şey plaka azaltılmış ECMH üretici öneriler göre. 1s için oda sıcaklığında veya gecede 4 ayarlamak için izin ver ° C.</li>
	<li>Aliquot gerekli DPBS hacmi ve RDM 1 mL zenginleştirme ve sıcak su banyosu 37 kuyu başına ° C. Bring TDE oda sıcaklığında ve sıcak gerekli hacmiyle RSM, antimikrobiyal reaktif ve Y-27632 37 ° c</li>
	<li>Ekle antimikrobiyal reaktif ve 0.5 x ve 10 µM besteleri sırasıyla için RSM alma Y-27632. Bu orta eki geliştirmek için ilk 4-7 gün boyunca kullanın.</li>
	<li>Tüm aspiratı harcanan orta Kuyu yapımı ve Önceden ısıtılmış RDM (hiçbir büyüme gerekli faktörleri) kuyu başına 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, el ile incelemek ve uzak bir P10 damlalıklı ucu kullanarak tüm RPE olmayan hücreleri kazımak. 
	Not: temsilcisi sonuçları örnekler için bkz:.</li>
	<li>Sonra diseksiyon, RDM Aspire edin ve tüm enkaz cep. Önceden ısıtılmış DPBS iyi başına 1 mL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>TDE 0.5 mL 12-şey plaka kuyu başına ekleyin ve 5 dk. yavaşça hücreleri plaka kaldırmak için hücre kazıyıcı kullanım için 37 ° C'de kuluçkaya. P1000 damlalıklı yavaşça aşağı yukarı 3 - 4 kez için pipetting tarafından hücre/TDE süspansiyon triturate kullanmak tek tip süspansiyon oluşturmak.</li>
	<li>Hücre/TDE süspansiyon 1:10 ' Y-27632 olmadan Önceden ısıtılmış RSM oranında seyreltin. Santrifüj kapasitesi 173 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücre süspansiyon.</li>
	<li>Hücre Pelet ortamından Aspire edin ve RSM hücrelerde 10 µM ile resuspend Y-27632 (başına 1 mL zenginleştirilmiş iyi).</li>
	<li>Bir naylon mesh hücre süzgeç ile 40 µm gözenekleri kullanarak hücreleri süzün. Bir hemasitometre kullanarak belirtilen birim hücreleri saymak ve gergin çözüm hücrelerde konsantrasyonu hesaplayın.</li>
	<li>Tohum hücre büyüme faktörü üzerinde azaltılmış ECM / galvanizleme levhalar 1 x 10 5 hücreleri/cm 2 ' RSM 4 mL 10 µM ile de Y-27632.</li>
	<li>Yerine RSM ile 10 µM Y-27632 hücre tohum sonra 48 h ve medya yerine 3-4 günde (örneğin Pazartesi ve Perşembe günleri) devam ediyor. 10 µM yerine yapmak 4-7 gün sonra Y-27632.</li>
	<li>28-35 gün 37 ° C ve % 5 CO 2 olgun hücrelere izin. RSM yerine 3-4 günde (örneğin Pazartesi ve Perşembe günleri) devam.</li>
</ol> 5. Olgunlaşma: Geçiş 1 ve 2 RPE / Not: parantez içinde gösterilir gibi birimler için de, bir 6-şey tabak ya da bir T75 şişesi 1 belirtilen.
<ol><li>Arasındaki gün 28-35 geçit 0, bir 6-şey plaka (T75 şişesi) ECMH ile üretici öneriler göre kat.</li>
	<li>Aliquot hacmi DPBS ve RSM gerekli ve sıcak su banyosu 37 ° C. getirmek TDE oda sıcaklığına.</li>
	<li>Aspiratı harcanan orta kuyulardan ve yıkama de iki kez 2 mL (10 mL) Önceden ısıtılmış DPBS. 
	Not: 10 µM kullanmayın Y-27632.</li>
	<li>Aspire DPBS ve 1 mL (5 mL) TDE ekleyin. 5 min için 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçka yerleştirin. Kuluçka sonra hücreleri onaylamak için ters bir mikroskop görünüm hücrelerdeyse müteahhitlik ve ayırma.</li>
	<li>Bir uygun boyutlu hücre kazıyıcı kullanarak yavaşça çıkarın hücreleri iyi veya cep şişesi derinliklerinden.</li>
	<li>P1000 ipucu (10 mL serolojik damlalıklı) hafifçe hücre/TDE süspansiyon yukarı ve aşağı için 3 - 4 kez triturate için kullanın bir tek tip süspansiyon oluşturmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 1:10 RSM sulandırmak. RSM iyi/şişeye durulayın ve seyreltilmiş hücre süspansiyon eklemek için 2 mL (5 mL) rezerv. 
	Not: enzim çekim hızı 25 dk. aşmasına izin vermez</li>
	<li>Hücre süspansiyon 173 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre Pelet ortamından Aspire edin ve 1 mL (5 mL) RSM hücrelerde resuspend</li>
	<li>Bir naylon mesh hücre süzgeç ile 40 µm gözenekleri kullanarak hücreleri süzün. Bir hemasitometre kullanarak belirtilen birim hücreleri saymak ve gergin çözüm hücrelerde konsantrasyonu hesaplayın.</li>
	<li>Tohum hücreleri 1 x 10 5 hücreleri/cm 2 4 mL (15 mL) RSM'de ECMH kaplı Tabaklarda.</li>
	<li>30 gün boyunca olgun hücrelere izin. Her 3-4 gün RSM değiştirmeye devam.</li>
	<li>Geçiş 1-2 hücreleri geçiş ile 30 gün (Adım 5.2-5.11) Yukarıdaki yordamı yineleyin.</li>
</ol> 6. Bir ara hücre Bankası oluşturma: dondurma, geçiş 2 gün 3-5 RPE Not: onlar (~ %50) subconfluent ve pigment kavuştular değil iken hücreleri Cryopreserve.
<ol><li>Hücre sayısına göre 3 x 10 6 hücre/mL bir konsantrasyon hücreleri resuspend için gerekli %10 DMSO ile dondurma orta hacmi hesaplamak.</li>
	<li>5.2-5,8 adımları izlemeniz. 3 x 10 6 hücre/ml % 10 DMSO ile dondurma ortamda hücre Pelet resuspend ve hücre süspansiyon 1 mL 1.2 mL kriyojenik şişeleri için transfer.</li>
	<li>Kriyojenik şişeleri-1 ° C/dak serin ve-80 ° C'de gecede yerleştirmek için tasarlanmış bir dondurucu kapsayıcısına getirin. Uzun süreli depolama için sıvı azot transfer. 
	Not: Bu hücreler çözdürme üzerine geçiş 3 olacaktır. 30 gün önce karakterizasyonu için hücreleri kültür. Tohum geçiş 3 RPE 1.5 x 10 cm 2 çözme üzerine 5. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Making+Stem+Cells+Retinal%3A+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4020-8502-4_1">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li>
<li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical%2F%CE%B2-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel%2C+synthetic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%3A+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li>
<li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li>
<li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li>
</ol>

Dr. Clegg rejeneratif yama Technologies LLC ortak kurucusudur.

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücrelerinden pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem her iki insan embriyonik ve İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden bir besleyici, serum boş kültür yöntemi kullanarak optimize edildi. İnsan embriyonik kök hücreleri 1998 yılında ilk yalıtım ve İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) türetme 2007 yılından bu yana çok sayıda kök hücre kültür yöntemleri olmuştur14,15,16geliştirilen, 17. Bu yöntemler bu farklılaşma duyarlı kök hücre kolonileri üretmek için yeterli olmalıdır. Düzgün türetilmiş ve bakımlı pluripotent kök hücreler için bu yöntemin uygulanabilirliği için bilinen hiçbir sınırlamalar vardır.
Gün 0 farklılaşma (Adım 2.5) kök hücrelere ve işleminin (Adım 4.5) el ile diseksiyon gün 14, potansiyel ihtiyacını passaging en önemli adımlardır. Farklılaştırılmış hücrelerin kök hücre kolonileri kaldırmak için seçilmesinde Kent18Albümdeki bakın. Belirtildiği gibi bu iletişim kuralı18başlamadan önce kaldırılması gerekir farklılaşmış hücreler fibroblastic hücreler arasında kolonileri ve opak hücrelerin kolonileri içinde gösterir. Sadece farklılaşmamış, sıkıca paketlenmiş kolonileri tanımlı kenarları ile farklılaşma için passaged.
Kök hücreleri iyi (Adım 2.6.7) tohumlari kök hücreleri tek hücre süspansiyon üzerine geçiş içine triturated değil ve doğru bir hemasitometre kullanarak sayılır olamaz karmaşıklaşır. Yaklaşık % 80'i Konfluent kök hücrelerin passaging 1 de 6-şey plaka için 12-şey plaka 4 kuyu belirtilir. Büyüme hızı gibi kök hücre hatları arasındaki farklar ne kadar hızlı olgunlaşmamış RPE ulaşmak izdiham gün 0 ile 4 arasında etkileyebilir. Kök hücre RPE ne olursa olsun kesin izdiham üretecek, ama bu aşamada hücreleri çok seyrek olan hücre verim olumsuz etkilenecektir. Olgunlaşmamış RPE hücrelerinin yaklaşık % 40-50 birleşmesi gün 4 gün 1 ve neredeyse % 100 birleşmesi olmalıdır. Hücreleri Konfluent monolayer gün 4 veya 6 üreten değil, protokol daha yüksek bir tohumlama yoğunluğu gün 0 saat yinelenmelidir. Örneğin, 1 de 6-şey plaka / 12-şey plaka 4 kuyu için gün 0 pasajlı ve olgunlaşmamış RPE % 100 birleşmesi gün 4 değilseniz, bir 1:3 veya 1:2 geçit gün 0 tohum azaltmak veya kök hücreler daha Konfluent olmak izin passaging önce. Ne zaman birden fazla hücre satır karşılaştırma tutarlı bir tohumlama yoğunluğu kurmak için önemlidir.
Gün 14 Manuel diseksiyon adımda yalnızca sigara RPE hücrelerinin kültürü (şekil 2C) mevcut olduğunda gereklidir. İletişim kuralına CHIR99021 ek beri birçok pluripotent kök hücre hatları küçük hiçbir manuel diseksiyon gerektirir. Bazı hazırlıklar sinirsel yamalar daha yüksek insidansı olması ve bu hücreleri kaldırmak için önemlidir. RPE passage 3 0 geçitle, uygun değilseniz, tüm sigara RPE hücrelerinin kaldırmak için yeterli zaman ayırdığınız farklılaşma Protokolü tekrar mümkündür. Bu kez olmaz, ama burada gün 14 diseksiyon basamakta gerektiğinde iyileştirilebilecek Not belirtilir.
Farklı maliyet yanı sıra kültür yöntemleri, verimliliği, miktar RPE farklılaşma protokolleri çeşitli ve işlevsel değerlendirme, ikincisi olan oldu iyice2gözden. Biz burada onun etkinlik, adaptasyon ve hücre hatları4,7,8geniş bir yelpazesi için Uygulanabilirlik nedeniyle detaylı 14 günlük yöntemi tercih ederler. Bu iletişim kuralı dondurma adımda da çok çok değişkenlik deneylerde kaçınarak ileride kullanmak üzere bir ara cep banka oluşturmanın önemli bir avantaj sağlar. 12-şey plaka sadece 4 wells ile başlayarak, geçit 0, 6-şey plakaları ve geçiş 1 ve 2, T75 şişe içine genişletmek mümkündür. Hücreler hala subconfluent ve pigment, kavuştular değil zaman geçit 2 gün 3-5, onlarca milyon hücre cryopreserve ve geçiş belirlenen 3 günü 30 olgun RPE çözülme, RNA ifade, protein ifade, büyüme faktörü kontrol etmek mümkündür salgılanması, fagositoz, vb. Biz de protokolleri RPE en fazla 13 pasajlar 19için genişletmek için kurduk.
Dört gözle, bu yöntem IPSC oküler hastalik modelleme ve RPE nesil hücresel tedavi için faydalı olacaktır. IPSC hastalığı modelleme açısından bu iletişim kuralı şu anda laboratuarda aynı hastanın sigara düzeltilmiş denetimleriyle CRISPR düzeltilmiş satırlarından RPE üretmek için kullanılıyor. Ayrıca, bu iletişim kuralını sentetik yüzeylerde ve bir hücresel tedavi için gerekli en iyi üretim uygulamaları yapıştırma için yararlı xeno-Alerjik koşulları için uyarlanabilir.

Retina pigment epiteli photoreceptors için çok önemli destek sağlayan bir monolayer Pigmentli hücreleri olduğunu. Retina pigment epitel hücreleri (RPE)-si olmak çok sayıda görev ışık emilimi, besin ve iyon taşıma, Bisiklete binme, retinoid dahil vizyon, photoreceptor dış segment fagositoz ve büyüme faktörü salgı1. RPE ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve retinitis pigmentosa gibi görme, bir kaybı sonucu işlevi etkiler retina dystrophies çeşitli vardır. RPE nesil pluripotent kök hücrelerden bu göz hastalıkları anlamak için araştırma kolaylaştırabilir ve RPE sınırsız bir kaynağı hücre terapileri2için sağlar. Aslında, birden fazla klinik çalışmalar devam pluripotent kök hücreler3den türetilmiş RPE kullanıyorsunuz.
Bu farklılaşma protokolü ilk Buchholz4 tarafından tanımlanmıştır ve Clegg5önceden yayınlanmış yöntemine dayalı. Yordamı farklılaşmamış pluripotent kök hücreler RPE kader manipülasyon insülin büyüme faktörleri (IGF), temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-2 puanı ile doğru yönlendirmek için normal vivo içinde gelişim sürecinin taklit eder. FGF-basic), dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β) ve WNT yolları4,5. Protokol önemli ölçüde geç %97.77 ± %0,1 pre-melanosome protein (PMEL) pozitif hücrelerinin vermiştir ve koşullar xeno-Alerjik6,7' ye adapte protokolünde, WNT yolu agonist eklenmesi tarafından geliştirildi. Elde edilen RPE gösterilmiştir RPE işaretleri bilinen RPE büyüme faktörleri ile uygun polarite salgılar ve photoreceptor dış segmentleri8fagositoz taşımak için transkript ve protein düzeyleri, ifade etmek için. Bu, daha hızlı ve güvenilir--dan temel fibroblast büyüme faktörü8basit kaldırma dahil "kendiliğinden" iletişim kuralları farklılaşma protokolüdür. Ayrıca, RNA sıralama RPE bu iletişim kuralını kullanan elde edilen verileri göstermek için elde edilen daha yaygın spontan yaklaşım8kullanarak çok benzer. 14 günlük yöntem Mazzoni9 (Pigmentli, polarize, fagositik, sonrası Mitotik, çokgen)9tarafından bahsedilen "5 P'ın" uygun RPE oluşturur. Bu yordam birden çok Labs'de tekrarlanabilir kanıtlanmıştır iken, son yıllarda10,11,12 ' yayınlanmış birkaç ek yönlendirilmiş farklılaşma yöntem kabul etmek istiyorum , 13.

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III laminer akışlı biyogüvenlik kabini</td><td>Baker</td><td>modeli: SG603A-HE, tip: A2, sınıf: 2</td><td>6' Baker laminer akışlı biyogüvenlik kabini</td></tr><tr><td>Diseksiyon Başlığı</td><td>Labconco</td><td>Model 3970405</td><td>laminer akışlı tezgah üstü</td></tr><tr><td>diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td>ısıtmalı sahne</td></tr><tr><td>hava ceketli CO2 inkübatörü</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC ve %5 CO2</td></tr><tr><td>ters faz kontrast mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ek</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Büyüme Faktörleri ve Reaktifleri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant fare noggin</td><td>R& D sistemleri</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan DKK-1</td><td>R& D sistemleri</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant IGF-1</td><td>R& D sistemleri</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan/fare/sıçan Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF inhibitörü</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td><güçlü>Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td><güçlü>Yüzeyler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Temel Membran Matrisi, Fenol Kırmızısı İçermeyen, LDEV-İçermeyen</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>hücre dışı matris bazlı hidrojel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC Nitelikli Matris, LDEV-İçermeyen</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>büyüme faktörü azaltılmış ECMH</td></tr><tr><td><güçlü>Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Diğer reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td> DPBS Gibco 14190250 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (kalsiyum yok, magnezyum yok)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (tripsin benzeri ayrışma enzim, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE destekleyici ortam)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>kriyoprezervasyon ortamı</td></tr><tr><td>1.2 mL Kriyojenik Flakon</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (dondurma kabı)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>dondurma kabı</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>antimikrobiyal reaktif</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Diğer Ekipmanlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet yardımı</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu kültür plakası</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>Farklılaşma sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>T75 şişesi</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>RPE olgunlaşması sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakası</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>RPE olgunlaşması sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>hücre sıyırıcı</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Geçişler sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Hücre sayımından önceki geçişler sırasında kullanılır.</td></tr></tbody></table>

hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden retina pigment epitel hücrelerinin

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent kök hücre farklılaşma içine retina pigment epitel hücreleri (RPE) yönlendirmek için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır. Bir detaylı ve kapsamlı protokol sağlama amaçlı açıkça her adım göstermek için ve bu alanındaki araştırmacılar için hazır olmak için var. Bu iletişim kuralı RPE homojen bir katmanda gerekli en küçük veya Hayır manuel diseksiyon ile sonuçlanır. Burada sunulan yöntem için etkili olduğu gösterilmiştir indüklenen pluripotent kök hücreler (IPSC) ve insan embriyonik kök hücreleri. Ayrıca, uzun süreli depolama izin ara cep bankaların dondurma için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan RPE IPSC çanak içinde hastalık modelleme veya klinik uygulama için yararlı olabilir.

Bu yöntem bir homojen, Pigmente ve tetrahedron monolayer RPE, üretimde sonuçlanır. Zaman Çizelgesi'Resim 1 Resim 2' tasvir görüntüleri karşılık gelir. Şekil 2Agösterildiği gibi kök hücre kolonileri sıkı bir şekilde tanımlanmış kenarlar ve hiçbir fibroblastic hücreler arasında kolonileri ya da opak hücrelerin kolonileri içinde paketlenmiştir. Şekil 2B subconfluent olgunlaşmamış RPE bir gösterimini sağlar. Hücreleri zaten bu aşamada Konfluent ise, farklılaşma süreci için kritik olan projeksiyonlar genişletemezsiniz. Ağır subconfluent olan hücrelere bir monolayer kurmak ve sıkı kavşaklar, epitel ile karakteristik oluşturmak mümkün olmayacaktır. Bu izdiham en iyi duruma getirmek hakkında ayrıntılı bilgi tartışma bölümünde özetlenen. Şekil 2C gösterir Sigara-Bu farklılaşma işlem sırasında ortaya çıkabilecek RPE en yaygın iki tür morfolojisi: sinirsel ya da fibroblastic yamalar. Tanımlanan, fibroblastic benzeri yamalar üzerinde diseksiyon mikroskop neredeyse yarı saydam ise sinir bu yamaları diseksiyon mikroskop üzerinde özellikle opak görünür unutmamak gerekir. Bu alanlarda bir doku kültürü plaka üzerinde bir bileşik ışık mikroskobu ve diseksiyon mikroskop üzerinde daha kolay tanımak için bir etanol geçirmez laboratuvar kalemle işaretlemek yararlı olabilir. Rakamlar 2D-F karakteristik parlak sınırları, Arnavut kaldırımı morfoloji ve RPE sağlıklı, olgunlaşan kültürünün belirtmek pigmentasyon gösterir. Şekil 3 tam olgun RPE faz kontrast ve aydınlık alan mikroskobu tarafından tasvir farklı görünümünü göstermek için daha yüksek bir büyütme görüntüdür. Geçit 3 gün 30, hücrelerin RNA ifade, protein ifade, büyüme faktörü salgı ve fagositoz2,4,6 dahil olmak üzere önceki yayınlarda açıklanan karakterizasyonu için hazır ,7. Bu karakterizasyonu bu Albümdeki temsil hücreleri sadece Pigmente ve tetrahedron, ama aynı zamanda fagositik, sonrası Mitotik ve polarize olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
Şekil 1:. Zaman çizelgesi büyüme faktörleri eklenmesi ve RPE olgunlaşma için. Büyüme faktörleri 12-şey plakaları için 0-14 günden eklenir. RPE olgunlaşması kültürlü 6-şey plakaları veya zenginleştirme günden itibaren T75 Şişeler için 30 gün sonrası tezcan (passage 3 gün 30). Oklar, enzimatik hücre passaging gösterir. (A-E) aşağıda Şekil 2Albümdeki zaman çizelgeleri karşılık gelir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
Şekil 2: temsilcisi morfoloji ve RPE olgunlaşması izdiham. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler hemen önce farklılaşma(a)passaging. Olgunlaşmamış RPE hücrelerinin subconfluent günde 2 (B) ve çekme Kaldır zenginleştirme 14 gün önce; RPE yamalar (beyaz oklarla gösterilen) yamalar veya opak "kurdele" (C) olarak görünür. Geçit 0, 1 ve 3 gün 30, RPE (D, E ve F). Ölçek çubuğu 200 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
Şekil 3: olgun RPE passage 3: gün 30 Faz kontrast(a)tasvir tetrahedron morfoloji ve pigmentasyon parlak-alanında (B) tasvir. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Bu yöntemin genel amacı, pluripotent kök hücrelerin retinal pigment epitel hücrelerine farklılaşmasını homojen bir tabaka halinde etkili bir şekilde yönlendirmektir. Bu yöntem; retinanın nasıl geliştiği ve bir kök hücre hastalık modelinin nasıl kurulacağı gibi retina ve göz araştırmaları alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, spontan yöntemlerden daha hızlı ve daha verimli olmasıdır.Bu yöntem, kök hücrelerin 14 gün içinde immatür RPE'ye ve üç ay sonra olgun fonksiyonel RPE'ye farklılaşmasını yönlendirmek için büyüme faktörleri ve küçük moleküllerin bir kombinasyonunu kullanır. Prosedürün bölümlerini, UC Santa Barbara'daki kök hücre biyolojisi ve mühendisliği laboratuvarınınlele direktörü Cassidy Arnold uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, pasajlama öncesinde kök hücre kolonilerini besleyici hücre içermeyen, serumsuz koşullarda yaklaşık %80 konfluense kadar büyütün.Ardından, 12 kuyucuklu bir plakayı üretici önerilerine uygun olarak hücre dışı matris tabanlı hidrojel ile kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat veya 4 °C'de gece boyunca setleşmeye bırakın. Bundan sonra, sıfırıncı gün için gerekli olan retinal diferansiyasyon medyumu ve kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS hacimlerini alikotlayın ve bunları bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Daha sonra, ısıtılmış RDM'ye büyüme faktörlerini ekleyin ve EDTA'yı oda sıcaklığına getirin.Gerekirse, farklılaşma için pasajlanacak kök hücrelerden, morfolojiye dayanarak farklılaşmış tüm kolonileri P10 pipet ucuyla temizleyin. Koloniler arasındaki fibroblastik hücrelerin yanı sıra koloniler içindeki opak hücreler, temizlenmesi gereken farklılaşmış hücreleri gösterir. Hücrelerin manuel olarak temizlenmesi, protokolün en kritik adımlarından biridir; çünkü tamamen farklılaşmamış bir kök hücre popülasyonu ile başlamak, daha etkili bir zenginleştirme sağlar.Kök hücrelerdeki medyumu aspire ederek ve kuyucukları bir kez 2 mL önceden ısıtılmış PBS ile yıkayarak, altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğunu 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğuna aktarın. Ardından PBS'yi aspire edin ve her bir kuyucuğu kuyucuk başına 1 mL EDTA ile üç kez durulayın. Daha sonra plakayı nazikçe eğerek EDTA'yı aspire edin.Hücrelerin vaktinden önce kalkmasını önlemek için plakayı hiçbir şekilde sarsmayın. Üçüncü yıkamadan sonra, tekrar bir mililitre EDTA ekleyin ve plakayı çeker ocak içerisinde oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında plakayı rahatsız etmeyin.Ardından, EDTA'yı aspire edin ve yerleştirilecek her kuyucuk için bir mililitre RDM artı 0,5 mililitre ekstra besiyeri ekleyin. Örneğin, 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğuna ekim yapmak için altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunu 4,5 mililitre RDM ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.Hücreleri, kuyucuk içinde beş kez pipetle yukarı ve aşağı çekerek RDM içerisinde triture edin ve plakaya yeniden yapışmalarını önlemek için bu adımı hızlıca tamamlayın. Konik bir tüpe aktarın. Büyük hücre kümelerini ayırın ancak tek hücre süspansiyonu elde etmek için triture etmeyin.Hücrelerin plakaya yeniden yapışmasını önlemek için hücreleri pipet içinde eşit olarak dağıtın ve bu adımı hızlıca tamamlayın. İstenirse, hücre kümelerinin boyutunu gözlemlemek için bir ışık mikroskobu kullanın. Ardından, hücreleri ECM kaplı, 12 kuyucuklu plakalara ekimleyin.Hücrelerin kuyucuklara eşit şekilde dağılması için plakayı ileri geri eğleyin ve bir sonraki besiyeri değişimine kadar 37 °C ve %5 CO2 sıcaklığındaki bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bu prosedürde, altı kuyucuklu bir plakayı üretici tavsiyelerine uygun olarak büyüme faktörü azaltılmış ECM ile kaplayın. Oda sıcaklığında bir saat veya dört °C'de gece boyunca sabitlenmesini bekleyin.Ardından, her bir zenginleştirme kuyucuğu için gerekli miktarda DPBS ve bir mililitre RDM'yi alikotlayın ve bunları bir benmari içinde 37 °C'ye ısıtın. Trypsin benzeri enzimi oda sıcaklığına getirin ve gerekli miktardaki RPE destekleyici medyumu 37 °C'ye ısıtın. Bundan sonra, final konsantrasyonu 0.5x antimikrobiyal ve 10 µM ROCK inhibitörü olacak şekilde RSM'ye bir antimikrobiyal reaktif ve ROCK inhibitörü ekleyin.Yapışmayı artırmak için ilk dört ila yedi gün boyunca bu ortamı kullanın. Ardından, tüm kuyucuklardaki kullanılmış ortamı aspire edin ve her kuyucuğa bir mililitre önceden ısıtılmış, büyüme faktörü içermeyen RDM ekleyin. Gerekirse, bir diseksiyon mikroskobu altında P10 pipet ucu kullanarak tüm non-RPE hücrelerini diseke edin ve kazıyarak temizleyin.Diseksiyondan sonra, RDM'yi ve tüm hücre kalıntılarını aspire edin ve her kuyucuk için bir mililitre önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez yıkayın. Ardından, 12 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 0,5 mililitre TDE ekleyin ve 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, hücreleri plakadan nazikçe uzaklaştırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.Homojen bir süspansiyon oluşturmak için hücre enzim süspansiyonunu pipetle üç ila dört kez yukarı aşağı çekerek nazikçe tritüre edin. Ardından, hücre enzim süspansiyonunu ROCK inhibitörü içermeyen önceden ısıtılmış RSM içinde 1'e 10 oranında seyreltin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 173g hızında santrifüjleyin.Beş dakika sonra, hücre peletinden medyumu aspire edin ve hücreleri 10 micromolar ROCK inhibitörü içeren RSM içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri 40 micrometer gözenekli bir naylon ağ hücre süzgeci kullanarak süzün. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve süzülmüş çözeltideki hücre konsantrasyonunu hesaplayın.Ardından, hücreleri büyüme faktörü azaltılmış, ECM kaplı plaklara, 10 µM ROCK inhibitörü içeren 4 mL RSM içerisinde, santimetrekare başına 1x10⁵ hücre olacak şekilde ekleyin. Hücre ekiminden 48 saat sonra RSM'yi 10 µM ROCK inhibitörlü olanla değiştirin ve medyayı her üç ila dört günde bir yenilemeye devam edin. Dört ila yedi gün sonra RSM'ye ROCK inhibitörü eklemeyi bırakın.Hücrelerin 37 °C ve %5 CO2 ortamında 28 ila 35 gün boyunca olgunlaşmasını bekleyin ve RSM'yi her üç ila dört günde bir değiştirmeye devam edin. Burada, farklılaşma için pasajlanmadan hemen önceki indüklenmiş pluripotent kök hücreler gösterilmiştir. Kök hücreler küçüktür ve koloniler içinde yoğun bir şekilde paketlenmiştir; kolonilerin arasında fibroblastlar gibi farklılaşmış hücreler veya koloniler içinde opak geçişler görülmemektedir.İkinci gündeki olgunlaşmamış RPE hücreleri burada görülmektedir. Bu aşamadaki hücreler hala subkonfluent olmalı ve hücreler arasındaki boşluklara doğru uzantılar çıkarmalıdır. Bu hücreler, 14. günde zenginleştirmeyi kaldırmak için yapılacak seçimden önceki aşamadadır.RPE dışı hücreler yamalar veya opak şeritler şeklinde görünür. Yuvarlak yama fibroblastik morfolojiye sahip hücreler içerirken, opak yamaların nöral retina olduğu düşünülmektedir. Bu görüntüler, 30. gündeki pasaj sıfır, bir ve üç aşamalarındaki RPE'yi göstermektedir.Her pasajda hücreler konfluent olmalı ve faz-parlak sınırları ile poligonal şekil dahil olmak üzere retinal pigment epitelyum morfolojisinin temel özelliklerini göstermelidir. Uzmanlaşıldığında, pasajlama ve zenginleştirme teknikleri, hücre kültürünün ölçeğine bağlı olarak bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, RPE'nin büyüme faktörlerini salgılama veya dış segmentleri fagosite etme yeteneği hakkındaki soruları yanıtlamak için gen veya protein kantifikasyonu ve fonksiyonel analizler gibi teknikler kullanılabilir.Dave Buchholz tarafından 2013'te ve Lindsay Leach tarafından 2015'te yayınlanan makaleler, bu yöntemin geliştirilmesini ve optimize edilmesini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Alanındaki araştırmacıların kolayca erişebilmesi için prosedürdeki her bir adımın ayrıntılı ve kapsamlı bir gösterimini sunduk. Deneylerinizde başarılar dileriz.

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

MıkroRNA (miRNA) insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri (iPS-RPE), ve fetal RPA'nin türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök profilleri (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), karşılaştırıldı.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Burada retina pigment epiteli (RPE) hücreleri insan pluripotent kök hücre hasta kaynaklı mutasyonlar taşıyan ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Mutant hücre hatları immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe gibi fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu hastalık içinde yemek yaklaşım yerel insan RPE hücrelerinin alma zorluğu kaçınmanızı sağlar.

Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Öğrenin, pluripotent kök hücrelerden retinal pigment epitel hücreleri üretmek için büyüme faktörleri ve küçük moleküller kullanarak hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma yöntemini. Bu protokol 14 günde olgunlaşmamış ve üç ayda fonksiyonel RPE sağlar.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin (Video) | JoVE Journal

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Daha fazla video keşfet