Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Bu yöntemin genel amacı, pluripotent kök hücrelerin farklılaşmasını homojen bir tabakada retina pigment epitel hücrelerine etkili bir şekilde yönlendirmektir. Bu yöntem, retinanın nasıl geliştiği ve bir kök hücre hastalığı modelinin nasıl oluşturulacağı gibi retina ve göz araştırmaları alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, spontan yöntemlerden daha hızlı ve daha verimli olmasıdır.

Bu yöntem, kök hücrelerin farklılaşmasını 14 gün içinde olgunlaşmamış RPE ve üç ay sonra olgun fonksiyonel RPE haline getirmek için büyüme faktörleri ve küçük moleküllerin bir kombinasyonunu kullanır. Prosedürün bölümlerini gösteren, UC Santa Barbara'daki kök hücre biyolojisi ve mühendisliği laboratuvarının yardımcı direktörü Cassidy Arnold olacak. Bu prosedüre başlamak için, kök hücre kolonilerini besleyicisiz, serumsuz koşullarda, geçmeden önce yaklaşık% 80 oranında büyütün.

Ardından, üreticinin tavsiyelerine göre hücre dışı matris bazlı hidrojel ile 12 oyuklu bir plakayı kaplayın ve oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede sertleşmesine izin verin. Bundan sonra, sıfırıncı gün için gerekli olan kalsiyum veya magnezyum içermeyen retinal farklılaşma ortamının ve PBS'nin hacmini ayırın ve bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Daha sonra büyüme faktörlerini ısıtılmış RDM'ye ekleyin ve EDTA'yı oda sıcaklığına getirin.

Gerekirse, farklılaşma için geçilecek kök hücrelerden morfolojiye dayalı bir P10 pipet ucu kullanarak tüm farklılaşmış kolonileri çıkarın. Koloniler arasındaki fibroblastik hücreler ve koloniler içindeki opak hücreler, çıkarılacak farklılaşmış hücreleri gösterir. Hücrelerin manuel olarak çıkarılması, protokolün en kritik adımlarından biridir, çünkü tamamen farklılaşmamış bir kök hücre popülasyonu ile başlamak daha verimli bir zenginleştirmeye izin verecektir.

Daha sonra, altı oyuklu bir plakanın tek bir kuyusunu, ortamı kök hücrelerden aspire ederek ve kuyuları iki mililitre önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayarak 12 oyuklu bir plakanın dört kuyusuna geçirin. Daha sonra, PBS'yi aspire edin ve her bir kuyucuğu oyuk başına bir mililitre EDTA ile üç kez durulayın. Ardından plakayı yavaşça eğin ve EDTA'yı aspire edin.

Hücrelerin zamanından önce kaldırılmasını önlemek için plakayı hiçbir şekilde çalkalamayın. Üçüncü yıkamadan sonra, tekrar bir mililitre EDTA ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında davlumbazda üç ila beş dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında plakayı rahatsız etmeyin.

Bunu takiben, EDTA'yı aspire edin ve oturacak oyuk başına bir mililitre RDM artı 0,5 mililitre ekstra ortam ekleyin. Örneğin, altı oyuklu bir plakanın bir kuyusunu 4,5 mililitre RDM ile 12 oyuklu bir plakanın dört oyuğuna plakalamak için yıkayın. Ardından, hücreleri nazikçe ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Kuyucukta beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri RDM'de ezin ve plakaya yeniden yapışmayı önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde tamamlayın. Konik bir tüpe yerleştirin. Büyük hücre kümelerini ayırın, ancak tek hücreli süspansiyona tritüre etmeyin.

Hücreleri pipete eşit olarak dağıtın ve plakaya yeniden yapışmasını önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde tamamlayın. İstenirse, hücre kümelerinin boyutunu gözlemlemek için bir ışık mikroskobu kullanın. Daha sonra, hücreleri ECM kaplı, 12 oyuklu plakalar üzerine tohumlayın.

Hücreleri kuyucuklar boyunca eşit olarak dağıtmak için plakayı ileri geri eğin ve bir sonraki ortam değişene kadar 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bu prosedürde, üretici tavsiyelerine göre büyüme faktörü azaltılmış ECM ile altı oyuklu bir plaka kaplayın. Gece boyunca oda sıcaklığında dört santigrat derecede bir saat sertleşmesine izin verin.

Daha sonra gereken DPBS miktarını ve zenginleştirme kuyusu başına bir mililitre RDM'yi ayırın ve bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Tripsin benzeri enzimi oda sıcaklığına getirin ve gerekli miktarda RPE destek ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Bundan sonra, 0.5x antimikrobiyal ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü nihai konsantrasyonunu elde etmek için RSM'ye bir antimikrobiyal reaktif ve ROCK inhibitörü ekleyin.

Bağlanmayı geliştirmek için bu ortamı ilk dört ila yedi gün boyunca kullanın. Daha sonra, harcanan ortamı tüm oyuklardan aspire edin ve büyüme faktörleri olmadan önceden ısıtılmış RDM kuyusu başına bir mililitre ekleyin. Gerekirse, diseksiyon mikroskobu altında bir P10 pipet ucu kullanarak RPE olmayan tüm hücreleri inceleyin ve kazıyın.

Diseksiyondan sonra, RDM'yi ve tüm hücre kalıntılarını aspire edin ve kuyucuk başına bir mililitre önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, 12 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 0,5 mililitre TDE ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, hücreleri plakadan nazikçe çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Düzgün bir süspansiyon oluşturmak için üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre enzim süspansiyonunu nazikçe ezin. Daha sonra, hücre enzim süspansiyonunu, ROCK inhibitörü olmadan önceden ısıtılmış RSM'de bir ila 10 oranında seyreltin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 173 g'da santrifüjleyin.

Beş dakika sonra, ortamı hücre peletinden aspire edin ve hücreleri 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile RSM'de yeniden süspanse edin. Ardından, 40 mikrometre gözenekli bir naylon ağ hücre süzgeci kullanarak hücreleri süzün. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve süzülmüş çözeltideki hücre konsantrasyonunu hesaplayın.

Daha sonra, hücrelerin büyüme faktörü azaltılmış, ECM kaplı plakalar üzerinde 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile dört mililitre RSM'de santimetre kare başına 10 ila beş hücre üzerinde tohumlayın. Hücre tohumlamasından 48 saat sonra RSM'yi 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile değiştirin ve ortamı her üç ila dört günde bir değiştirmeye devam edin. Dört ila yedi gün sonra RSM'ye ROCK inhibitörü eklemeyi bırakın.

Hücrelerin 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 28 ila 35 gün olgunlaşmasına izin verin ve her üç ila dört günde bir RSM'yi değiştirmeye devam edin. Burada, farklılaşma için geçmeden hemen önce indüklenen pluripotent kök hücreler gösterilmiştir. Kök hücreler küçüktür ve koloniler içinde yoğun bir şekilde paketlenmiştir, bu da koloniler arasındaki fibroblastlar veya koloniler içindeki opak geçişler gibi farklılaşmış hücreler içermiyor gibi görünmektedir.

İşte ikinci gündeki olgunlaşmamış RPE hücreleri. Bu aşamadaki hücreler hala alt birleşikte olmalı ve hücreler arasındaki boş alanlara projeksiyonlar genişletmelidir. Bu hücreler, 14. günde zenginleştirmeyi gidermek için toplanmadan öncedir.

RPE olmayan hücreler yamalar veya opak şeritler olarak görünür. Yuvarlak yama fibroblastik morfolojiye sahip hücreler içerirken, opak yamaların nöral retina olduğu düşünülmektedir. Bu görüntüler, 30. günde sıfır, bir ve üçüncü geçişte RPE'yi göstermektedir.

Her geçişte, hücreler birleşik olmalı ve faz parlak sınırlar ve çokgen bir şekil dahil olmak üzere retinal pigmentli epitel morfolojisinin ayırt edici özelliklerine sahip gibi görünmelidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, pasaj ve zenginleştirme teknikleri, hücre kültürünün ölçeğine bağlı olarak bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, RPE'nin büyüme faktörlerini veya fagositoz dış segmentlerini salgılama yeteneği hakkındaki soruları yanıtlamak için gen veya protein miktar tayini ve fonksiyonel testler gibi teknikler kullanılabilir.

2013 yılında Dave Buchholz ve 2015 yılında Lindsay Leach tarafından yayınlanan makaleler, bu yöntemin geliştirilmesini ve optimizasyonunu detaylandırıyor. Alandaki araştırmacıların kullanımına hazır hale getirmek için prosedürdeki her adımın ayrıntılı ve kapsamlı bir gösterimini sağladık. Mutlu deneyler.