Name: CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: Öğrenin, Ictalurus punctatus embriyolarına CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyonu ile gen düzenleme protokolünü. TICAM1 ve RBL genlerindeki başarılı gen knock-out'u ile fonksiyonel genomik araştırmaları destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma için Roger Cone USDA-NIFA Ödülü 2015-67015-23488 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Ronald Phelps damızlık stok seçim ölçütü video açıklaması için teşekkür ederiz. Ahmed Elaswad ve Karim Khalil Mısır kültür ve eğitim büro Washington DC'de doktora araştırma finansmanı için teşekkür etmek istiyorum.

Bu yapılan balık genetik araştırma birimi, E. W. kabuk balıkçılık Araştırma Merkezi, Auburn Üniversitesi, AL. Deneme başlatılmadan önceki bu deneyde kullanılan tüm deneysel protokoller Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (AU-IACUC) tarafından kabul edildi. Bir liste bu deneyde kullanılan malzemeleri ve Ekipmanları Malzemeleri tablosunda bulunabilir. Aşağıdaki adımlar ve yordamlar için hazırlık ve mikroenjeksiyon kanal yayın balığı tek hücreli embriyo şekil 1' de gösterildiği gibi vardır.
1. kara kara hisse senedi seçimi ve yumurtlama
<ol><li>Sağlıklı kanal yayın balığı damızlık stok zorlanma veya ilgi genetik satır'ı seçin. Kanal yayın balığı ve erkeklerde iyi ikincil cinsiyet özellikleri göstermelidir.</li>
	<li>Bedenlerini iyi gelişmiş genital papilla ile geri kalanı daha geniş geniş bir kas kafa var erkek seçin. Koyu renk, yara izi ve bölgesel mücadele üzerinden yaralar da cinsel hazırlık belirtileridir. Vücutlarını geri kalanından daha dar kafaları kadın seçin ve yumuşak, elle tutulur, çok yönlü karın var. Doğruluk ve balık ilk işleme sırasında stres önlemek için kadın 2-3 gün önce yumurtlama için hazır inceleyerek beslemekten.</li>
	<li>Balık hızlı bir şekilde, ama dikkatli bir şekilde işleme gerçekleştirin. İşleme stresi azaltmak için işleme kadın çantaları (32 mm boyut mesh) yumurtlama içinde balık tutarken gerektiren tüm yordamları gerçekleştirin.</li>
	<li>Yumurtlama ikna etmek için sadece hormon enjeksiyonu daha önce kadın vücut ağırlığını ölçmek.</li>
	<li>Yumurtlama çanta içinde dişi tank ile sürekli su akışı ve yeterli havalandırma bir akış içinde asmak.</li>
	<li>Aseptik, 14 G iğne Lüteinizan hormon analog (LHRHa) implant bırakmadan 85 µg/kg olan implanter yükleyin. Enjeksiyon yeri (sırt kas) enjeksiyon önce % 0,9 steril serum fizyolojik solüsyonu ile yıkayın. İmplanter 45 ° açıyla yerleştirin ve implant bırakın. İğne ve kuvvetli darbe enjeksiyon yeri daha önce % 70 etanol ıslatılmış bir pamuk ile geri alıyorum.</li>
	<li>15-20 cm su yüzeyinin altında su böylece balık tamamen içinde batık yeri tankı yumurtlama çantada. Yeterli havalandırma (yukarıda 5 ppm çözünmüş oksijen) ve iyi su kalitesi yüksek kaliteli yumurta yumurtlama için önemlidir.</li>
	<li>Derecesi-saat (h) ilişki35kullanarak su sıcaklığı dayalı yumurtlama zamanı tahmin. Derecesi-h tepki süresi hormonu enjeksiyon ve yumurtlama (h) arasındaki süre = * su sıcaklığı (° C). Örneğin, 900-1000, derece-h tepki süresi için bir erkek hormonu enjeksiyon zaman 25 ° C'de 36-40 h spawn bekleniyor Genellikle, yumurta için ilk onay 36 h hormonu enjeksiyon sonra ve daha sonra 4 h aralıklarla yapılır.</li>
	<li>Yumurtlama için kontrol etmek için yumurtlama çantanın içine eklenen yumurta için arıyoruz iken su yüzeyi üzerinde yumurtlama çanta yavaşça kaldır. En az 10 yumurta görmek bu dişinin yumurtlama ve el sıyırma için hazır olduğunu gösterir.</li>
</ol>2. sperm hazırlama
Not: Sperm bir kaç saat önce beklenen yumurtlama zaman hazır olun.
<ol><li>Anestezi sperm motilitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir beri anestezi, başsız bir vurmalı darbe tarafından erkekler ötenazi.</li>
	<li>Testisler küçük bir tartı tavada toplamak, herhangi bir dokuyu ve gerekirse 50-mL % 0,9 serum fizyolojik kan, kaldırmak için ile yıkayın. İyi gelişmiş testis birçok villiform projeksiyonlar ( Şekil 2) ile beyazdır.</li>
	<li>Testis ağırlığını belirlemek.</li>
	<li>Sperm çözüm yumurta döllenme için hazırlamak için testis forseps kullanarak bir 100 cm2 100 µm kafes Center'a aktarın. Testis testis içinde ezmek ile mesh katlayın ve sperm 50 mL toplama tüp içine filtre. Bu testisler başparmak ile toplama tüp kenarında karşı kafes içinde basınç uygulayarak yapılabilir. % 0,9 serum fizyolojik çözüm kafes toplama tüp içine sperm yıkama için kullanın. Tuzlu çözüm 10 mL/g testis eklenebilir.</li>
	<li>Sperm konsantrasyonu belirlemek, canlılık ve hareket kontrol et. Not: Bir hemasitometre kullanarak milt bilinen seyreltilmiş hacmi sperm hücrelerinde sayarak konsantrasyon belirlenebilir. Alternatif olarak, sperm yoğunluğu bir Spektrofotometre kullanarak milt optik yoğunluk değerlendirerek tahmin edilebilir. Bu yöntemde, 505 nm dalga boyu emme önceden sperm36farklı konsantrasyonlarda emilimi için hazırlanmış bir kontrol listesi karşılaştırılır. Sperm motilitesi mikroskop altında sperm aktive edilene kadar sperm hareketi (hareketliliği süresi olarak da adlandırılır)37kesilmesi zaman olarak kontrol edilebilir. Sperm canlılığı birikmiş sperm günahı kalır iken hangi tek uygun sperm hücresi, leke sperm trypan mavi, gibi seçici boyalar ile boyama tarafından belirlenebilir. Ancak, bu mikroenjeksiyon işlemleri için bu testisler iyi gelişmiştir eğer gerekli değildir.</li>
	<li>Sperm % 0,9 serum adım 2,5 4 ° C'de depolayın ve hazırlık sonra 24 saat içinde kullanın.</li>
</ol>3. yumurta toplama ve gübreleme
<ol><li>Sebze kısalma bir 20 cm çapında pan yumurtlama temiz kuru çok ince bir tabaka uygulayın.</li>
	<li>Arabelleğe alınan tricaine metan Sülfonat sodyum bikarbonat ile 100 ppm içeren anestezik çözüm dişi koyun (nihai çözüm pH 7,0 olmalıdır) Balık tamamen imzalat38olana. Uyarı: Tricaine metan Sülfonat Eğer inhale, hafızanın veya deri yoluyla emilir rahatsız edici olabilir.</li>
	<li>Dikkatle, Balık yumurtlama çantasından çıkartın ve o anestezik çözüm yıkamak için % 0,9 serum içinde eğim. Balık tamamen temiz bir havlu, Balık vücut yüzeyi mukus tabakasının kaldırılması kaçınarak kullanarak kapalı kuru.</li>
	<li>Sebze kısalma yüzgeçleri pelvik el sıyırma sırasında ek yumurta önlemek için de dahil olmak üzere havalandırma, çevresini uygulanır.</li>
	<li>El şerit yumurtaları yumurtlama yağlanmış tavaya yumurtalık için hafif basınç uygulayarak. İyi yumurta serbestçe akışı, altın sarısı renkte olmalı ve çok az var veya yok kümeleri veya kan pıhtılaşması (Şekil 2). Su micropyle kapatma teşvik ettiği gibi arasında yumurta ve gübreleme önce su temasından kaçının.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon için yumurtaları döllemek için yumurtlama pan yağlanmış bir 200 – 300 yumurta aktarın. Yağlanmış plastik bitki Etiketler bir kaşık yumurta için yumurtlama pan yağlanmış aktarmak için kullanılabilir. 1-2 mL (Kimden adım 2.5) sperm çözüm yumurtalara ekleyin ve karışımı yavaşça. Sperm yumurta oranı yaklaşık 11.000 sperm/yumurta olmalıdır.</li>
	<li>Yumurtalara sperm ve yumurta etkinleştirmek için tatlı su ekleyin. Biraz yumurta karşılamak için yeterli su ekleyin. 30 s. gübreleme 1-2 dk içinde oluşması için yavaşça yumurta girdap. Tek bir katmanda düzenlenmiş olan yumurtaları döllemek önemlidir. Yayın balığı yumurta her embriyo çoklu katmanlar microinject önlemek üzere diğer uygun.</li>
	<li>Döllenmiş yumurta daha tatlı su ekleyin ve yumurta için 10-15 dk sertleşmesine.</li>
	<li>Bir kaç saat içinde döller ve kurutma önlemek için ıslak bir havlu tarafından kalan döllenmemiş yumurta içeren yumurtlama tava kapağı. Fertilizasyon kademeli bir şekilde yapılabilir, örneğin embriyo sürekli bir tedarik mikroenjeksiyon ve sigara enjekte denetim embriyolar için bir hücre aşamada emin olmak için her 30-60 dk 200 – 300 yumurta olabilir, bir dizi döllenmiş. Yumurta bunları kaldırmak üzere ıslak havlu uygun gibi ıslak havlu ve yumurtalar arasında temas kaçının. Bu iletişim kuralı, sıyırma sonra 2-3 saat içinde döllenmiş yumurta verimli bir şekilde microinjected ve yumurta olarak benzer başarı hemen sıyırma sonra döllenmiş vardı.</li>
</ol>4. iğne çekerek ve yükleme
<ol><li>1.0 mm OD borosilikat cam kapiller 2 iğneler (şekil 3) çek. İğneler çeşitli kesiler yapılmış sünger parçası ile bir kağıt kutusu saklayın. İğne bozulmaması için sünger çapını iğne kök uzunluğundan daha küçük olmalıdır.</li>
	<li>İğne ucu keskin bir nesne kullanarak ibre en ince bölgenin küçük bir parça kırarak açın. Alternatif olarak, iğne mikroskop altında Forseps ile uç bölgesi en ince pinching tarafından açın.</li>
	<li>Enjeksiyon çözüm gRNA(s) Cas9 protein ile karıştırarak hazırlayın. Diğer türlü RNA ya da protein aynı yordamı ile enjekte edilir. Bu protokol için gRNAs hedef kanal yayın balığı bağışıklık ilgili genlerin, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen için iki tasarlanmış ve Şah ve arkgöre hazırlanmış. yüksek sadakat Taq polimeraz32,39kullanımı ile. EXoN 1 RBL gen protospacer bitişik motifi (PAM) sıra için altı çizili (şekil 6) 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' TICAM 1 gen (şekil 4) ve 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' gRNAs için genomik hedefi oldu.<ol>
<li>PATLAMA Kılavuzu RNA hedeflerine karşı kanal yayın balığı genom sıra ve bu potansiyel hedef kapalı site ile seçin.</li>
		<li>Fenol kırmızı renk gRNA/Cas9 protein Toplam hacim üçte biri kadar karıştırın ekleyin.</li>
		<li>Her embriyo 50 ile enjekte edilir nükleaz boş su ile gRNA/Cas9 protein karışımı nihai toplama ayarlamak yaklaşık 2.5 ng gRNA ve 7,5 ng Cas9 protein içeren nL. Karışımı 10 dakika buz kullanmadan önce kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir microloader ile 5-10 µL gRNA/Cas9 karışımı microloader iğne kök yerleştirip karışımı yavaş yavaş microloader ucu (şekil 3) geri çeker iken kovma enjeksiyon iğne yükleyin. İçinde hava kabarcıkları yakalama kaçının.</li>
	<li>İğne micropipette sahibine eklemek ve sıkı bir bağlantı sağlamak ve sahibi için micromanipulator ekleyebilirsiniz. Ücretsiz kararlı hareket emin olun. Basınç mikroenjeksiyon için azot silindir açılış ve basınç regülatörü yaparak uygulayın. Not: Enjeksiyon hacmi etkilenebilir basınç, iğne diyafram çapı ve enjeksiyon süresi tarafından. Enjekte, bir damla mineral yağı enjekte için birim belirlemek için bir hemasitometre yerleştirilir. Gerekirse, basınç, iğne ve iğne çapı süresi enjeksiyon hacmi azaltmak veya artırmak için ayarlanabilir. Birden çok kez tutarlı cilt sağlamak için mineral yağ enjekte.</li>
</ol>5. Yayın balığı embriyo mikroenjeksiyon
<ol><li>Sebze kısalma 100 mm temiz Petri kabına için çok ince bir tabaka uygulayın.</li>
	<li>Yağlanmış plastik bitki etiket kullanma, 50-100 yumurta döllenme tava Petri kabına aktarmak ve onları Holtfreter'ın çözüm (malzemeler tablo) ile kaplayın. Birbirlerine karşı yumurta tek bir katmanda hizalayın. Bu hizalama yumurtaların mikroenjeksiyon işlemi sırasında yerde tutmak gerekir.</li>
	<li>Petri kabına yumurta ile mikroskop sahnesinde yerini ve tek elle tutun. Bir tek düzgün hareket koryon ve sarısını deliyor dek Öte yandan (şekil 3) iğneyle indirin. İğne ucu enjeksiyon malzeme teslim etmeden önce blastodisc için mümkün olduğunca yakın olmalıdır.<ol>
<li>Sarısı enjeksiyon malzeme sunmak için pedal düşürmek. Blastodisc açıkça görünür değilse, enjeksiyon malzemesi sarısı, farklı konumlarda içine yayılmış. Bunu yapmak için iğne kadar sarısı sonuna eklenir, sonra pedal iç karartıcı ve iğne çekilmesi aynı anda yumurtalı farklı alanları ile enjeksiyon malzeme yaymak için yapılır. 50 nanoliters kadar kanal yayın balığı sarısı embriyo, ancak enjekte edilebilir, gRNA/Cas9 protein miktarı her gen mutasyon oranı ve embriyo hayatta kalma32için en iyi sonuçları elde etmek için optimize edilmiş olması gerekiyor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İğne sorunsuz geri çek yumurta zarar için. Başka bir yumurta ile aynı yordamı enjekte Petri kabına taşıyın. Bu yumurta zarar verebilir veya iğne kırabilir Petri kabına hareketi enjeksiyon işlemi sırasında önlemek. Yırtıldı veya mikroenjeksiyon nedeniyle zarar yumurta kaldırın. Enjeksiyon 15-20 dk sonra gübreleme başlatılabilir ve embriyo (kadar yaklaşık 60-90 dakika sonra fertilizasyon) hala bir hücre aşamasında olduğu sürece devam etmek.</li>
	<li>Enjekte embriyo Holtfreter'ın çözüm doksisiklin ve40çıkım kadar 6-7 gün boyunca sürekli nazik havalandırma 10 ppm ile geri koyun. Çözüm her gün değiştirin ve ölü embriyo kaldırın.</li>
</ol>6. mutasyon algılama
<ol><li>Rastgele, birkaç enjekte embriyo 72 h sonrası döllenme, toplamak, sarısı kaldırmak ve genomik DNA ayıklayın. 3-5 sigara enjekte embriyo bir denetim içerir. Not: Genomik DNA embriyo yumurta kabukları ve sarısı malzeme İndinavir K sindirim ve etanol yağış32kullanarak çıkarıldıktan sonra elde edilebilir.</li>
	<li>GRNA nerede mutasyonlar yüksek sadakat Taq polimeraz32kullanarak gerçekleşmesi beklenen her gen için genomik hedefler kanat bir DNA kesimi yükseltmek. TICAM 1, astar 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG için 3' (İleri) ve 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (ters) bir 750 yükseltmek için kullanılan bp RBL iken, astar 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA için 3' (İleri) ve 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (tersi) için kullanılan RBL gen 375 bp segmentten yükseltmek.<ol>
<li>Aşağıdaki PCR reaksiyon kullanın: 20 µL PCR sınıf su; 1 x yüksek sadakat Taq enzim reaksiyon arabellek MgCl2, 0.2 mM dNTP ile karıştırın, her biri aynı, 100-300 ng genomik DNA ve yüksek sadakat Taq enzim karışımı 1,25 birimleri ileriye ve geriye doğru astar için 0.4 µM. PCR bisiklet koşullarını gerçekleştirmek: ilk denatürasyon 94 ° c 3 dakika; denatürasyon 94 ° C'de 35 döngüleri için 30 55 60 ° C'de tavlama s, s TICAM için ve 40 s için RBL, uzantısı 72 ° c için 1 dk/kb; ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıralama arıtılmış PCR ürünleri, surveyor mutasyon algılama tahlil, heteroduplex hareketlilik tahlil, restriksiyon enzimi tanıma sitesi kaybı gibi bir mutasyon algılama yöntem veya herhangi bir diğer mutasyon algılama yöntemi kullanarak mutant embriyo tespit hedef için uygun. Bu protokol için mutant embriyo TICAM 1 ve sıralama RBL gen için saflaştırılmış PCR ürünlerinin yanı sıra restriksiyon enzimi sapı site kesmek kaybı için arazi mutasyon algılama tahlil kullanarak bulmak.</li>
	<li>Mutant gen tanımlamak için PCR ürünleri ve sıra vektörel çizimler bireysel kolonilerden klonu. Şekil 4 ve şekil 6 ' da sunulan mutant gen enjekte embriyo geldi. PCR ürünleri altı microinjected ve her gen için 3 kontrol embriyo iki ayrı tüp, bir microinjected embriyo ve 86 vektörel çizimler ve diğer denetim embriyolar, hızla klonlanmış için içinde TICAM 1 ve 8 de dahil olmak üzere sıralı, RBL gen için 48 vektörel çizimler için havuza alınmış Her gen için 3 kontrol sigara enjekte embriyo reaksiyonlardan sıralanıyor.</li>
	<li>Farklı mutant gen tanımlamak için mutant embriyo gelen dizileri patlama veya T-kahve gibi herhangi bir DNA dizisi hizalama araç kullanarak vahşi tipi kol için karşılaştırın.</li>
</ol>

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Mikroenjeksiyon gen nakavt elde etmek için kanal yayın balığı embriyolar için detaylı bir protokol sunuldu. Enjeksiyon CRISPR/Cas9 proteinin sarısı çok daha kolaydır zaman kazandırır ve does değil istemek en gen transferi ve gen balıkla düzenleme için ortak teknik tek hücreli embriyo blastodisc microinjecting için karşılaştırıldığında kapsamlı eğitim 30 , 42. Geçerli protokol kanal yayın balığı TICAM 1 ile RBL gen indels inducing başarılı kanıtladı. Bu güvenilir ...

Mikroenjeksiyon, DNA, RNA, protein ve oluştururlar gibi bir madde küçük bir miktar hücreler veya embriyo ile cam kapiller1teslim etmek için kullanılan ortak bir laboratuvar tekniktir. Mikroenjeksiyon bir microinjector, micromanipulator ve mikroskop2de dahil olmak üzere özel ekipman Kurulumu kullanılarak gerçekleştirilir. Teknik genetik transgenics, gen Renkleri çakıştırmama ve gen terapisi, nesil hücre içi bileşenleri3,4 dinamiklerini anlamak amacıyla aracılığıyla birçok organizmalar değiştirmek için araştırmacılar tarafından kullanılan , 5.
Kanal yayın balığı (Ictalurus punctatus) su ürünleri en popüler yayın balığı türler ve eğlence balıkçılık faaliyetleri Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. İşlevsel genomik kanal yayın balığı eğitim için artan bir ihtiyaç ve kanal yayın balığı tam genomunun sıralama genom düzenleme araçları6,7son gelişmeler yarar artırır. Gen işlevini anlama sadece yayın balığı üzerinde yürütülen araştırma zenginleştirmek istiyorsunuz değil, ama aynı zamanda daha etkili genetik geliştirme programları için yayın balığı sanayi geliştirmek için neden olabilir. İlgi belirli bir özellik için kritik gen tanımlandıktan sonra onlar genetik olarak yararlı allelleri oluşturmak için genom düzenlemeyi kullanarak yayın balığı üretimi seçimi için zararlı gen aktarımı, bastırmak bu gen artırmak için kullanılabilir transgenesis veya bu seçeneklerin bir bileşimini yararlı gen. Bir balık farklı türlerden farklı ticari olarak yararlı özellikleri için en iyi genler birleştirerek büyük ölçüde verimlilik ve karlılık balık üretim işlemleri8artıracak.
Gene nakavt gen fonksiyonları içinde vivoçalışmaya doğrudan bir yöntemdir. Mutasyonlar DNA düzeyinde etkileri çalışmanın farklı generations kolaylaştıracaktır gelecek nesiller tarafından devralınır. Farklı genom düzenleme araçları gelişmiş dahil olmak üzere çinko parmak enzimler (ZFNs), transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) edilmiş ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrarlar/CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9 kümelenmiş ) sistem9,10,11,12.
CRISPR/Cas9 sistem genomik DNA dizileri gene nakavt balık RNA güdümlü siteye özgü DNA bölünme5,13arası da dahil olmak üzere düzenlemek için kullanılan güçlü ve etkili bir araçtır. Genom ve bir DNA endonükleaz enzimi, Cas9 hedeflenen sırayla belirleyen bir Kılavuzu RNA (gRNA), sistem oluşur. CRISPR/Cas9 sistem genom herhangi bir sırayla ZFNs ve TALENs çeşitli avantajlar ile hedef için tasarlanmış olması: (1) daha düşük (2) kolay (3) daha özel bağlayıcı Guide RNA hedef sıra için mühendislik maliyet ve hedef kapalı mutasyonlar (4) azaltılmış birden çok dizileri aynı time (5) yüksek mutagenesis oranda TALENs ve (6) geliştirilmiş germline iletim hızıyla mutasyonlar için ilâ 6-fold ZFNs TALENs ve14içinkarşılaştırıldığında mutasyona uğramış değil genlerdeki farklı gRNA ile hedef alınabilmesi, 15,16,17,18.
Ana alternatif mikroenjeksiyon için çoğalmasıyla, elektrik darbeleri embriyo veya hücre membran geçirgenliği ve biyolojik moleküllerin19,20alımını artırmak için uygulanan bir yöntemdir. Birkaç transgenik balık çoğalmasıyla medaka (Oryzias latipes), Zebra balığı (Danio rerio), chinook somon (Oncorhynchus tshawytscha), kanal yayın balığı, çipura (Sparus sarba) gibi kullanarak oluşturulan ve ortak sazan (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Elektroporasyon plazmid DNA, RNA ve Cas9 protein gen nakavt için teslim etmek için kullanılmıştır. Memeli hücrelerinde, Cas9/gRNA plazmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA ve Cas9 protein/gRNA kompleksleri elektroporasyon kullanarak teslim edildi ve mutagenesis gore Cas9 protein/gRNA kompleksleri çoğu elektroporasyon test koşulları27için kullanarak en yüksek. Ascidian Kordalılar (Ciona intestinalis), electroporated birden çok gen28nakavt ikna etmek için döllenmiş yumurta içine TALENs yapıları ifade edildi. Plazmid yapıları ifade ZFNs electroporated Lüteinizan kanal yayın balığı29nakavt olduğunu. Ancak, bir kez hücre içine tanıttı, plazmid yapıları için RNA transkripsiyonu ve büyük olasılıkla için RNA'ın mikroenjeksiyon göre mutagenesis zaman erteleyecek istenen DNA dizisi hedefleyebilirsiniz önce işlevsel proteinler için tercüme gerekir / protein. Bir embriyo geliştiriyor, gecikmeli mutagenesis enjekte kurucuları mozaizm artar. Buna ek olarak, transgenik ifade mutagenesis verimliliği düşürücü mikroenjeksiyon ile mümkün ifade seviyesine ulaşmak mümkün değildir.
Hücrelere genom düzenleme araçları tanıtmak için bir araç olarak mikroenjeksiyon çoğalmasıyla birçok avantajı vardır. Molekülleri düzenleme genom güvenilir bir şekilde hücreleri veya mikroenjeksiyon30ile embriyo içine tanıttı olabilir. Daha az enjeksiyon malzeme gereklidir. Enjekte malzeme miktarlarını belirlemek kolaydır. Daha yüksek mutasyon oranları düşük mozaizm kurucusu balık ile olabilir hangi-cekti geliştirmek germline iletim F1mutasyonların elde. Daha az kurucusu balık daha yüksek mutasyon oranı nedeniyle ilk nesil üretmek için çözümlenmesi gerekir. Elektroporasyon içinde daha fazla kurucusu balık analiz edilecek olan maliyeti artacak gerekir. Ancak, bu daha fazla embriyo31,32enjekte edilerek üstesinden gelebilir rağmen kanal yayın balığı microinjected embriyo yaşama electroporated olanlar, düşüktür. Kanal yayın balığı, yumurta sarısı microinjected embriyo 16'dan bağlı olarak hedef genlerin % 55 arasında değişiyordu yaşama ve gRNA/Cas9 protein32doz.
Yayın balığı embriyo düzenli mikroenjeksiyon teknik olarak talep ediyor ve zaman alıcı ancak, hızlı ve verimli CRISPR/Cas9 protein mikroenjeksiyon protokolü için kanal yayın balığı embriyo sunulur. CRISPR/Cas9 protein çözüm bir hücre embriyo sarısı enjekte edilir beri bu iletişim kuralı daha az zaman ve uzmanlık gerektirir. Döllenmiş yumurta yüzlerce 1 h (yaklaşık zaman gerçekleşmesi ilk hücre bölünmesi gerekli) enjekte edilir. Protokol doğrulamak için iki hastalığı duyarlılık ile ilgili gen kanal yayın balığı, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen nakavt. TICAM 1 toll benzeri reseptör (TLR) 3 tarafından başlatılan sinyal yolu ilgilenmektedir. Kanal catfish TICAM 1 önemli ölçüde downregulated mavi kedi balığı, bir tür dirençli E. ictaluri33içinde iken bakteriyel meydan okuma ile Edwardsiella ictaluri, takip upregulated oldu. RBL oynar önemli bir rol ile Flavobacterium columnare, columnaris hastalığı, hastalığının erken enfeksiyon akut nerede ve sağlam upregulation göre columnaris duyarlı kanal yayın balığı gerginlik kaydedildi bir columnaris dirençli34.

<table><tbody><tr><td>Reproboost</td><td>implantı Deniz Biyoteknolojisi</td><td></td> Merkezi Kanal <td>yayın balığı dişilerinde yumurtlamanın indüksiyonu için luteinize edici hormon salgılayıcı hormon analoğu (LHRHa)</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>Hormon enjeksiyonu ve yumurta sıyırma sırasında kuluçka balıklarının sedasyonu için.</td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>%0,5, steril filtreli</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Olympus</td><td>213709</td><td>Mikroenjeksiyon sırasında yumurtaları görselleştirmek için</td></tr><tr><td></td><td>Mikroenjektör ASI Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon&nbsp;</td><td>Model MPPI-3</td><td>Enjeksiyon materyalinin embriyolara verilmesi için</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>ASI Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon&nbsp;</td><td>Model MM33&nbsp;</td><td>Enjeksiyon iğnesinin hareketini tutmak ve kontrol etmek için.</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Enjeksiyon solüsyonunu mikroenjeksiyon iğnelerine yüklemek için.</td></tr><tr><td>Dikey iğne çektirme</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td>Mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için</td></tr><tr><td>Cas9 proteini</td><td>PNA Bio Inc.&nbsp;</td><td>CP01</td><td>Streptococcus pyrogenes'ten elde edilen rekombinant Cas9 proteini.</td></tr><tr><td>High FidelityPLUS PCR Sistemini Genişletin</td><td>&nbsp; Roche Diagnostics, ABD</td><td></td><td>gRNA hazırlamada kullanılacak DNA şablonlarının PCR ve amplifikasyonu için</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1 mm dış çap (OD), mikroenjeksiyon iğneleri yapmak için.</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Mikroenjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için.</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>Yumurtlama tavalarını ve petri kaplarını kaplamak için sebze katı yağı.</td></tr><tr><td>Holtfreter'in çözümü</td><td>Ev Yapımı</td><td></td><td>59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 mikroenjekte edilen embriyoları yumurtadan çıkana kadar inkübe etmek için.</td></tr><tr><td>Doksisiklin hyclate USP (monohidrat)</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>Antibiyotik, bakteriyel enfeksiyonları önlemek için Holtfreter'in çözeltisine 10 ppm'ye kadar eklendi.</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, ictalurus yılan, embriyo içine

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, Komple genom, kanal yayın balığı gen işlev eğitim için daha büyük fırsatlar için önde gelen Sıralı. Gene nakavt bu gen fonksiyonları içinde vivoçalışmada kullanılmaya başlanmıştır. Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced güçlü bir araç genomik DNA dizileri gene işlevi değiştirmek için düzenlemek için kullanılan bir sistemdir. Geleneksel bir yaklaşım içine tek hücreli embriyo mikroenjeksiyon ile CRISPR/Cas9 mRNA tanıtmak olmuştur iken, bu yayın balığı yavaş ve verimsiz bir işlemde olabilir. Burada, mikroenjeksiyon kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 protein ile detaylı bir protokol açıklanmıştır. Kısaca, yumurta ve sperm toplanan ve daha sonra suni döllenme gerçekleştirilen vardı. Döllenmiş yumurta Holtfreter'ın solüsyon içeren bir petri için transfer edildi. Enjeksiyon hacmi kalibre edilmiş ve daha sonra geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM 1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen tek hücreli embriyo sarısı microinjected RNA'ların / Cas9 hedefleme rehberlik. Gen nakavt başarılı olduğu indels DNA sıralama tarafından teyit edildi. Tahmin edilen protein sıra değişiklikler nedeniyle bu mutasyonlar frameshift dahil ve protein erken kodon nedeniyle kesildi.

Mikroenjeksiyon protokolünün etkinliği göstermek için kanal yayın balığı otoyol/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen hedeflemek için tasarlanmış gRNAs microinjected.
TICAM 1 DNA sıralama vektörlerin havuza alınan, klonlanmış PCR ürünleri bireysel kolonilerden TICAM 1 gen indüklenen Indel mutasyonlar saptandı. Mutasyon oranı % 79 24 ...

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA'ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Gen düzenleme için CRISPR / Cas9 proteininin kanal yayın balığı, Ictalurus punctatus embriyolarına mikroenjeksiyonu. Kanal yayın balıklarında hedeflenen gen düzenlemesi için güvenilir ve verimli bir protokolün geliştirilmesi, fonksiyonel genomik çalışmaları için çok önemlidir. Özellikle genomik kaynaklar, kanal yayın balığı genomunun dizilimi ile zenginleştirildikten sonra.Burada, kanal yayın balığında CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, iki kanallı yayın balığı bağışıklığı ile ilgili genleri hedefleyerek geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Adaptör molekülü veya TICAM1 geni ve ramnoz bağlayıcı lektin veya RBL geni içeren Toll / interlökin-1 reseptör alanı.Tüm prosedürler, Alabama'daki Auburn Üniversitesi'ndeki EW Kabuk Balıkçılık Araştırma Merkezi'nin balık genetiği araştırma biriminde gerçekleştirildi. Kuluçka stoğu seçimi ve yumurtlama. Düzenlemek istediğiniz bir suş veya genetik hattan sağlıklı kanal yayın balığı kuluçka stoğunu seçin.Kanal yayın balığı erkekleri ve dişileri iyi ikincil cinsiyet özellikleri sergilemelidir. İyi gelişmiş bir genital papilla ile vücutlarının geri kalanından daha geniş kaslı kafaya sahip erkekleri seçin. Ko

microinjection-crisprcas9-protein-into-channel-catfish-ictalurus

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

Bu protokol, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemelerini kolaylaştırmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Uzun QT Sendromu ile ilişkili bir gen varyantını modellemek için bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için bir fenotipleme boru hattı sunulmuştur.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Bu protokol, genetiği değiştirilmiş sıçan modelleri üretmek için optimize edilmiş bir yaklaşım sunar. Adeno-ilişkili virüs (AAV), bir DNA onarım şablonu sunmak için kullanılır ve elektroporasyon, 2 hücreli embriyoda genom düzenleme işlemini tamamlamak için CRISPR-Cas9 reaktiflerini iletmek için kullanılır.

CRISPR-Cas9 Adeno-İlişkili Virüs (AAV) ve 2 Hücreli Embriyo Elektroporasyonu Kullanılarak Sıçan Embriyolarının Genom Düzenlemesi

Öğrenin, Ictalurus punctatus embriyolarına CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyonu ile gen düzenleme protokolünü. TICAM1 ve RBL genlerindeki başarılı gen knock-out'u ile fonksiyonel genomik araştırmaları destekler.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

Daha fazla video keşfet