İnşaat ve bir fare grefti Osteoliz modeli aseptik gevşeme içinde CoCrMo parçacıklar maruz tarafından değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, kobalt-krom-molibden nanoparçacıklara maruziyet yoluyla Murine Kalvaryal Osteoliz Modelini oluşturmak ve değerlendirmektir. Aşınma parçacıklarının tetiklediği osteoliz, artroplasti başarısızlığında aseptik gevşemenin temel nedenlerinden biridir, ancak bunun altında yatan mekanizmalar belirsizdir. Uzun takip süresi ve sporadik görülme sıklığı nedeniyle, klinik vakalarda aseptik gevşemenin patogenezini araştırmak güçtür.

Bu nedenle, daha ileri çalışmalar için bir aşınma hayvan modeline ihtiyaç duyulmaktadır. Laboratuvarımızda, kobalt alaşımı partikülleri ile oluşturulan murial kalvarial osteoliz modeli, aseptik gevşemenin patogenezini incelemek için etkili bir modeldir. Bu işlem, öncelikle kobalt alaşımlı protezden nan ölçekli kobalt krom molibden partiküllerinin üretilmesi ve ardından bunların 15 mg/mL konsantrasyonda fosfat tamponlu salin içerisinde yeniden süspande edilmesiyle gerçekleştirilir.

Bir sonraki adım, sırasıyla iki göz ve iki kulak arasındaki orta noktaları birleştiren hat üzerinde insizyon konumunu belirlemektir. Ardından, kafa kemiğinin üzerindeki periostu şok diseksiyon yöntemiyle uzaklaştırın. Sonrasında, 50 µL kobalt alaşımlı nanopartikül stok çözeltisi alın ve bunları kalvaryumun orta sütürüne yerleştirin.

İki haftalık bakım sürecinin ardından, bazı fareleri sakrifiye edin ve osteoliz değerlendirmesi için kalvaryaları toplayın. Kobalt alaşımlı nanopartikül ile tedavi edilen farelerde osteoliz, hem mikro-BT hem de H ve E boyama görüntülerinde belirgindir. Kobalt alaşımlı protezden kobalt krom molibden alaşımı elde edin; ardından yüksek vakumlu üç elektrotlu doğru akım yöntemiyle kobalt krom molibden alaşımından kobalt krom molibden partikülleri üretin.

Kobalt krom molibden parçacıklarının ortalama çapını belirlemek için, bir miligram parçacığı 1,5 mililitre susuz etanol içine alın ve ultrasonik çalkalama ile süspansiyon haline getirin. Süspansiyondan yaklaşık 20 mikrolitre olan bir damlayı transmisyon elektron mikroskobunun objektif tablasına uygulayın ve bir dizi görüntü elde edin. TEM görüntülerindeki ortalama çapı ve parçacık boyutu dağılımını hesaplamak için sağlanan yazılımı kullanın.

Sol panelde temsili TEM görüntüleri yer alırken, sağdaki panel ticari yazılımımız tarafından hesaplanan kobalt krom molybdem alaşımı nanopartikül boyut dağılımını göstermektedir. Ortalama çap yaklaşık 50 nanometredir. Endotoksinleri uzaklaştırmak için partikülleri 15 dakika boyunca otoklavlayın.

Ardından, bunları stok çözelti olarak 15 mg/mL konsantrasyonunda fosfat tamponlu salyende yeniden süspande edin. Bir sonraki adım, kalvaryal osteoliz modelinin oluşturulmasıdır. Altı haftalık fareleri seçin ve anestezi altına alın: grup başına altı fare.

Hayvanları primer pozisyona getirin. Kürkünü temizleyin ve kranyum üzerindeki deriyi %75 etanol ile dezenfekte edin. İnsizyon için, sırasıyla iki göz ve iki kulak arasındaki iki orta noktayı belirleyin ve bu noktaları birleştiren hat boyunca deriyi kesin.

Kranial periost, şok diseksiyon yoluyla kalvaryumdan dikkatlice ve tamamen uzaklaştırılır. Periostun temiz bir şekilde diseksiyonu, kalvaryadaki partiküller arasındaki etkileşimleri artırır. Kesi hattının her iki ucunda, basit ayrı dikişler şeklinde dikkatle sütürleme yapılır.

Genellikle tam bir sütür için üç dikiş gereklidir. Son aşamada, sütür hattının her iki ucunu tutarak, düğüm atmadan sütür hattını insizyondan geçirin. 15 µL kobalt alaşımı stok çözelti nanoparçacıkları alın ve bunları kalvaryumun orta sütürüne yerleştirin.

Basit ayrı dikişlerde son dikişi düğümleyin. Fareleri iki hafta daha besleyin. İki hafta sonra hayvanı sakrifiye edin ve kalvaryumları toplayın.

Kafatası numuneleri üzerindeki tüm yumuşak dokuları cımbız yardımıyla nazikçe temizleyin ve dokuyu dört derece Celsius sıcaklıkta yüzde dört paraformaldehit içerisinde sabitleyin. Kobalt krom molibden nanoparçacıkla indüklenen modelde osteoliz değerlendirmesi için, mikro-CT taramasından 24 saat önce yüksek çözünürlüklü mikro-CT gerçekleştirin. Kafatası numunelerini paraformaldehitten fosfat tamponlu saline aktarın.

Mikro-CT tarama gününde, kalvaria örneklerini fosfat tamponlu salinden toplayın ve cihazla ilişkili bir tutucuya sabitleyin. Kalvaryaları mikro-CT cihazında tarayın. Çeşitli yazılımlar kullanarak üç boyutlu rekonstrüksiyon gerçekleştirin.

H ve E boyaması, nanopartikülle indüklenen bir modelde osteoliz değerlendirmesi için kullanılan bir diğer araçtır. Kalvaria örneklerini, yüzde 15 etilendiamintetraasetik asit içeren fosfat tamponlu salyonda, dört derece Celsius'ta üç hafta boyunca dekalsifiye edin. Dekalsifiye edilmiş kalvaryaları parafine gömün ve partikül birikim bölgesinden iki mikrometrelik kesitler alın.

Kesitleri hematoksilin ve eozin ile boyayın. Genel morfolojiyi ışık mikroskobu ile inceleyin ve mikrograflar edinin. İşte temsilci mikro-BT görüntüleri.

Micro-CT verilerinin üç boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleri sol panelde gösterilmiştir. Kontrol, sham operasyon ve nanoparçacık uygulanan farelerden alınan kesit görüntüleri sağ panelde gösterilmiştir. Nanoparçacık tedavi grubunda osteoliz belirgindir.

Cihazla ilişkili yazılım tarafından gerçekleştirilen mikro-BT fotoğraflarının kantitatif analizi burada sunulmuştur. Ölçümler kemik mineral yoğunluğu, kemik hacmi veya toplam hacim oranı, toplam gözeneklilik yüzdesi, trabeküler sayı, trabeküler kalınlık ve trabeküler ayrılma veya aralık değerlerini içermektedir. Kobalt alaşımlı nanoparçacıklarla tedavi edilen fareler, kontrol hayvanlarına kıyasla anlamlı derecede daha düşük kemik mineral yoğunluğu ve kemik hacminin yanı sıra daha yüksek toplam gözeneklilik yüzdesi göstermektedir.

Kontrol, sham operasyon ve nanopartikül uygulanan farelerden alınan kalvaria örneklerine ait temsilci H ve E boyama görüntüleri burada sunulmuştur. Nanopartikül uygulama grubunda osteoliz belirgindir. Kobalt alaşımı nanopartiküllerle oluşturulan fare kalvarial osteoliz modeli, aşınma partikülü kaynaklı osteolizin modellenmesinde yüksek başarı oranına sahiptir.

Aşağıda birkaç temel faktör yer almaktadır. Birincisi, kobalt alaşımlı nanoparçacıklar, aşınma parçacıkları ile kalvaryum arasındaki etkileşimi artırır. İkincisi, kalvaryumun yeterince açığa çıkarılması ve periostumun net bir şekilde diseke edilmesi, parçacıklar ile kalvaryum arasındaki etkileşimi daha yoğun hale getirir.

Üçüncü olarak, mikro-BT ile kemik kaybının kantitatif ölçümleri, çeşitli tedaviler arasındaki kemik kaybı farklarına erişimi kolaylaştırarak, geleneksel kemik histomorfometrisi ile karşılaştırıldığında osteolize dair bize sağlam kanıtlar sunar. Kobalt alaşımı partikülleri ile oluşturulan aşınma kalvaryum osteoliz modeli, aseptik gevşemede aşınma partikülleri ile makrofajlar, fibroblastlar, osteoklastlar ve osteoblastlar gibi farklı hücreler arasındaki etkileşimi araştırmak için ideal bir modeldir.

Modelimizin, gelecekteki aseptik gevşeme çalışmaları için faydalı olacağını umuyoruz.