Name: Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Öğrenin Drosophila embriyo ve dokularında yüksek çözünürlüklü RNA in situ hibridizasyon yöntemini. Tiramid sinyal güçlendirme ve 96-kuyucuklu plakalar kullanarak maliyet etkin, yüksek duyarlılıklı analiz yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Destek bu proje için finansman bir grant tarafından HMK Kanada kurumları, Sağlık (paspas 133473 vermek) araştırma tarafından sağlandı.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Açıklanan protokol sabit Drosophila embriyo veya doku çoğu RNA'ların tespiti için son derece hassas, tekrarlanabilir ve ekonomik bir yöntemdir. Her ne kadar daha geleneksel alkalin fosfataz yöntemi sonda algılama eskisinden biraz daha karmaşık, balık tarafından elde edilen çözünürlük çok daha büyük ve duyarlılık karşılaştırılabilir veya geliştirilmiş 7,8. Tamamını veya bir kısmını microtiter plakaları kullanarak, iletişim kurallarını genler ilgi büyük ölçekli veya sınırlı analizleri için kullanılabilir. Oluşturulan probları tüm algılayabilir veya sondalar özellikle tasarlanmıştır sürece birden fazla transkript splice oluşturur unutulmamalıdır (yani, tek ekzonlar). Probları makul başarı ile 200 nükleotit olabildiğince küçük test ettik rağmen daha küçük sondalar daha az etkili olma eğilimindedir ve daha az belirgin olabilir. Açıkça, bu protokol küçük intron, ekzonlar, tespiti için uygun değildir ya da mikroRNA'lar işlenir.
Sinyal gücünü artırmak için enzimatik bir adım bu yaklaşım kullanır, ancak sinyal yoğunluğu hedef gen ifadesinin ifade düzeyleri nispeten doğrusal ve geniş bir yelpazesi ile orantılı olarak düşünülür. Yüksek büyütme oranında sinyal puncta veya speckles olarak görülüyor hücre ve dokuların içinde. Nispeten nadir transkript için sadece birkaç küçük puncta görülür. Transkript bereket arttıkça, bunlar sayı ve boyutu büyür. Tek molekül olarak balık (smFISH) ile tek küçük puncta için tek RNA'ların da karşılık ve aynı zamanda kolayca görüntüleme ve Bilişim yazılım kullanarak sayısal. Karşılaştırmalar Yayınlanan görüntülerin smFISH biz küratörlüğünü görüntülerle aynı hedefler için kullanılarak elde her ne kadar bu-meli var olmak sınav daha titiz karşılaştırmalar tarafından genel, duyarlılık ve kararlılık-in iki yöntem nispeten benzer olduğunu göstermektedir. SmFISH çok daha yüksek masrafına göz önüne alındığında, burada sağlanan yöntem maliyetinin bir kısmını benzer sonuçlar verecektir. Ancak, Eğer amaç küçük transkript veya transkript farklı yerlerini tespit etmek, smFISH önerilir.
Bazı balık probları daha küçük boyutu nedeniyle, bu yöntem aynı zamanda büyük veya önemli engelleri delici doku daha iyi olabilir. Ancak, bizim kullanımı daha yüksek deterjan düzeyleri ve doku fiksasyon ve permeabilization tweaks bu sorunu çözmüş görünüyor. Son olarak, Drosophila dokular için geliştirilen rağmen burada açıklanan disseke dokular için yüksek deterjan arabellekleri da Drosophila embriyo yanı sıra diğer çoğu organizmalar ve dokular için çalışması gerekir.

Yeni genom çapında RNA algılama yöntemleri RNA-seq gibi büyük ölçüde bizim bilgi ne zaman ve nerede genlerin ifade edilir ve ne1düzeyleri genişletmiştir. Ancak, bunlar nispeten yoksul zamansal ve mekansal çözünürlüğü sağlar. İn situ hibridizasyon RNA transkript görsel olarak sabit dokularda uyması gereken kayma dağılımını böylece hücresel ve hücre altı Yerelleştirme2bilgilerinizi ortaya çıkarmak sağlar. Floresan In situ hibridizasyon (balık) kullanarak sayfayı confocal ve ışık mikroskobu3gibi güçlü mikroskobu tekniklerin kullanılması verdiğinden daha fazla Uzaysal çözünürlük sağlar. Floresan işaretleri DAPI gibi hücre altı ilişkileri4kurmak için de kullanılabilir. Balık aynı zamanda birden çok RNA ve proteinler gözlem örtüşme hücre altı düzeyde net göstergeler ile aynı anda kolaylaştırır. Benzersiz reaktifler ve çift etiketleme için gereken adımları aşağıdaki başvuruları3,5' te bulunabilir.
Burada açıklanan yordamları 96-de microtiter plakaları cDNA şablon üretim (koloni PCR), RNA sonda üretim (T7, T3 veya SP6 polimeraz bağımlı axım transkripsiyon kullanarak), içinde in situ hibridizasyon, dahil olmak üzere tüm adımları için kullanmak ve Floresan sinyal geliştirme. Yeterli sayıda embriyo veya doku her eklenir tutarlılık ve değişkenlik değerlendirilmesi izin vermek için de 96-şey plaka. Her bir farklı sonda o zaman alır. Sonra sinyal geliştirme, embriyo ya da her şey dokulardan mikroskobik analizlerin yapıldığı için bireysel mikroskop slaytlarda dizilmiş.
Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) kullanım sonda algılama için olağanüstü hücre altı çözünürlük 5,6,7,8ile sağlam sinyalleri üretir. RNA'ların hücre altı lokalizasyonu hemen hemen tüm RNA'ların 4,10,11ile gerçekleşmesi için görünür bir önemli yasal mekanizma 9 ' dur. Bu analizler da RNA-seq tarafından algılanmaz birçok transkript balık 8tarafından kolayca algılanır göstermiştir. RNA in situ hibridizasyon 96-şey plakaları için uyum analiz ilgi 96 genlerin büyük veri analizini mümkün hale (tabak daha ek izin verirseniz kullanılır) bir anda, sağlar. Plakayı daha küçük bölümler halinde keserek, yöntemi de kolayca sadece birkaç örnekleri için uyarlanmıştır. Gelen doğrulama doku türlerinin çoğu RNA dağıtımları çözümlenmesi için uygundur. Her ne kadar gösterilmez, non -Drosophila dokulara de uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>15 ml Polipropilen konik santrifüj tüpleri</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Sertifikalı DNase ve RNase içermez</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix ile boya (Ambiogene)Biomart</td> <td>(Kanada)</td><td>141106-1K</td><td>Sertifikalı DNase ve RNase içermez</td></tr><tr><td>50 ml Polipropilen konik santrifüj tüpleri</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>Sertifikalı DNaz ve RNase içermez</td></tr><tr><td>96 oyuklu filtreleme plakası (1,2 um, hidrofilik PVDF membran</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Floting dokuları ile plakanın altından sıvıyı çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>96 oyuklu PCR plakası (200 & mu; l)</td> <td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc şırınga filtresi (0.2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc şırınga filtresi (0.45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96 kuyulu tahlil saklama plakaları</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Bakteriyel gliserol stoklarını depolamak için</td></tr><tr><td>AXYGEN Alüminyum Plaka Contaları</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Plakaları kapatmak için</td></tr><tr><td>AXYGEN Geniş delikli uçlar (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Numuneleri aktarmak için</td></tr><tr><td>Biotin-SP (uzun aralayıcı) IgG Fraksiyonu Monoklonal Fare Anti-Digoksin</td><td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarı</td><td>200062156</td><td>Yerinde için birincil antikor (stok konsantrasyonu 1 mg/ml, çalışma konsantrasyonu 2.5 & mu; g / ml veya 1/400 seyreltme.</td></tr><tr><td>MARKA 8 kanallı manifold (otoklavlanabilir)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>96 oyuklu PCR plakalarının üstünden sıvıları çıkarmak için</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Stok konsantrasyonu 34 mg / ml çözünmüş ve 0.2&mu; % 100 EtOH içinde filtrelenmiş m (1/1000 olarak kullanın)</td></tr> <tr><td>Siyanin 3 Tiramid (Cy3-TSA)</td> <td>Ev yapımı</td><td></td><td>Perkin-Elmer Cat#'ten sipariş edilebilir SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabisiklo [2.2.2] oktan)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Antifade reaktifi montaj ortamında</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-uridin-5'-trifosfat</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo toplama kafesi</td><td>Ev N</td><td>/ A</td><td>Boyut: 75 cm X 75 cm X 75 cm Polimetil metakrilat ile yapılmıştır</td></tr><tr><td>Eppendorf santrifüj 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>AZ-DWP rotor Formamid üzerinde 96 oyuklu plakalar için</td></tr> santrifüj <tr><td></td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Stok: 50 mg/ml. Hibridizasyon çözeltisinde çalışma konsantrasyonu 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Lab Armor</td><td>Beads DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Isıtma ünitesini doldurun</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Somunlama Mikseri</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Örnek karıştırma</td></tr><tr><td>Mesh - 100 mikon</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Embriyo toplamak için</td></tr><tr><td>Mesh - 800 mikron</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Gevşek dokuyu yakalamak için / şekil 4'teki özel tüp için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mikro Kapaklı Camlar</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Boyut: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Mikro slaytlar, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Boyut: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Çok Kuyulu Plakalı Vakum Manifoldu</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>96 oyuklu filtre plakasının altındaki sıvıyı çıkarın</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Fiksasyon</td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Bio-Rad</td><td>Modeli: DNA Motoru PTC-200</td><td>96 oyuklu plaka PCR ve prob denatüre</td></tr><tr><td>Pikrik asit çözeltisi</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Doku fiksasyonu için I çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar için PP kapak, 100/kutu</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Plakaları saklamak için kapak</td></tr><tr><td>Progene tek kullanımlık Reaktif Rezervuarları (50 ml, steril)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Sıvı işleme</td></tr><tr><td>Progene Delinebilir Alüminyum Folyo</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Conta 96 oyuklu plaka, DNaz ve RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Embriyo geçirgenliği</td></tr><tr><td>RiboLock Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Birim/ul</td></tr><tr><td>Ribonükleozit Trifosfat (NTP) seti</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>RNA prob sentezi</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNA prob sentezi</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td> Somon testislerinden <td>RNase kontaminasyonunu çıkarın</td></tr><tr><td>Tek sarmallı DNA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Hibridizasyon çözeltisi için</td></tr><tr><td>Yağsız süt (yağsız güç)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>Bloke edici reaktif olarak çalışma konsantrasyonu 1 X PBT veya PBTT'de %1'dir</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNaz içermez)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>DNA veya RNA çökeltmesi için çalışma konsantrasyonu %10'dur (h/h)</td></tr><tr><td>SP6 RNA Polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Kum Banyosu için Birim/ul</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Bilye</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Isıtma ünitesini doldurmak için</td></tr><tr><td>Stereomikroskop ve deveboynu ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td>Model: MZ6</td><td>Doku diseksiyonu ve montajı</td></tr><tr><td>Streptavidin, yaban turpu peroksidaz (HRP) konjugatı</td><td>Moleküler Problar</td><td>S911</td><td>İkincil antikor stoğu: 1 mg / ml, 1/1000 seyreltme kullanın (1 & mu; g/ml) in situ için.</td></tr><tr><td>T3 RNA Polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Ünite/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA Polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Ünite/ul</td></tr><tr><td>Uç istasyonu (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Sertifikalı DNaz ve RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Uç istasyonu (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Sertifikalı DNaz ve RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Uçlar (1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>Sertifikalı DNaz ve RNase içermeyen</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>Çalışma konsantrasyonu, yerinde doku için 1 X PBT'de %0,3'tür</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>Çalışma konsantrasyonu, embriyo in situ Whatman kalitatif filtre kağıdı için 1 X PBT'de %0,1'dir</td></tr><tr><td>, Grade 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Hazırlık</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabisiklo[2.2.2]oktan) gliserol solma önleyici montaj ortamı</td><td></td><td></td><td>DABCO (1.25 g), Gliserol (35 ml veya h/v %70) ve 1 X PBS (15 ml veya h/v %30). Karanlık tutun ve soğuk odada sallanın. -20 & °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 x PBS, 1 ml Tween 20 (% 0,1)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 x PBS, 1 ml Tween 20 (% 0,1) ve 3 ml Triton-X-100 (% 0,3)</td></tr> <tr><td>ile 1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBT'de yağsız süt 1 X PBTTB</td></tr><tr><td>(1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBTT'de %1 Yağsız süt</td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü floresan situ hibridizasyon drosophila embriyo ve tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Çabalarımızı ifade şekillerinin ve hücre altı Yerelleştirme Drosophila RNA'ların genom-wide olarak belirlemek için ve dokular çeşitli, çok sayıda değişiklik ve iyileştirmeler bizim orijinal floresan için in situ olarak geliştirdiğimiz hibridizasyon (balık) protokolü. Performans ve maliyet etkinliği kolaylaştırmak için sonda nesil sinyal algılama, tüm adımlar exon 96-de microtiter plakaları kullanarak gerçekleştirilir. Digoxygenin (KAZMAK)-etiketli Antisens RNA probları cDNA klonlar veya genomik DNA şablon olarak kullanılarak üretilmektedir. Sonra doku fiksasyon ve permeabilization, sondalar faiz transkript melezleşmiştir ve sonra tespit edilen Anti-KAZMAK antikor bir arkaya kullanarak biotin, horseradish peroksidaz (HRP) Birleşik ve fluorescently Birleşik streptavidin Birleşik tyramide, hemen bitişik proteinler elektron yoğun bölgelere bağlar büyük ölçüde reaktif bir orta üreten HRP, huzurunda. Amplifikasyon ve yerelleştirme adımları her iki hücre ve hücre altı transkript yerelleştirme kolaylaştıran güçlü ve son derece lokalize sinyal üretirler. Sağlanan protokoller doku ve gelişim aşamalarında, çeşitli çok özel sinyalleri üretmek için optimize edilmiştir. Başvurular da aynı anda birden fazla Tutanaklar, veya transkript ve proteinler, algılama aynı anda izin daha fazla varyasyon için sağlanır.

Şekil 6 bu yordamı kullanarak elde edilen sonuçlar gösterilmektedir. En iyi 3 panelleri erken Drosophila embriyo (şekil 6, paneller A-C), gelecek 3 panelleri geç Drosophila embriyo sinyalleri ile farklı dokularda (amnioserosa, kas ve merkezi sinir sistemi, örnekler örnekler sırasıyla (şekil 6, panelleri D-F). Sonraki 3 INSTAR örneklerden larva dokuları (şekil 6, paneller G-J) vardır. Panelleri K ve L yetişkin gonads temsilcisi görüntüleri göster (yumurtalık ve testis, sırasıyla). Görüntüleri yüzlerce yükledi ve bizim aranabilir açıklamalı 'Floresan situ meyve sineği veritabanı' (bulaşıcı (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Şekil 1. Floresan situ hibridizasyon (balık) protokolü ve anahtar ekipmanlar taslağını. (A) PCR cDNA amplifikasyon. Gene özgü antianlamlı KAZMAK - oluşturmak için (B) vitro transkripsiyonu RNA probları bir 96-şey plaka (fotoğraf b'de gösterildiği plaka) etiketli. (C) ve (D): yetişkin (kadın: erkek oranı 2:1. 300-400 uçar/şişe) sinekler için 3-4 gün dostum izin verilir. Embriyo standart Mısır unu gıda 25 ° c gece bir koleksiyon için iyi havalandırılan bir plastik kutu aktarılır (Mısır unu gıda boyutlu bir kapta 1 L: 8 "X 8" X 3" LWH) veya yeni şişe uygun bir larva yoğunluğu tutmak. Dokusu toplamalarında aktif Maya toz gıda 24, 48 h (AEL) döşeme yumurta sonra üzerine serpilir. (E h): Floresan situ hibridizasyon deneyleri 3 gün üst üste gerçekleştirilen. Embriyo veya değil float dokular için 96-şey PCR plaka fotoğraf b 8-kanal aspiratör (fotoğraf c) ile gösterildiği gibi kullanın. Float, çoğu larva doku gibi dokularda bir filtre popolu tabak (d fotoğrafta) kullanın ve düşük basınç (e fotoğrafta) kullanarak bir manifold aspiratör ile altındaki sıvı çıkarın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Şekil 2. RNA sonda verim belirlenmesi. Yeni sentezlenen bir % 1'özel jel (5 µL/lane) gözlenen Antisens RNA sondalar. Verim (grup yoğunluğuna göre) kategorize edilebilir olarak 'düşük verim' Lanes 3 ve 10, Lanes 1, 4, 5, 6 ve 8 ' tipik verim' veya 'yüksek kapasiteli' Lanes 2, 7, 9, 11 ve 12. 'Tipik verimleri' ile örnekleri için 10-15 µL hibridizasyon çözüm her in situ deneme için 100 µL içinde seyreltilmiş inceleyebilirsek kullanın. 'Yüksek verimi' soruşturma 'tipik sonda' yoğunluğu göreli bant yoğunluğu göre ek hibridizasyon Çözümle örnekleriyle sulandırmak. Kabaca eşit son yoklama konsantrasyonları her şey var hedefliyoruz. Oku 'RNA probları', birine puan daha yüksek her Lane'de özgün DNA şablonu grubudur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Şekil 3. Büyük adımlar için bir büyük ölçekli embriyo toplama ve fiksasyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Şekil 4. Sıvı larva veya kayan dokulardan kaldırmak için ev yapımı tüp. Larva ve yetişkin mendil çözümde fiksasyon sırasında float. Bu basit araç ipucu olarak bir aspiratör bağlamak için bir adaptör 1 mL bahşiş tarafından takip, kesilmiş bir 200 µL tarafından tutulan bir naylon mesh oluşur. Sıvı herhangi bir doku kaybı olmadan güvenli bir şekilde kaldırabilirsiniz. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Şekil 5. Tyramide sinyal amplifikasyon. (1) KAZMAK etiketli antianlamlı RNA sonda ile endojen duyu-RNA hybridizes. (2) kazı-UTP arasındaki birincil antikor biotin Birleşik IMMUNO-akrabalık bağı. (3) HRP streptavidin bağlar biotin Birleşik. (4) HRP kısa ömürlü siyanür 3-tyramide radikallerin oluşturmak için siyanür 3-tyramide ve hidrojen peroksit tepki tromboksan. (5) siyanür 3-tyramide radikallerin tirozin kalıntıları yakın proteinler olarak bağlayın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Şekil 6. Temsilcisi in situ hibridizasyon görüntüler. Her panel (camgöbeği içinde gösterilmiştir) farklı bir RNA ve hücre çekirdeği DAPI (kırmızı ile gösterilen) ile lekeli örneği gösterir. (A-C) Erken Drosophila embriyo örnekleri. (D, F) Geç Drosophila embriyo örnekleri. (G-J) 3 örnekleri biçim Drosophila larva dokuları (malphigian tübüllerin, midgut, Tükürük bezi ve kas sırasıyla). (K) Yetişkin yumurtalık. (L) Yetişkin testis. Her panel için sonda hybridizing gen adını görüntüler. Ölçek çubukları 10 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Bu prosedürün genel amacı, hücreler ve dokular içerisindeki RNA transkriptlerini yerinde tespit etmektir. Bu yöntem, bir RNA'nın bir hücrenin, dokunun veya embriyonun neresinde yer aldığı gibi hücre ve gelişim biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diğer yöntemlere kıyasla düşük maliyetle, hem yüksek çözünürlük ve hassasiyetle hem de yüksek düzeyde RNA uzaysal dağılımlarını tespit edebilmesidir.Bu protokolü başlangıçta, mümkün olduğunca çok Drosophila RNA'sının hücre içi dağılımlarını incelemek amacıyla geliştirdik. Bunun amacı, hücre içi dağılımların kapsamını ve çeşitliliğini belirlemekti. Projeye embriyolarla çalışarak başladık, ancak daha sonra protokolü, larva ve sineklerden diseke edilen dokularla yüksek verimli çalışabilmek için uyarlayıp optimize ettik.Prosedürün en zor kısmı, adım sayısının fazlalığı ve buna bağlı olarak ortaya çıkan hata potansiyelinin yanı sıra prob üretimi sırasında RNA'ların bulunmadığından emin olma gerekliliğidir. İşlem kapasitesini ve maliyet etkinliğini artırmak için, bu videoda gösterilen prosedürlerde tüm adımlar için 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plakaları kullanılmaktadır. Ayrıca plakaları sekizli veya 12'li şeritler halinde keserek bu yöntemi daha küçük örnek sayılarına uyarlamak da kolaydır.İşleme, yeni bir 96 kuyucuklu PCR plakasının her bir kuyucuğuna 10 µL gecelik bakteri kültürünü 90 µL otoklavlanmış çift distile su ile seyrelterek başlayın. DNA'yı bir termosiklet cihazında 95 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin. Plakayı derhal en az beş dakika süreyle buz üzerine yerleştirin.PCR reaksiyonlarını yeni bir 96 kuyucuklu PCR plakasına hazırlayın. Uygun evrensel primerleri kullanın ve her kuyucuğa 48 µL PCR master mix ekleyin. Her kuyucuğa iki µL denatüre plazmid DNA kalıbı ekleyin.Amplifikasyonu 96 kuyucuklu bir PCR cihazında gerçekleştirin. Amplifikasyon tamamlandığında, PCR ürününü etanol sodyum asetat karışımı ile çöktürün. Örnekleri minus 80 degrees Celsius sıcaklıkta 30 dakika boyunca saklayın.96 kuyucuklu plakayı 4 °C'de 2.250 ×g'de 45 ila 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Peletleri emerken uçların kuyucukların dibine değmesini önleyen bir yapıya sahip sekiz kanallı vakum manifolt pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Soğuk %70 etanolin 160 µL'si ile bir kez yıkayın.4 °C'de 2.250 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Her kuyucuktaki son sıvı damlacıklarını uzaklaştırmak için 96 kuyucuklu plakayı bir kağıt havlu üzerine nazikçe ters çevirin ve DNA peletlerini oda sıcaklığında bir saat boyunca havada kurumaya bırakın. Çöktürülmüş DNA'yı 25 µL RNase-free su içerisinde yeniden süspande edin.PCR ürünlerinin boyutunu ve verimini agaroz jel elektroforezi ile kontrol edin. Yeni bir 96 kuyucuklu PCR plakasındaki her bir kuyucuğa uygun bileşenleri ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını hazırlayın. Her bir ilgili kuyucuğa 7,5 microliters DNA kalıbı ekleyin.Plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatın. Plakayı 37 °C'de 3,5 ila 4 saat inkübe edin. Ardından, her bir kuyucuğa DEPC ile işlem görmüş çift distile su, %100 etanol ve 3 molar sodyum asetat içeren bir master mix ekleyin.-80 °C'de 30 dakika boyunca saklayın. Plakayı santrifüjleyin ve kuyucukları daha önce gösterildiği gibi yıkayın. Çöken probu 25 µL DEPC işleminden geçirilmiş çift distile su içerisinde yeniden süspande edin.Yeni sentezlenen antisense RNA problarının bütünlüğü ve verimi, %1'lik agaroz jel üzerinde kontrol edildi. Bandın yoğunluğuna bağlı olarak verim; düşük verim, tipik verim veya yüksek verim olarak tanımlanabilir. Her bir probun beş µL'si agaroz jel elektroforezi için kullanıldıktan sonra, kalan 20 µL, 100 µL hibridizasyon çözeltisi ile karıştırın ve ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.Bu prosedüre başlamak için, 20 ila 30 larvayı fix one çözeltisi içeren soğuk PBS'li bir Petri kabına yerleştirin ve larval motilitesini azaltmak için iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Larvaları diseksiyon mikroskobu altında diseke edin. Bir çift keskin pens kullanarak ön kısmı dikkatlice açın ve dokuları posteriordan anteriore doğru sıkın.Maksimum 15 dakika sonra, diseke edilen dokuları fikse etmek için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve buza yerleştirin. PBS'yi uzaklaştırın ve 800 mikrolitre fix one solüsyonu ekleyin. Daha önce toplanmış ve fikse edilen diğer dokularla birlikte bir tezgah üstü karıştırıcıda 30 dakika inkübe edin.Dokuları bir kez 800 µL PBTT ile durulayın ve diğer dokular toplanıp fikse edilirken tüpü buz üzerinde tutun. Diseke edilen tüm dokuları, kapak kısmında süzgeç bulunan tek bir 15 mL plastik tüpte birleştirin. Kapaktaki süzgeç aracılığıyla fazla sıvıyı aspire edin.10 mililitre PBTT ile yıkayın ve 10 mililitre PBS ile durulayın. Endojen yaban turbu peroksidaz aktivitesini söndürmek için PBS içinde %0,3 hidrojen peroksitten beş mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 10 mililitre PBTT ile iki kez yıkayın.10 mililitre önceden soğutulmuş %80 aseton ekleyerek ve -20 °C'de 10 dakika inkübe ederek dokuları permeabilize edin. Dokuları yeniden hidrate etmek için 10 mililitre PBTT ile iki kez yıkayın. Dokuları metin protokolünde açıklandığı gibi yıkadıktan sonra, hibridizasyon çözeltisi içinde -20 °C'de saklayın.Ertesi güne kadar kullanılmayacaksa, filtre düzeneği standart bir kapakla değiştirilmelidir. Buz üzerinde, 96 kuyucuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına yaklaşık 20 µL doku alikotu ekleyin. Sekiz kanallı manifold pipet kullanarak, dokuların üzerinden hibridizasyon solüsyonunu uzaklaştırın.Her kuyuya 100 µL taze denatüre edilmiş hibridizasyon solüsyonu ekleyin ve sızdırmazlık bandı ile kapatın. Dokuları, metal boncuklar içeren bir kuru banyo ısıtma ünitesi kullanarak 56 °C'de en az 2,5 ila 3 saat ön hibridizasyona tabi tutun. Hazırlanan probdan 100 µL'yi, 96 kuyucuklu bir PCR plakasında 80 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin.Hemen buz üzerinde beş dakika boyunca soğutun. Ön hibritleme solüsyonunu dokulardan uzaklaştırın ve her örneğe denatüre edilmiş gene özgü problar ekleyin. Alüminyum sızdırmazlık bandı ile kapatın ve kuru banyo ısıtma ünitesinde metal boncuklar altında 56 °C'de, gece boyunca 16 ila 18 saat hibritleyin.Prob tespit prosedürüne başlamadan önce, gerekli tüm çözeltileri 56 derece Celsius ısıtma ünitesinde ön ısıtmaya tabi tutun. Hibritize edilmiş dokuları, çok kuyucuklu plaka vakum manifolduna uygun bir 96 kuyucuklu plakaya dikkatlice aktarın. Bu plakaların kuyucukları, içeriklerin vakum altında uzaklaştırılmasına olanak tanıyan membran tabanlara sahiptir.Probları 96 kuyucuklu plakadan çıkarın ve örnekleri, 56 °C'lik ısıtma ünitesinde, bu tabloda belirtilen adımlara göre hibridizasyon çözeltisi ve PBTT karışımları ile yıkayın. PBTT ile yapılan üçüncü yıkamadan sonra 96 kuyucuklu plakayı ısıtma ünitesinden çıkarın, PBTT çözeltisini uzaklaştırın ve dokuları oda sıcaklığında, bir tezgah üstü karıştırıcıda 20 dakika boyunca PBTTB ile bloklayın. Kuyucuk başına 100 µL antikor çözeltisi ekleyin ve tezgah üstü örnek karıştırıcıda iki saat boyunca inkübe edin.Metin protokolünde açıklandığı gibi PBTTB ile duruladıktan sonra, kuyuk başına 100 microliters Streptavidin horse radish peroxidase çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1-1/2 saat inkübe edin. Her biri beş dakika sürecek şekilde PBTTB ile iki kez yıkayın. Bundan sonra, dokuları metin protokolünde açıklandığı gibi DAPI çözeltisi ile inkübe edin.Bu prosedüre, numuneleri Tyramide çözeltisi ile inkübe ederek başlayın ve numuneleri karanlıkta, tezgah üstü karıştırıcıda iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında Tyramide çözeltisini dokulardan uzaklaştırın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde PBT ve PBS ile yıkama işlemini yaptıktan sonra, kuyucuk başına 150 µL solma önleyici (antifade) montaj medyumu ekleyin.Dokuların kuyucuğun veya tüpün dibine çökmesini sağlamak için örnekleri gece boyunca dört derece Celsius'ta bekletin. Ertesi gün, örnekleri bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve bir lameliyle kapatın. Son olarak, örneklerin görüntülerini bir floresan mikroskop kullanarak alın.Şekilde, erken evre Drosophila embriyoları ve amnioserosa, kaslar ve merkezi sinir sisteminde sinyallere sahip geç evre Drosophila embriyoları için bu prosedür kullanılarak elde edilen sonuç örnekleri gösterilmektedir. Probun hibridize olduğu genin adı her panelde belirtilmiştir. Devamında ise üçüncü instar larva dokuları, malpighi tübülleri, orta bağırsak, tükürük bezi ve kastan örnekler yer almaktadır.Son olarak, yetişkin over ve yetişkin testislerden alınan temsilci görüntüler gösterilmiştir. Uzmanlaşıldığında ve verimli bir şekilde uygulandığında, bu teknik iki gün gibi kısa bir sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, RNaz'dan arındırılmış bir tezgahta, RNaz'dan arındırılmış uçlar, tüpler, plakalar ve solüsyonlar kullanarak çalışmanın ve eldiven takmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.Çok sayıda örnek veya prob ile çalışıyorsanız, prosedürü aceleye getirmeyin. Ayrıca, hangi aşamada olduğunuzu unutmamak için bazı yöntemler geliştirmeniz iyi bir fikir olacaktır. Bu prosedürü uygularken, birden fazla probun, proteinlerle veya hücresel belirteçlerle birlikte olan probların tespit edilmesi gibi diğer yöntemlerle de birleştirebilirsiniz.Bunlarla beraber, göreceli ekspresyon modelleri, hücre ve hücre altı kompartıman kimlikleri ile farklı genetik arka planlar veya hastalıklar üzerindeki etkiler gibi ek soruları yanıtlayabilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir doku veya embriyo tipinde çoğu in situ hibridizasyon türünün nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Formaldehit, hidrojen peroksit ve formamid gibi reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve prosedürü gerçekleştirirken uygun taşıma ve bertaraf gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva optik loblarında hibritizasyon zincir reaksiyon floresan in situ hibridizasyonu (HCR-FISH) gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Prob tasarımı, hibritleşme, amplifikasyon ve doku montajı prosedürleri, gelişmekte olan optik lobun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı olarak hazırlanmıştır.

Gelişen Drosophila optik lobunda hibridizasyon zincirleme reaksiyonu FISH

Öğrenin Drosophila embriyo ve dokularında yüksek çözünürlüklü RNA in situ hibridizasyon yöntemini. Tiramid sinyal güçlendirme ve 96-kuyucuklu plakalar kullanarak maliyet etkin, yüksek duyarlılıklı analiz yapın.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Daha fazla video keşfet